丹參素對(duì)IUGR胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞及腦組織Rho/ROCK信號(hào)通路的影響

趙怡然 付洪濤 趙楠楠

摘要 目的：探討丹參素對(duì)IUGR胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞及腦組織Rho/ROCK信號(hào)通路的影響。方法：將40只孕鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、IUGR組、IUGR+低劑量、中劑量、高劑量丹參素組，予以低蛋白飲食法建立IUGR模型，正常組、IUGR組于妊娠第12天尾靜脈注射等體積生理鹽水5.0 mg/（kg·d），丹參素低、中、高劑量組分別于妊娠第12天起尾靜脈注射等體積不同濃度丹參素溶液，低劑量組10 μg/（kg·d），中劑量組20 μg/（kg·d），高劑量組30 μg/（kg·d），于自然分娩后6 h內(nèi)測(cè)定胎鼠體質(zhì)量，麻醉處死后行腦組織HE染色，選擇RT-PCR、Western blot法對(duì)RhoA、ROCKⅡmRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：IUGR組胎鼠體質(zhì)量明顯低于正常組，IUGR+丹參素高劑量組胎鼠體質(zhì)量高于中劑量組、低劑量組（P<0.05）。IUGR組RhoA、ROCKⅡ mRNA、蛋白表達(dá)及腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均高于正常組，而IUGR+丹參素高劑量組低于中劑量組、低劑量組（P<0.05）。結(jié)論：丹參素可調(diào)控Rho/ROCK信號(hào)通路并抑制其活性，以促進(jìn)IUGR胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞增殖，改善其生長(zhǎng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞 丹參素;宮內(nèi)生長(zhǎng)受限;神經(jīng)干細(xì)胞;Ras同源基因A;Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶Ⅱ

Abstract Objective：To explore the effects of tanshinolon on Rho/ROCK signaling pathway in brain nerve cells and brain tissues of IUGR fetal rats. Methods：A total of 40 pregnant rats were randomly divided into a normal group， a IUGR group， a IUGR+ low-dose， a medium-dose and a high-dose tanshinol group. The IUGR model was established by low-protein diet. Normal group and IUGR group were injected with 5.0 mg/kg saline intravenously on the 12th day of pregnancy. Low， medium and high dose groups of tanshinolon were injected with tanshinol solution with equal volume and different concentration intravenously from the 12th day of pregnancy， respectively， with low dose group 10 μ g/（kg·d）， medium dose group 20 μ g/（kg·d） and high dose group 30 μ g/（kg·d）. The weight of fetal rats was measured within 6 h after natural delivery. After anesthesia， the brain tissue was stained with HE. The expressions of RhoA and ROCKⅡmRNA and protein were determined by RT-PCR and Western blot， and the apoptosis rate of brain nerve cells was detected by flow cytometry. Results：The body weight of fetal rats in IUGR group was significantly lower than that in normal group. The body weight of fetal rats in IUGR+tanshinolhigh-dose group was higher than that in medium dose group and low-dose group （P<0.05）. The expression of RhoA， rock Ⅱ mRNA， protein and apoptosis rate of brain nerve cells in IUGR group were higher than those in normal group， while those in IUGR+tanshinol high-dose group were lower than those in middle dose group and low-dose group （P<0.05）. Conclusion：Tanshinol can regulate Rho/ROCK signaling pathway and inhibit its activity， so as to promote the proliferation and improve the growth and development of IUGR fetal rat brain cells.

Keywords Tanshinol; Intrauterine growth restriction; Neural stem cells; Ras homologous gene A; Rho related helix protein kinase Ⅱ

中圖分類號(hào)：R363;R285.5;R322.85;R714.43+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.007

胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限（Intrauterine Growth Restriction，IUGR）由母體、胎盤和胎兒等多種病理因素導(dǎo)致，致使胎兒在宮內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育受限，生長(zhǎng)潛能下降，胎兒出生后體質(zhì)量明顯低于正常胎兒，IUGR增加了圍生期患病率的同時(shí)提升其病死率[1-2]。還會(huì)影響胎兒遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，出現(xiàn)神經(jīng)行為學(xué)后遺癥，常見如：運(yùn)動(dòng)障礙、行為異常等，同時(shí)降低胎兒學(xué)習(xí)能力降低、注意力集中能力[3]。研究IUGR患兒的腦損傷病理機(jī)制對(duì)其防治至關(guān)重要，以往研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子激活Ras同源基因（Ras Homolog Gene Family Member，Rho）蛋白，造成膜轉(zhuǎn)位-激活效應(yīng)分子，Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated Coiled-coil Forming Protein Kinase，ROCK）磷酸化，重排神經(jīng)細(xì)胞骨架-生長(zhǎng)錐塌陷及回縮-軸突停止生長(zhǎng)，樹突、軸突再生能力很弱，Rho/ROCK信號(hào)通路活化阻斷中樞神經(jīng)損傷后的再生[4-5]。而丹參是近年來臨床上常用的活血化瘀中藥，在心腦血管疾病的治療中應(yīng)用較廣，其有效水溶性成分之一丹參素，對(duì)缺氧缺血性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]。但丹參素對(duì)IUGR胎鼠是否具有保護(hù)作用，其機(jī)制如何，尚不清楚。因此，研究丹參素對(duì)IUGR胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞及腦組織Rho/ROCK信號(hào)通路的影響，對(duì)產(chǎn)前促進(jìn)IUGR胎兒生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠20只，雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司購入，許可證號(hào)SCXK（遼）2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：18～20 ℃，濕度60% ～70%，明暗各12 h，自由飲水、攝食。

1.1.2 藥物 丹參素（Danshensu，HPLC>98%，上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)：76822-21-4）。

1.1.3 試劑與儀器 兔抗ROCKII多克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)，批號(hào)：ab71598）、兔抗RhoA單克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)，批號(hào)：ab40673），RIPA蛋白裂解液（索萊寶公司，批號(hào)：20160307），Trizol試劑（simgen杭州，貨號(hào)：5301100），RNA提取試劑盒（天漠生物，貨號(hào)：TR205-50），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（BIOMIGA，美國(guó)，貨號(hào)：RT0213-01），Real-timePCR擴(kuò)增儀（AppliedBiosystems公司產(chǎn)品，美國(guó)，型號(hào)：7500），病理切片機(jī)（徠卡公司，德國(guó)，型號(hào)：RM2235），臺(tái)式冰凍離心機(jī)（BECKMAN公司，美國(guó)，型號(hào)：GS-15R），NIKON顯微鏡及成像系統(tǒng)（尼康公司，日本，型號(hào)：NIKON TE2000-U）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分組與模型制備：運(yùn)用低蛋白飲食法[8]建立模型，標(biāo)準(zhǔn)飼料、低蛋白飼料購于北京華阜康生物科技股份有限公司。將2只雌鼠與1只雄鼠合籠，次日早晨取陰道分泌物予以鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子視為妊娠第1天，選擇隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)40只雌性孕鼠進(jìn)行分組，即正常組、IUGR組、IUGR+低劑量丹參素組、IUGR+中劑量丹參素組、IUGR+高劑量丹參素組，共5組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 正常組、模型組于妊娠第12天尾靜脈注射等體積生理鹽水5.0 mg/（kg·d），丹參素低、中、高劑量組分別于妊娠第12天起尾靜脈注射等體積不同濃度丹參素溶液，低劑量組10 μg/（kg·d），中劑量組20 μg/（kg·d），高劑量組30 μg/（kg·d）直至自然分娩。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 動(dòng)物取材 5組孕鼠在自然分娩后的6 h內(nèi)對(duì)胎鼠體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，出現(xiàn)體質(zhì)量低于正常組平均體質(zhì)量減2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差胎鼠則表示IUGR模型建立成功。測(cè)定完成后予以麻醉并迅速處死，隨機(jī)每窩取1只，取其腦組織固定于4%多聚甲醛中。

1.2.3.1 HE染色 將4%多聚甲醛固定的腦組織取出，予以脫水、包埋、切片等步驟后行HE染色，用蘇木素-伊紅進(jìn)行染色（HE染色），于光學(xué)顯微鏡下，對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)改變情況進(jìn)行觀察。

