miR-199a在乳腺癌中的研究進(jìn)展

陳樹釗，黃文河，李瑤琛

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；2.廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院乳甲外科，福建 廈門 361101)

乳腺癌是當(dāng)今女性發(fā)病率最高的癌癥[1]，近幾十年來，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率一直在上升[2]，迫切需要更有效的診斷方法，以便在早期診斷和治療乳腺癌。微小RNA(microRNA，miR)是一類小型非編碼內(nèi)源性RNA 分子，長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸，從基因組DNA 轉(zhuǎn)錄成為長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA，然后由RNase Ⅲ型Drosha和Dicer酶修飾以產(chǎn)生pre-miRNA和miRNA，通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-untranslated regions，3′-UTR)部分互補(bǔ)結(jié)合，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。miR-199a通過靶向癌基因或腫瘤抑制因子或同時(shí)靶向兩者，直接或間接參與多種癌癥的發(fā)展。在乳腺癌中，miR-199a不僅與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，而且還調(diào)節(jié)腫瘤對(duì)化療、放療的敏感性。本文就miR-199a在乳腺癌中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 miR-199a在乳腺癌中的表達(dá)

Wang 等[4]通過研究68 例乳腺癌患者和40 例健康患者的乳腺組織及血清樣本，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組織和血清的miR-199a 水平明顯下調(diào)。Shin 等[5]使用微陣列芯片分析平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)低于正常乳腺組織。而Zhang 等[6]利用血清直接多重qRT-PCR 對(duì)128個(gè)血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的血清miR-199a相對(duì)表達(dá)量是健康對(duì)照組的2.65 倍。Bockmeyer 等[7]利用TaqMan 低密度芯片分析了664 種microRNA，聚類分析發(fā)現(xiàn)，與乳腺正常管腔細(xì)胞相比，正?；准?xì)胞中的miR-199a-3p顯著上調(diào)。與管腔A型、B型和基底樣型這3種乳腺癌亞型相比，乳腺惡性肌上皮瘤中的miR-199a-3p表達(dá)水平明顯上調(diào)，這表明正常乳腺基底細(xì)胞的microRNA 表型可能與乳腺惡性肌上皮瘤密切相關(guān)。此外，研究人員也通過確定正常乳腺上皮基底和管腔細(xì)胞中的microRNA 表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該表達(dá)模式與不同乳腺癌亞型有一定的關(guān)系，這將助于人們更好地理解各種乳腺癌亞型的分化譜系和惡性轉(zhuǎn)化。Carter 等[8]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后乳腺癌早期組(產(chǎn)后診斷乳腺癌時(shí)間≤5.2 年)患者與晚期組(產(chǎn)后診斷乳腺癌時(shí)間≥5.3年)相比，miR-199a-5p的表達(dá)水平有所下調(diào)。

2 miR-199a的靶基因

miR-199a在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，這與miR-199a 的靶基因功能密切相關(guān)。目前為止，在乳腺癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miR-199a下游靶基因有V-ets 成紅細(xì)胞增多癥病毒E26 癌基因同源物 1(erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1，Ets-1)、盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)、Caveolin-2、核受體共阻遏因子(nuclear receptor corepressor，LCOR)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MRP1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)、受體酪氨酸激酶Axl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(serine/threonine protein kinase 4，PAK4)等。

2.1 Ets-1

Ets-1 是紅細(xì)胞增多癥病毒E26 癌基因轉(zhuǎn)錄因子家族一員，Ets-1與雌激素受體α、核受體輔激活物共同協(xié)作促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖[9]。Li等[10]通過免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Ets-1 蛋白的表達(dá)與miR-199a-5p 的水平呈負(fù)相關(guān)，繼而在雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了miR-199a-5p 通過與Ets-1基因的 3′-UTR 序列作用，下調(diào)了 Ets-1 的活性。隨著Ets-1基因的敲除，β1整合素的水平下降，并降低了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 和MCF-7 的體外遷移和侵襲能力，這意味著miR-199a-5p/Ets-1/β1整合素信號(hào)軸抑制了乳腺癌腫瘤的進(jìn)展。

