超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)白酒中8種人工甜味劑

尹艷艷，熊曉通，田棟偉，劉 明，陳明學(xué)，張 健，程平言

（貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司,貴州遵義 564622）

民以食為天，食以安為先。食品的安全和健康已成為消費(fèi)者關(guān)心的重點(diǎn)。食品中各種添加劑的使用情況越來(lái)越受到人們的關(guān)注，其中，甜味劑是食品行業(yè)中常用的添加劑。在白酒中添加甜味劑可掩蓋酒體苦澀等不良口感的缺陷，增加醇厚感和綿甜感[1]。然而，研究表明攝入高劑量的甜味劑會(huì)對(duì)人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害，甚至引發(fā)癌癥[2-3]。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，固態(tài)發(fā)酵白酒中不得添加甜味劑[4]。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的甜味劑檢測(cè)方法對(duì)于提高產(chǎn)品的質(zhì)量和保障消費(fèi)者的飲酒安全具有重要意義。

目前已建立了食品中甜味劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[5-11]，但該方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)，且預(yù)處理過(guò)程較為繁瑣。高效液相色譜法[12-14]、離子色譜法[15]、毛細(xì)管電色譜[16]等現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)已被用于白酒甜味劑的分析檢測(cè)。但這些方法因檢出限不能滿足檢測(cè)要求、易出現(xiàn)假陽(yáng)性等問(wèn)題而不能滿足白酒中甜味劑的同時(shí)檢測(cè)要求。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于具有分離速度快、檢測(cè)靈敏度高、用樣量少、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，且可以彌補(bǔ)其他分析方法不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)的不足，被廣泛應(yīng)用于白酒分析檢測(cè)領(lǐng)域[17-19]。此外，超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物和非目標(biāo)化合物具有良好的定性/定量分析篩選能力，對(duì)假陽(yáng)性結(jié)果可進(jìn)行進(jìn)一步確證，通過(guò)單針進(jìn)樣分析可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中成百上千種痕量組分進(jìn)行鑒定、定性和定量，大大簡(jiǎn)化了復(fù)雜樣品的殘留分析，提高檢測(cè)效率[20-21]。本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)白酒中8種人工甜味劑的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)方法，可應(yīng)用于白酒中多種甜味劑含量的監(jiān)控，為白酒安全監(jiān)管和質(zhì)量評(píng)定提供簡(jiǎn)便快速、科學(xué)準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Q ExactiveFocus 高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Themo-Fisher Scientific 公司）；UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex 公司）；分析天平（0.0001 g，美國(guó)OHAUS 公司）；BPG 型精密鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；渦旋振蕩器（上海琪特分析儀器有限公司）；艾科普超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm；美國(guó)ThemoFisher Scientific公司)。

甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、甜菊糖苷、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜以及阿力甜標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99%）購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸胺（色譜純）購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水為艾科普純水儀制備的超純水（18.2 MΩ·cm-2），白酒樣品為貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司成品酒以及市購(gòu)白酒。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取（精確至0.0001 g）適量甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、甜菊糖苷、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜以及阿力甜標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，少量超純水溶解，乙腈定容，再用超純水配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/L、30.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L、300.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

本方法采用烘箱干燥法除去白酒中高含量的乙醇，減少對(duì)待測(cè)物檢測(cè)的影響[19]。具體操作：取1 mL 酒樣于1.5 mL 的離心管，置于干燥箱（80 ℃）中去除乙醇，保留0.5 mL余量，超純水定容至1 mL，0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：A 相為5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 相為乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離（HESI）負(fù)離子模式；噴霧電壓：2.5 kV；鞘氣：35 psi；輔助氣：10 arb；離子源加熱溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃；掃描模式：Full Mass，掃描范圍：100 m/z～1000 m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1 液相色譜的條件優(yōu)化

以乙腈-乙酸銨的水溶液作為流動(dòng)相，考察了SyncronisHilic（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）液相色譜柱、Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）液相色譜柱以及Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm,1.9 μm）對(duì)8種人工甜味劑分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1、圖2）顯示，8 種人工甜味劑在Syncronis Hilic 色譜柱保留較差，故易受基質(zhì)干擾，峰形較差；安賽蜜在Accucore aQ 色譜柱出現(xiàn)前出小峰，且甜蜜素、糖精鈉在Accucore aQ 色譜柱保留時(shí)間較短。進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化進(jìn)樣量（5 μL、10 μL、15 μL）、流動(dòng)相乙酸銨的濃度（0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、7.5 mmol/L、10.0 mmol/L、）以及柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）也未能解決Syncronis Hilic 色譜柱和Accucore aQ 色譜柱保留時(shí)間短和峰型差的問(wèn)題。根據(jù)圖3，8 種人工甜味劑在Hypersil GOLD 色譜柱分離效果較好，峰型對(duì)稱。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Full Mass 掃描模式以母離子精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量，易造成假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。Full MS/dd-MS2 掃描模式以母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)定性，母離子定量，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物定性篩查及定量檢測(cè)[22-23]。因此，本研究采用Full MS/dd-MS2掃描模式對(duì)母離子進(jìn)行定性，并優(yōu)化了不同目標(biāo)物的碰撞電壓，進(jìn)一步用目標(biāo)物的碎片離子進(jìn)行確認(rèn)，排除假陽(yáng)性的結(jié)果，設(shè)置條件見(jiàn)表2。最終選擇Full MS 掃描模式以母離子精確質(zhì)量數(shù)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測(cè)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

以目標(biāo)物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，8 種人工甜味劑線性良好。以定量離子信噪比S/N=3 對(duì)應(yīng)的濃度為樣品的檢出限（LOD），S/N=10 為樣品的定量限（LOQ），具體結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

圖1 采用SyncronisHilic色譜柱8種人工甜味劑提取離子色譜圖

圖2 采用Accucore aQ色譜柱8種人工甜味劑提取離子色譜圖

圖3 采用Hypersil GOLD色譜柱8種人工甜味劑提取離子色譜圖

通過(guò)實(shí)際樣品加標(biāo)回收率考察了該方法的準(zhǔn)確度。白酒樣品中加入適量甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成加標(biāo)濃度分別為50 μg/L 和100 μg/L 的加標(biāo)樣品進(jìn)行分析。加標(biāo)樣品設(shè)置5 個(gè)平行樣，連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定5次，并計(jì)算其平均加標(biāo)回收率以及日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察該方法的準(zhǔn)確度與精密度。表4結(jié)果顯示，8種人工甜味劑在白酒樣品中的加標(biāo)回收率在89.8%～108.3%之間，RSD均小于4.5%。該方法的準(zhǔn)確度與精密度均滿足白酒樣品中甜味劑的分析要求。

2.2.3 實(shí)際樣品分析

表2 8種人工甜味劑質(zhì)譜分析參數(shù)

表3 8種人工甜味劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表4 白酒樣品中8種人工甜味劑的加標(biāo)回收率、日內(nèi)和日間的精密度

表5 市售白酒中8種人工甜味劑檢測(cè)結(jié)果

利用本方法對(duì)從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的8個(gè)不同香型白酒樣品進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，有1款白酒檢出少量甜蜜素、甜菊糖苷、三氯蔗糖。

3 結(jié)論

本研究建立了白酒中8種人工甜味劑的高分辨液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。前處理簡(jiǎn)單，只需將白酒樣品中的乙醇去除，便可進(jìn)樣檢測(cè)。該方法具有較寬的線性范圍、較低的檢出限、良好的穩(wěn)定性，為白酒生產(chǎn)企業(yè)和食品監(jiān)管部門(mén)對(duì)酒樣的檢測(cè)提供了新方法。