RNA N6- 甲基腺嘌呤異常修飾影響腫瘤干細胞促進惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究進展

朱正陽 *，王 成*，姜辰一，趙福軍 ,

1. 上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科，上海200080；2. 上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學院，上海200080；3. 南京醫(yī)科大學附屬上海市第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學院泌尿外科，上海200080； 4. 新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院泌尿外科，喀什 844000

近年來，RNA表觀遺傳修飾相關調節(jié)分子及其作用機制在惡性腫瘤中的作用逐漸被認知。各類RNA修飾都能對疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生一定影響，其中RNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）異常修飾及其修飾相關分子的異常表達與白血病、乳腺癌、神經(jīng)膠質瘤等多種惡性腫瘤的發(fā)生、進展相關[1]。然而，其中的機制仍未完全闡明。在RNA m6A異常修飾促進惡性腫瘤進展、復發(fā)和治療抵抗的過程中，腫瘤干細胞可能發(fā)揮關鍵作用。

腫瘤干細胞理論的核心在于惡性腫瘤細胞具有異質性和層級結構：具有干性的惡性腫瘤細胞逐級分化生成異質性腫瘤細胞，或者分化較好的腫瘤細胞去分化為腫瘤干細胞，進而介導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。研究[3]表明腫瘤干細胞能通過調節(jié)微環(huán)境、自噬等多種機制逃避免疫監(jiān)視及避免氧化磷酸化來抵抗治療。一定比例的腫瘤干細胞還能在放射治療和化學治療中保持靜息態(tài)以降低細胞損傷，并在治療后重新進入細胞周期，導致腫瘤復發(fā)[4]。

惡性腫瘤細胞在層級分化或去分化的過程中，表觀遺傳改變及其相關調控分子的異常表達常常促進腫瘤惡化。作為RNA表觀遺傳修飾的重要形式之一，RNA m6A異常修飾是否能影響腫瘤干細胞在抗腫瘤治療中的抗性，進而引起腫瘤進展和復發(fā)？本文即以腫瘤干細胞為紐帶，綜述了相關研究進展，以探討mRNA m6A修飾與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的聯(lián)系。

1 RNA m6A修飾

表觀遺傳修飾廣泛存在于DNA、RNA中，其中RNA的表觀遺傳修飾極其豐富。近年來已發(fā)現(xiàn)N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）、N5-甲基胞嘧啶（N5-methylcytosine，m5C）、N7-甲基鳥嘌呤（N7-methylguanine，m7G）、m6A、2′-O-甲基化（2′-O-methylation，2′OME）等多種修飾[5]。m6A修飾是較常見的RNA表觀遺傳修飾形式，一般發(fā)生于高度保守的RNA區(qū)域，在mRNA的終止密碼子、3′端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）以及長外顯子處富集。

1.1 RNA m6A修飾的調控

RNA m6A修飾在人體組織內廣泛存在且高度保守。m6A修飾可逆，由甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferaselike protein 3，METTL3）、METTL14與其調控蛋白腎母細胞瘤1-相關蛋白（Wilms tumor 1-associating protein，WTAP）、病毒樣m6A甲基轉移酶相關蛋白（vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA）、RNA 結合基序蛋白 15（RNA-binding protein 15，RBM15）、 鋅 指 CCCH域 蛋 白 13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13，Zc3H13）組成的甲基轉移酶復合體催化修飾，由去甲基化酶脂肪和肥胖相關蛋白（fat mass and obesityassociated protein，F(xiàn)TO）、α- 酮戊二酸依賴型加雙氧酶同源 物 5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5，ALKBH5 ）催化去除修飾，受m6A結合蛋白YTH結構域家族蛋白1/2/3（YTH domain-containing family protein 1/2/3，YTHDF1/2/3）、胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白1/2/3（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1/2/3 ，IGF2BP1/2/3）等讀取并調節(jié)。真核細胞內RNA m6A修飾由甲基轉移酶復合體在核內完成，復合體核心由METTL3、METTL14組成，其中METTL3是催化核心，METTL14起協(xié)同、穩(wěn)定作用[6-7]。WTAP是其主要調控蛋白，能夠促進復合體合成，介導其募集[8]。VIRMA可以影響WTAP的功能，RBM15、Zc3H13能夠促進WTAP定位于特定的核內mRNA[5,9]。去甲基化酶FTO、ALKBH5均屬于Fe（Ⅱ）和α- 酮戊二酸依賴型加雙氧酶（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase，AlkB）家族，都以單鏈RNA為主要底物。FTO可以催化單鏈RNA中的m6A氧化去甲基化，ALKBH5則能夠直接將m6A轉化為腺苷，并且抑制被修飾的mRNA出核轉運、代謝，促進其加工因子聚集[10-11]。YTHDF和IGF2BP可以讀取m6A修飾，進而影響mRNA的翻譯、轉運、剪切、分解等[6,9]。