2.2 DDR1

胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一種保守的分泌蛋白，影響哺乳動(dòng)物的發(fā)育和代謝[11]。DDR1 是一種膠原蛋白受體酪氨酸激酶，是乳腺癌細(xì)胞中，IGF-Ⅰ受體的重要靶標(biāo)[12]。Roberta 等[13]發(fā)現(xiàn)，隨著IGF-Ⅰ處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 時(shí)間的延長(zhǎng)或IGF-Ⅰ劑量的增加，DDR1蛋白明顯上調(diào)，miR-199a-5p 下調(diào)。在 MCF-7 細(xì)胞中，IGF-Ⅰ誘導(dǎo) DDR1 蛋白上調(diào)的進(jìn)程可以完全被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)抑制劑所阻斷。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 miR-199a-5p 可以靶向 DDR1 的 3′UTR。myr-PKB 轉(zhuǎn)染MCF-7 和 MDA-MB-231 細(xì) 胞 后 ， miR-199a-5p 下 調(diào) ，DDR1 上調(diào)。這些結(jié)果提示IGF 可能通過激活PI3K/PKB/miR-199a-5p 途徑導(dǎo)致DDR1 表達(dá)增加。對(duì)于過表達(dá)IGF-Ⅰ的乳腺癌細(xì)胞，通過調(diào)控PI3K/PKB/miR-199a-5p/DDR1信號(hào)軸有可能成為一種重要的乳腺癌治療途徑。

2.3 Caveolin-2

Caveolin-2 是細(xì)胞膜穴樣凹陷的結(jié)構(gòu)蛋白。Shatseva等[14]通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p 可以增加內(nèi)皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，通過生物信息學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)Caveolin-2 的 3′UTR 中存在 miR-199a-3p 的 2 個(gè)潛在靶位點(diǎn)，在隨后進(jìn)行的熒光素酶實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了Caveolin-2基因是miR-199a-3p 的靶基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)Caveolin-2 后，可削弱miR-199a-3p 的促乳腺癌細(xì)胞增殖活性，提示miR-199a-3p 靶向Caveolin-2 可能在乳腺癌進(jìn)展中起重要作用。

2.4 TFAM

TFAM 對(duì)維持線粒體的生物合成及功能至關(guān)重要，參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。TFAM 可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，降低雌激素受體陽性乳腺癌對(duì)順鉑化療的敏感性[15]。Fan等[16]通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明了TFAM基因是miR-199a的靶基因，在對(duì)順鉑(DDP)耐藥型MDA-MB-231(MDA-MB-231/DDP)細(xì)胞中，TFAM 過表達(dá)可減弱miR-199a-3p 過表達(dá)誘導(dǎo)的耐藥性。這些結(jié)果表明miR-199a-3p可能通過抑制TFAM的表達(dá)來減弱乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

2.5 Axl

受體酪氨酸激酶Axl 可以通過結(jié)合生長(zhǎng)因子將信號(hào)從細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞質(zhì)中，有助于癌細(xì)胞的免疫逃逸和耐藥性，增強(qiáng)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力[17]。Mudduluru等[18]利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Axl可能受到miR-34a/miR-199a調(diào)控，將miR-34a 或 miR-199a 轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231 細(xì)胞，這 2 種miRNA 在轉(zhuǎn)錄水平上共同競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié)Axl。細(xì)胞侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，miR-34a 和miR-199 顯著降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲，甲基化特異性PCR 揭示了miR-34a、miR-199a 和Axl 啟動(dòng)子在乳腺癌細(xì)胞中高甲基化，說明在癌癥中表觀遺傳修飾調(diào)控miRNA可能是一種普遍現(xiàn)象。

2.6 PAK4

Li 等[19]在 MDA-MB-231 細(xì)胞中過表達(dá) miR-199a-3p后，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，而敲除PAK4基因則得到相反的結(jié)果。通過生物信息學(xué)分析和熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PAK4是miR-199a-3p 的靶基因，隨著miR-199a-3p 的上調(diào)，磷酸化ERK、MEK 的表達(dá)下降，提示了miR-199a-3p通過抑制PAK4/MEK/ERK通路起到抗腫瘤作用。

