白蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及其分子機(jī)制

白瑜，于銳，田密，何平，趙自霞，張蓓茹 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng)110004

腎小管損傷是慢性腎臟病(CKD)發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制，與患者的腎臟預(yù)后密切相關(guān)[1]，而蛋白尿?qū)е碌哪I小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是腎小管損傷的重要病理機(jī)制之一。近年研究表明，腎損傷分子1(KIM-1)不僅可以作為急慢性腎損傷的早期生物學(xué)標(biāo)志物，還參與了腎臟損傷與修復(fù)過(guò)程[2]。前期研究顯示，原發(fā)性腎小球腎炎患者腎小管間質(zhì)損傷程度及蛋白尿嚴(yán)重程度與尿KIM-1水平呈正相關(guān)關(guān)系[3]，但KIM-1在白蛋白所致腎小管間質(zhì)損傷中的病理機(jī)制尚不明確。2015年1月～2017年1月，本研究觀察了白蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響，并探討其機(jī)制是否與KIM-1有關(guān)及其可能的調(diào)控途徑?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2購(gòu)于廣州吉尼歐生物科技有限公司。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、Opti-MEM均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，青-鏈霉素溶液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、細(xì)胞膜蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)均購(gòu)于北京碧云天生物科技有限公司；人血清白蛋白(HSA)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，KIM-1和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，p38、p-p38和E鈣黏素(E-cadherin)抗體均購(gòu)于美國(guó)CST公司，p38分裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)通路特異性抑制劑SB203580購(gòu)于美國(guó)Selleck Chemicals公司。

1.2 HSA對(duì)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及KIM-1表達(dá)影響的觀察

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及HSA處理 將HK-2細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、100 U/mL青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，取3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，加入5 mg/mL HSA作用24 h。

1.2.2 HSA作用前后細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集1.2.1經(jīng)HSA作用前后的HK-2細(xì)胞，按照提取試劑盒說(shuō)明書提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒法測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜及5% BSA封閉1 h。按照抗體說(shuō)明書推薦比例對(duì)E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38和p38一抗進(jìn)行稀釋，4 ℃條件下孵育過(guò)夜；加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值計(jì)算E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 KIM-1沉默對(duì)HSA作用后HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化影響的觀察

1.3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組處理 取3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為KIM-1沉默組和空載體對(duì)照組，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染KIM-1 siRNA及對(duì)照空載體；轉(zhuǎn)染48 h后加入5 mg/mL HSA處理24 h。

1.3.2 細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1表達(dá)檢測(cè) 參照1.2.2，采用Western blotting法檢測(cè)兩組細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 KIM-1過(guò)表達(dá)對(duì)HSA作用后HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及p38 MAPK通路影響的觀察

1.4.1 KIM-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組處理 取3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組，SB203580+KIM-1組、KIM-1組均參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書轉(zhuǎn)染KIM-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒48 h，SB203580+KIM-1組給予10 μmol/L SB203580預(yù)處理1 h后再與5 mg/mL HSA共處理24 h，KIM-1組、HSA組給予5 mg/mL HSA處理24 h。

1.4.2 細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達(dá)檢測(cè) 參照1.2.2，采用Western blotting法檢測(cè)三組細(xì)胞KIM-1、E-cadherin、α-SMA、p-p38、p38蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HSA作用前后HK-2細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達(dá)比較 與HSA作用前比較，HSA作用后HK-2細(xì)胞E-cadherin表達(dá)降低，α-SMA、KIM-1、p-p38表達(dá)均升高(P均<0.05)，p38表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 HSA作用前后HK-2細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達(dá)比較

2.2 KIM-1沉默組和空載體對(duì)照組E-cadherin、α-SMA、KIM-1表達(dá)比較 與空載體對(duì)照組比較，KIM-1沉默組E-cadherin表達(dá)升高，α-SMA、KIM-1表達(dá)均降低(P均<0.05)。見表2。

表2 KIM-1沉默組和空載體對(duì)照組E-cadherin、α-SMA、KIM-1蛋白表達(dá)比較

2.3 SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達(dá)比較 KIM-1組、SB203580+KIM-1組和HSA組E-cadherin表達(dá)依次升高，α-SMA、p-p38表達(dá)均依次降低(P均<0.05)，三組p38表達(dá)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。SB203580+KIM-1組、KIM-1組KIM-1表達(dá)均高于HSA組，SB203580+KIM-1組、KIM-1組KIM-1表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3、圖1。