1.2 RNA m6A修飾的功能

作為RNA的主要修飾方式，多種重要生理功能的調節(jié)與m6A修飾有關。細胞層面上，m6A修飾參與調控各種RNA的加工、降解及翻譯。組織層面上，m6A修飾參與特定組織的分化、發(fā)育，還會影響能量平衡的調節(jié)。在人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）中敲減METTL3導致成熟微小RNA（microRNA，miRNA）合成水平降低[12]；FTO與METTL3共同調節(jié)3′UTR長度和RNA可變剪切[13]。在卵母細胞中敲除YTH （YT521-B homology） 結構域蛋白 1（YTH domain-containing 1，YTHDC1）可導致mRNA可變剪切出現(xiàn)嚴重缺陷[14]。m6A修飾參與RNA可變剪切的調節(jié)，在外顯子剪切增強子區(qū)域的m6A修飾促進富含絲氨酸/精氨酸剪接因子2（serine/arginine-rich splicing factors 2，SRSF2）與mRNA結合，能夠增加外顯子表達[15]。m6A修飾參與RNA翻譯，位于3′或5′UTR的m6A修飾可以與翻譯起始因子真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）、80 kDa核帽結合蛋白（80 kDa nuclear cap-binding protein，CBP80）和真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）相互作用，促進RNA翻譯啟動[16]；YTHDF1促進核糖體與m6A修飾的mRNA結合，促進翻譯[17]；YTHDF3配合YTHDF1、YTHDF2發(fā)揮作用，并在m6A修飾驅動的環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）翻譯初始階段起作用[18-19]。m6A修飾降低mRNA穩(wěn)定性，參與RNA降解，YTHDF2介導m6A修飾的mRNA降解[20]。m6A修飾影響T細胞穩(wěn)態(tài)，m6A修飾通過白細胞介素7（interleukin-7，IL-7） /信號轉導及轉錄激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）/細胞因子信號抑制物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）通路控制T細胞穩(wěn)態(tài)，m6A修飾的減少抑制幼稚T細胞增殖分化，維持細胞自我更新[21]。m6A修飾調節(jié)精子形成，其缺失會導致二倍體精原細胞生成精子受阻[22]。m6A修飾影響胚胎發(fā)育，通過抑制干性基因如NANOG、性別決定相關基因簇 2（sex determining region Y-box 2，SOX2）以及IGFBP的mRNA的穩(wěn)定性，進而促進各類譜系標志物表達，誘導胚胎干細胞分化[23]；轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）也能通過 m6A修飾依賴途徑促進神經(jīng)外胚層發(fā)育[24]。m6A修飾幫助細胞產(chǎn)生熱休克應激，在熱休克應激下，m6A可以優(yōu)先修飾于應激誘導轉錄的熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）mRNA的5′UTR處，促進非cap依賴型翻譯的啟動[25]。

2 m6A異常修飾與腫瘤發(fā)生、發(fā)展

m6A修飾不僅生理作用豐富，其異常修飾在惡性腫瘤的發(fā)生和進展中也起到了相當重要的作用。并且m6A修飾在不同類型的腫瘤細胞中可以發(fā)揮完全相反的作用。