1.2.3.2 RT-PCR檢測(cè)各組胎鼠腦組織RhoA、ROCKⅡ的表達(dá) 取右腦組織置于1 mL EP管內(nèi)，在-80 ℃條件下保存，總RNA運(yùn)用Trizol法提取，提取完成后取2 μg RNA開始逆轉(zhuǎn)錄，引物序列：GAPDH上游5′-GACCACTTTGTCAAGCTCTATTTCC-3′，下游5′-GTGAGGGTCTCTCTTCCTCTTGT-3′，引物長(zhǎng)度323 bp;RhoA上游5′-GCAGGTAGAGTTGGCTTTATGG-3′，下游5′-GTGGCATCTACTGCACTCTA-3′，引物長(zhǎng)度231 bp;ROCKⅡ上游5′-GCAGGTAGAGTFGGCTTTATGG-3′，下游5′-GTGGCATCTACTGCACTCTA-3′，引物長(zhǎng)度275 bp，逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增，條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)，最后完成72 ℃總延伸5 min，5組各取5 μL PCR產(chǎn)物電泳，凝膠成像儀獲取圖像，實(shí)驗(yàn)次數(shù)至少3次，2-△△CT對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析。

1.2.3.3 Westernblot法檢測(cè)各組胎鼠腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá) 取各組50～100 mg腦組織，加入蛋白裂解液后對(duì)總蛋白進(jìn)行提取，先予以SDS聚丙烯凝膠電泳，后移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），一抗、二抗孵育后，運(yùn)用發(fā)光底物做顯影處理，處理圖像，RhoA、ROCKⅡ蛋白目的條帶定量并定性。

1.2.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 取腦組織加入裂解液，制備細(xì)胞懸液，離心5 min，將細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)至1×106細(xì)胞/mL，并在6塊6孔板中接種，每孔1 mL，各組做3個(gè)平行，細(xì)胞貼壁后予以試驗(yàn)，先吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加400 μL試驗(yàn)藥液，12 h、24 h、48 h后分別上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUGR胎鼠模型 正常組分娩胎鼠52只，體質(zhì)量（6.10±0.35）g，IUGR組55只，體質(zhì)量（4.26±0.33）g，IUGR+丹參素低劑量組56只，體質(zhì)量（4.95±0.31）g，IUGR+丹參素中劑量組55只，體質(zhì)量（5.21±0.32）g，高劑量組54只，體質(zhì)量（5.90±0.35）g，IUGR組胎鼠體質(zhì)量明顯低于正常組，丹參素高劑量組胎鼠體質(zhì)量高于中劑量組、低劑量組（P<0.05）。

2.2 HE染色 IUGR組、IUGR+丹參素低劑量組、IUGR+中劑量組部分仔鼠均出現(xiàn)不同程度腦皮層變薄、腦組織水腫，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。丹參素高劑量組腦組織形態(tài)病理改變程度輕于IUGR組、IUGR+丹參素低劑量組、IUGR+中劑量組，除正常組，其余各組均可見明顯神經(jīng)細(xì)胞核深染、固縮、細(xì)胞體積縮小，符合凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。見圖1。

2.3 RT-PCR檢測(cè)各組胎鼠腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA的表達(dá) IUGR組胎鼠腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA明顯高于正常組，丹參素高劑量組胎鼠RhoA、ROCKⅡ mRNA低于中劑量組、低劑量組（P<0.05）。見表1。

2.4 Westernblot法檢測(cè)各組胎鼠腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá) IUGR組胎鼠腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)明顯高于正常組，IUGR+丹參素高劑量組胎鼠RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)低于中劑量組、低劑量組（P<0.05）。見圖2。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 ?IUGR組胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，IUGR+丹參素高劑量組胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于中劑量組、低劑量組（P<0.05）。見表2。

3 討論

胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限是圍產(chǎn)期胎兒死亡的主要原因之一，與母體及宮內(nèi)環(huán)境等多種因素關(guān)聯(lián)密切，同時(shí)IUGR可由圍生期窒息，低體溫，低血糖等疾病引起，且對(duì)遠(yuǎn)期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響[9-10]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，機(jī)械能刺激、細(xì)胞因子及多種致炎物質(zhì)與細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體共同作用，使Rho/ROCK活化，Rho/ROCK激活后，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的收縮，增大細(xì)胞間距與血管通透性，組織間隙中滲入大量液體，發(fā)生腦水腫，另一方面，會(huì)造成血管平滑肌細(xì)胞的舒張功能障礙，加劇損傷區(qū)周邊腦血管的收縮，供血不足，鄰近腦組織出現(xiàn)繼發(fā)性損傷，如：腦水腫、缺血、缺氧等，并發(fā)顱內(nèi)壓升高、腦疝等直至死亡[11]。丹參素（Tanshinol，TSN）可從植物丹參中提取，屬于一種水溶性成分，可促進(jìn)微循環(huán)血流，抗凝血和抗血小板聚集，在清除氧自由基，保護(hù)線粒體，改善腦損傷方面效果明顯[12]。