表3 SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38蛋白表達(dá)比較

圖1 SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組KIM-1、E-cadherin、α-SMA、p-p38、p38蛋白表達(dá)條帶圖(Western blotting法)

3 討論

白蛋白尿?qū)е碌哪I小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是造成腎小管損傷、促進(jìn)CKD進(jìn)展的重要因素[4]，探究其病理機(jī)制及干預(yù)策略也是CKD治療領(lǐng)域備受關(guān)注的方向。KIM-1是在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜蛋白，在正常腎臟組織中幾乎不表達(dá)，但是在各種急性腎損傷時(shí)腎組織KIM-1表達(dá)明顯升高。目前，KIM-1已經(jīng)成為判斷急性腎損傷的一種特異性生物標(biāo)志物[5]，能夠有效預(yù)測(cè)急性腎損傷的病情和預(yù)后，且與急性腎損傷進(jìn)展至CKD具有一定的相關(guān)性[6,7]。除了與急性腎損傷相關(guān)，KIM-1與CKD也具有一定的相關(guān)性，是CKD進(jìn)展至終末期腎臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8,9]。本研究結(jié)果顯示，HSA可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化及KIM-1蛋白表達(dá)增加。這一結(jié)果也再次證明KIM-1的升高能夠參與腎小管損傷。

KIM-1不僅僅是急性腎損傷或CKD的生物標(biāo)志物之一，其在腎臟病進(jìn)展中也具有重要的病理作用。Humphreys等[10]建立了腎小管上皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)KIM-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)即使在沒有外界任何促進(jìn)腎小管間質(zhì)損傷的因素存在下，4周后轉(zhuǎn)基因小鼠也會(huì)自發(fā)出現(xiàn)腎臟炎癥反應(yīng)和腎小管間質(zhì)纖維化，且進(jìn)行性加重；該實(shí)驗(yàn)提示KIM-1在CKD腎小管損傷中具有重要的病理作用，可能與促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)或腎小管損傷等因素有關(guān)。而在蛋白超負(fù)荷腎病大鼠模型以及在阿霉素所致伴有大量蛋白尿的腎病模型中，均可發(fā)現(xiàn)尿中KIM-1排泄增多，與尿蛋白和腎間質(zhì)損傷呈正相關(guān)關(guān)系，且KIM-1僅在炎癥、纖維化及腎小管損傷區(qū)域表達(dá)[11,12]。因此，本研究進(jìn)一步探討KIM-1是否參與了白蛋白所致的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)KIM-1沉默時(shí)伴隨著KIM-1水平降低、白蛋白所致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化程度減輕，這一結(jié)果提示在白蛋白所致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中KIM-1不僅僅是腎小管損傷的標(biāo)志物，而且在這個(gè)損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要的病理作用。

目前，KIM-1參與腎臟損傷的病理機(jī)制尚不明確。MAPK是真核生物細(xì)胞主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而p38 MAPK是其中功能最為廣泛的分支之一，在人體組織中廣泛存在，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等。有研究證實(shí)，p38 MAPK通路活化能夠加速腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[13]。Tian等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CKD組織尤其是腎小管間質(zhì)纖維化組織KIM-1表達(dá)明顯增加，而且KIM-1會(huì)通過(guò)MAPK通路而促進(jìn)腎臟局部巨噬細(xì)胞遷移及炎癥進(jìn)展。因此，本研究進(jìn)一步探討了在KIM-1促進(jìn)白蛋白所致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中是否有p38 MAPK的參與。結(jié)果顯示，HSA作用HK-2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中p38 MAPK磷酸化增強(qiáng)，而KIM-1沉默可減輕p38 MAPK的磷酸化程度、KIM-1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)p38 MAPK的磷酸化程度；p38 MAPK特異性抑制劑預(yù)處理HK-2細(xì)胞可有效抑制p38 MAPK磷酸化、減輕HK-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化程度，但并不影響KIM-1表達(dá)；這表明p38 MAPK作為下游通路，至少部分介導(dǎo)了KIM-1促進(jìn)白蛋白導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的病理過(guò)程。

綜上所述，白蛋白可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其機(jī)制可能與促進(jìn)KIM-1表達(dá)進(jìn)而激活p38 MAPK通路有關(guān)。本研究也再次證明KIM-1并不僅僅是急性或慢性腎損傷的生物標(biāo)志物，而是具有重要的病理作用，對(duì)KIM-1病理機(jī)制的探索可能為將來(lái)有效防治CKD提供有效手段。