一些研究顯示，m6A修飾的異常下調可能促進腫瘤發(fā)生與進展。在急性髓細胞性白血病（acute myelocytic leukemia，AML）患者攜帶基因突變的造血細胞中，F(xiàn)TO過表達促進異常造血細胞增殖，抑制細胞凋亡[26]。FTO減少致癌基因MYC的mRNA 5′端及外顯子中的m6A修飾，抑制YTHDF2介導的RNA降解，提高對應蛋白質表達，促進腫瘤發(fā)生[27]。在急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）的異常造血細胞中，F(xiàn)TO抑制錨蛋白重復序列與SOCS盒蛋白2（ankyrin repeat and SOCS box protein 2，ASB2）和視黃酸受體α（retinoic acid receptor α，RARA）表達，增強致癌基因介導的細胞轉化和白血病發(fā)生[26]。在肺鱗狀細胞癌中，F(xiàn)TO促進髓樣鋅指蛋白1（myeloid zinc finger 1，MZF1）表達，進而抑制細胞凋亡，促進癌細胞增殖、侵襲[28]。在肝細胞癌中，METTL14下調導致miR-126的前體RNA上m6A修飾減少，造成DiGeorge綜合征危象區(qū)蛋白8（DiGeorge syndrome critical region 8，DGCR8）對其識別和結合的能力下降，使參與腫瘤轉移的成熟miR-126水平明顯下調，促進腫瘤轉移[29]。在黑色素瘤中，F(xiàn)TO的異常上調使C-X-C趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）和SOX10的轉錄片段m6A修飾減少，抑制YTHDF2介導的轉錄片段降解，促進蛋白質表達，介導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[30]。

與之相對應，另一些研究報道m(xù)6A修飾的異常上調也會導致腫瘤發(fā)生。在AML中，攜帶基因突變的造血細胞中異常增多的METTL14和METTL3分別提高致癌基因MYB、MYC和BCL2、PTEN的轉錄片段 m6A修飾水平，增加其表達，促進白血病干細胞增殖、自我更新，抑制骨髓分化[31-32]。在肝細胞癌中，METTL3上調導致SOCS2 轉錄片段m6A過度修飾，更易被YTHDF2識別降解，使SOCS2對酪氨酸受體激酶（tyrosine-protein kinase，JAK）/STAT通路的抑制減弱，導致腫瘤增殖[33]。在乳腺癌中，乙型肝炎病毒X蛋白結合蛋白（hepatitis B virus X-interacting protein，HBXIP）阻礙miRNA let-7g生成，增加METTL3表達，而高表達的METTL3進一步提高HBXIP的轉錄片段 m6A修飾水平，增加HBXIP表達，從而形成正反饋，促進腫瘤發(fā)生[34]。在胃癌中，METTL3異常增多提高AKT的磷酸化水平，促進AKT信號通路，介導下游效應子核糖體蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）和細胞周期蛋白D1（cyclin D1）表達，提高胃癌細胞增殖性和侵襲性[35]。在肺腺癌中，METTL3異常增多提高了表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和TAZ（tafazzin）蛋白表達，促進癌細胞生長、侵襲[36]。在結直腸癌中，METTL3異常增多提高致癌基因SOX2的轉錄片段編碼區(qū)（coding DNA sequence，CDS）的m6A修飾水平，促進轉錄片段被胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白2（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2，IGF2BP2）識別，提高其穩(wěn)定性，促進腫瘤生長[37]。在骨肉瘤中，METTL3提高淋巴增強子結合因子1（lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1）的轉錄片段 m6A修飾水平，促進LEF1表達，激活Wnt/β-catenin通路，促進腫瘤發(fā)生[38]。此外，m6A還可以影響腫瘤免疫，促進腫瘤進展。m6A可以通過IL-7/STAT5/SOCS通路影響T細胞穩(wěn)態(tài)，從而影響腫瘤患者免疫力[21]。