近年來，中醫(yī)藥對(duì)于胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限治療關(guān)注度較高，且獲得了較大進(jìn)展[13]?；诖?，建立IUGR模型孕期予以丹參素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)IUGR組胎鼠體質(zhì)量明顯低于正常組，IUGR+丹參素高劑量組胎鼠體質(zhì)量高于中劑量組、低劑量組，丹參素低、中劑量組胎鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示IUGR胎鼠出生后體質(zhì)量顯著降低，而高劑量丹參素對(duì)IUGR胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育有明顯改善作用。以往研究證實(shí)，低蛋白飲食法建立IUGR后，胎鼠對(duì)氧及營(yíng)養(yǎng)的攝取能力顯著減弱，使胎盤中有關(guān)糖原的酵解酶活性下降，葡萄糖利用率降低，出現(xiàn)慢性葡萄糖供應(yīng)不足現(xiàn)象，致使胎鼠宮內(nèi)生長(zhǎng)受限[14]。

IUGR患兒往往出生后即出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)方面的損害，包括：神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能、行為異常等，且影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的因素較多，其調(diào)節(jié)機(jī)制也較為復(fù)雜，對(duì)Rho/ROCK信號(hào)進(jìn)行研究后，證實(shí)其屬于調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵信號(hào)通路[15]。通過RT-PCR、Western blot法檢測(cè)RhoA、ROCKⅡmRNA及蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，IUGR組RhoA、ROCKⅡ mRNA、蛋白表達(dá)、腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均高于正常組，而丹參素高劑量組RhoA、ROCKⅡ mRNA、蛋白表達(dá)、腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于中、低劑量組，同劉方等[16]研究結(jié)果中，抑制Rho/ROCK信號(hào)通路可促進(jìn)胎鼠神經(jīng)元細(xì)胞增殖結(jié)果相符。沈楊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，丹參素改善子癇前期模型胎鼠腦發(fā)育障礙效果顯著，高劑量丹參素對(duì)生長(zhǎng)受限胎鼠的總體改善更為有效。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，多種外界信號(hào)刺激下，Rho/ROCK信號(hào)通路異常活化，將信號(hào)傳遞給下游效應(yīng)分子，下游效應(yīng)分子ROCKⅡ可直接與Rho激酶的底物-球蛋白輕鏈磷酸化酶產(chǎn)生結(jié)合現(xiàn)象，經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)激酶反應(yīng)后對(duì)肌動(dòng)-球蛋白系統(tǒng)進(jìn)行干擾，從而致使生長(zhǎng)錐出現(xiàn)塌陷，神經(jīng)軸突生長(zhǎng)受到抑制，腦細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、功能出現(xiàn)障礙，鈣超載、自由基過量生成出現(xiàn)一系列惡性循環(huán)，造成缺血、缺氧性腦損傷[18-19]。而應(yīng)用丹參素后，抑制腦組織損傷后NO的過量產(chǎn)生，抑制其與超氧陰離子的反應(yīng)，降低羥基和NO2-生成，羥基是引起腦損傷最主要的物質(zhì)，NO2-屬于脂質(zhì)過氧化的有力激動(dòng)劑，促進(jìn)腦組織損傷加重，丹參素打斷一系列惡性循環(huán)，發(fā)揮腦保護(hù)作用，Rho/ROCK信號(hào)通路活性明顯降低[20]。說明丹參素可通過調(diào)控Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)IUGR腦神經(jīng)發(fā)育起改善作用，故而丹參素對(duì)于生長(zhǎng)受限所致的發(fā)育障礙有著極為關(guān)鍵的修復(fù)作用。綜上所述，孕期應(yīng)用丹參素治療，能明顯減少胎鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過抑制Rho/ROCK信號(hào)通路活性，能減輕IUGR胎兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷，從而改善其生長(zhǎng)發(fā)育。

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（2020-09-22收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）