2.7 LCOR

Celià-Terrassa 等[20]通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 LCOR 是miR-199a 的下游效應(yīng)物，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-199a/LCOR 抑制了α干擾素的應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄，由于癌癥干細(xì)胞對(duì)干擾素的反應(yīng)較弱，可以逃避免疫監(jiān)視[21]。因此，若通過靶向miR-199a-LCOR 軸，乳腺癌癌癥干細(xì)胞可以對(duì)干擾素應(yīng)答更敏感，進(jìn)而削弱自身的免疫特權(quán)。

3 miR-199a與臨床病理特征的關(guān)系

Shin等[5]收集了5名三陰性乳腺癌患者的血清，采用受試者操作特征曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p 的表達(dá)水平越高，腫瘤的分期越低。ER/PR(+)和HER2(+)的腫瘤細(xì)胞中，miR-199a-5p的表達(dá)高于三陰性乳腺癌。Zhang等[6]收集了128 個(gè)血清樣本，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者miR-199a、miR-29c 和miR-424 的表達(dá)水平比健康對(duì)照組高，miR-199a、miR-29c和miR-424這3種microRNA 組合在一起區(qū)分乳腺癌患者與健康人群方面具有較高診斷準(zhǔn)確性(AUC=0.888)。但這種miRNA 組合與臨床病理特征(如ER、PR、HER2)的相關(guān)性不顯著，Verderio等[22]認(rèn)為可能是未結(jié)合上述3種microRNA的綜合評(píng)分從而造成了誤差，建議使用多變量分析方法分析。Celià-Terrassa等[20]通過Buffa數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p 高表達(dá)的ER(-)乳腺癌患者的無遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)生存率低于miR-199a-5p低表達(dá)患者。Jiang等[23]通過研究三陰性乳腺癌特異性數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p是三陰性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。miR-199a的表達(dá)與乳腺癌患者臨床預(yù)后、病理特征的關(guān)系仍未完全明確。

4 miR-199a對(duì)乳腺癌化療和放療敏感性的影響

Chang 等[24]發(fā)現(xiàn)linc00518 的敲除增強(qiáng)了耐藥型MCF-7細(xì)胞(MCF-7/ADR)對(duì)阿霉素，長(zhǎng)春新堿和紫杉醇的化學(xué)敏感性，miR-199a 的下調(diào)可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。Fan 等[16]發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/DDP 細(xì) 胞 中 ， miR-199a-3p 的表達(dá)水平明顯下調(diào)，過表達(dá)miR-199a-3p 可以增加MDA-MB-231/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。Shatseva等[14]分別對(duì)乳腺癌MT1細(xì)胞的miR-199a-3p進(jìn)行過表達(dá)和抑制生成的處理，經(jīng)多烯紫杉醇處理后，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p過表達(dá)后產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞比例更高。這些研究表明miR-199a對(duì)提高乳腺癌化療藥物敏感性起到重要作用。

易賀慶等[25]分別在MDA-MB-231 細(xì)胞和MCF-7 細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-199a-5p，并給予電離輻射處理，發(fā)現(xiàn)與未過表達(dá)miR-199a-5p 的對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-199a-5p的MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖活性降低至90%，MCF-7 細(xì)胞則無明顯變化。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231 細(xì)胞中，miR-199a-5p 與DRAM1和BECN1R基因結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)，從而激活自噬過程，并且增強(qiáng)電離輻射誘導(dǎo)的自噬；在MCF-7細(xì)胞內(nèi)，miR-199a-5p下調(diào)了DRAM1和BECN1R基因的表達(dá)，抑制了電離輻射誘導(dǎo)的自噬。這提示了miRNA自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌放療過程中起重要作用，在不同細(xì)胞背景下，miRNA對(duì)靶基因及生物功能的調(diào)控機(jī)制又有所區(qū)別。

5 小結(jié)

miR-199a在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控抑癌基因或促癌基因的表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等過程中起到重要作用，進(jìn)而影響了癌細(xì)胞的臨床病理特征和預(yù)后，也影響化療、放療的敏感性。隨著對(duì)miR-199a 的深入研究，發(fā)現(xiàn)由于其靶基因作用的不同，miR-199a在乳腺癌中發(fā)揮著促癌或抑癌的雙重角色，其靶基因具體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和功能仍需進(jìn)一步地深入探索。miR-199a能否成為乳腺癌早期篩選指標(biāo)和靶向治療靶點(diǎn)尚需繼續(xù)研究。