3 RNA m6A異常修飾與腫瘤干細胞

3.1 RNA m6A異常修飾與腫瘤干細胞的形成與維持

腫瘤細胞存在異質性，腫瘤在增殖過程中內部進化出不同性質的細胞類型，其中具有干性、可以自我更新和不對稱分裂、進而分化形成其他瘤內細胞的細胞亞群即是腫瘤干細胞。

在前文中，我們介紹了m6A修飾的異常上調破壞NANOG、SOX2、IGFBPs等干性基因mRNA片段的穩(wěn)定性，從而誘發(fā)胚胎干細胞分化[5]。在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中，很可能存在相反的過程，即m6A修飾在干性促進基因的轉錄片段上異常下調，促進基因表達，介導體細胞或分化較好的腫瘤細胞去分化，進而形成腫瘤干細胞。雖然目前對于腫瘤干細胞如何形成的認識不足，尚未有實驗直接支持這一猜想，但是m6A修飾促進致癌基因表達，促進腫瘤干細胞增殖、分化，從而促進腫瘤進展、復發(fā)的過程與其具有相似性。在乳腺癌中，缺氧微環(huán)境通過缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）提高ALKBH5表達，使干性因子NANOG、KLF4的轉錄片段去甲基化，從而避免m6A修飾介導的mRNA降解，使干性因子表達增加[39]。類似地，缺氧微環(huán)境通過HIF提高鋅指蛋白217（zinc finger protein 217，ZNF217）表達，抑制METTL3對KLF4轉錄片段的m6A修飾，從而提高轉錄片段的穩(wěn)定性[39]。抑制m6A修飾使腫瘤細胞干性基因表達增加，最終可能去分化成為腫瘤干細胞，由此可見，m6A修飾極有可能參與腫瘤干細胞形成。

m6A修飾通過對RNA剪切、加工、翻譯的密切影響參與維持腫瘤干細胞的自我更新。在神經(jīng)膠質瘤干細胞中，METTL3或METTL14的異常下調導致胞內m6A修飾水平整體降低，進而引起致癌基因ADAM19、EPHA3和KLF4表達上調，抑癌基因CDKN2A、BRCA2和TP53I11表達下調，促進了腫瘤干細胞的腫瘤形成和自我更新[40-41]。ALKBH5的高表達降低m6A修飾水平，使非m6A修飾的細胞周期調控因子叉頭框M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)oxM1）的轉錄片段被人抗原R（Hu-antigen R，HuR，ELAV1）蛋白結合，增加FoxM1轉錄片段的穩(wěn)定性，促進FoxM1蛋白的表達，從而提高了腫瘤干細胞的增殖和自我更新能力[42]。因此，RNA m6A修飾在腫瘤干細胞形成及維持過程中可能起到非常重要的作用。

3.2 RNA m6A異常修飾與腫瘤干細胞相關的腫瘤復發(fā)

作為腫瘤細胞層級制度的初級細胞，腫瘤干細胞是腫瘤放射治療和化學治療抵抗和治療后復發(fā)的重要原因。腫瘤干細胞導致腫瘤復發(fā)可能通過以下2種機制：一方面，治療時部分腫瘤干細胞通過休眠、微環(huán)境改變或自身調節(jié)等極大降低甚至規(guī)避損傷；另一方面，治療后腫瘤干細胞的自身損傷修復，使其重新進入細胞增殖分裂周期。

腫瘤干細胞可以通過調節(jié)自身膜受體和跨膜轉運系統(tǒng)降低化學治療帶來的損傷。研究[43]發(fā)現(xiàn)，過表達ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）的腫瘤干細胞可以在化學治療后進一步增殖。ABCB1的過表達給予腫瘤干細胞多種耐藥性，包括對秋水仙堿、阿霉素、依托泊苷、長春堿和紫杉醇的抗性[44-45]。神經(jīng)母細胞瘤高表達ABCG2和ABCA3轉運體，排出藥物的能力提高[3]。也有研究[46]表明，CD44高表達的胃癌細胞中Hedgehog通路蛋白與化學治療耐藥性有關。

腫瘤干細胞可以通過調節(jié)代謝減少抗腫瘤治療引起的氧化損傷。氧化損傷的主要機制是氧化磷酸化和脂質過氧化。腫瘤干細胞可以通過提高糖酵解率和增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除劑表達來抵抗氧化磷酸化引起的氧化損傷。轉移性黑色素瘤通過葉酸途徑增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成，還原氧化型谷胱甘肽，提高谷胱甘肽水平，從而清除ROS，減輕氧化應激[47]。肝癌腫瘤干細胞則通過過表達CD13清除ROS[48]。腫瘤干細胞中，乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDHs）合成增加可以降低脂質過氧化產(chǎn)物水平，減輕氧化應激，還可以保護腫瘤干細胞不受烷基化劑的影響，從而增加對環(huán)磷酰胺、紫杉醇等的耐藥性[3]。

腫瘤干細胞還可以通過調節(jié)組織微環(huán)境降低化學治療帶來的損傷。腫瘤干細胞生存在壁龕（niche）中，壁龕是維持和賦予干細胞活性的特殊微環(huán)境。壁龕有利于細胞通過黏附連接和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）進行細胞間交流。ECM通過整合蛋白（integrin）、旁分泌素（paracrine）、近分泌素（juxtacrine）和激素信號、機械傳感和神經(jīng)信號傳遞信息。腫瘤干細胞可以使相鄰的成纖維細胞轉變?yōu)槟[瘤相關成纖維細胞，調節(jié)壁龕組織微環(huán)境，利于腫瘤增殖和浸潤[49]。腫瘤干細胞亞群中，一部分細胞處于休眠態(tài)，因而可以避免抗腫瘤治療造成的損傷。放射治療和大部分化學治療僅對增殖中的腫瘤細胞有效，而研究[4,50]發(fā)現(xiàn)，膠質瘤和乳腺癌中約1/3的腫瘤干細胞處于休眠態(tài)，并且在治療后可以重新進入細胞周期。

除了通過維持腫瘤干細胞數(shù)量、促進其增殖間接對抗放射治療和化學治療，m6A修飾也參與腫瘤干細胞對抗腫瘤治療的直接抵抗。在神經(jīng)膠質瘤干細胞中，METTL3下調導致SOX2 轉錄片段的m6A修飾水平降低，促進HuR與SOX2轉錄片段結合，提高其穩(wěn)定性，增加SOX2表達。SOX2進一步激活DNA修復通路，提高膠質瘤干細胞的自我修復能力，降低放射治療敏感性[51]。在宮頸癌中，F(xiàn)TO的上調使β-catenin mRNA的m6A水平降低，促進β-catenin表達，進而介導上皮間質轉化以及核苷酸切除修復調節(jié)子ERCC1（excision repair cross-complementing 1）表達[52]。在結直腸癌中，YTHDF1過表達增強了Wnt/β-catenin通路，從而提高腫瘤細胞自我修復能力[53]。由于腫瘤干細胞往往是放射治療和化學治療抵抗的關鍵，可見RNA的表觀修飾提高了宮頸癌干細胞和結直腸癌干細胞的自我修復能力及放射治療和化學治療抵抗。不難看出，RNA的m6A修飾主要通過提高腫瘤干細胞自我修復能力對抗治療。然而，又有研究[26]發(fā)現(xiàn)，在APL中，F(xiàn)TO降低ASB2和RARA的mRNA UTR區(qū)m6A修飾水平，從而降低其mRNA穩(wěn)定性，進而減少其蛋白質表達，導致全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）誘導的細胞分化被抑制，ATRA療效降低。

4 展望

腫瘤細胞異質性是惡性腫瘤的特征之一，腫瘤干細胞僅占腫瘤的一小部分，而其他腫瘤細胞無法實現(xiàn)不斷自我更新，或者自我更新能力被剝奪。在腫瘤干細胞促進惡性腫瘤發(fā)生、進展和復發(fā)的過程中，以m6A異常修飾為代表的RNA表觀修飾很可能起到了至關重要的作用。因此，以m6A和腫瘤干細胞為切入點，探索控制腫瘤進展、抑制腫瘤復發(fā)的治療靶點，是未來研究的重要方向之一。