瑪咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物的制備與表征

潘蓉，魏金超，高玉梅，陳芮，*

（1.云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明650500；2.中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所，北京100190）

缺鐵性貧血?。╥ron deficiency anemia，IDA）是全球最常見(jiàn)的貧血病之一。采用第一代、第二代補(bǔ)鐵劑治療IDA具有副作用大、對(duì)腸胃刺激明顯等不足。多糖鐵作為第三代補(bǔ)鐵劑通過(guò)降低患者的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的含量，提高血清鐵蛋白的含量來(lái)改善血液學(xué)指標(biāo)[1]，具有與常規(guī)硫酸亞鐵相同的補(bǔ)鐵作用。由于其中的鐵在腸胃中以分子形式存在，不會(huì)對(duì)胃腸道產(chǎn)生刺激作用及不出現(xiàn)二價(jià)鐵常有的輕微嘔吐、腹瀉或便秘等癥狀[2]，因此，多糖鐵類(lèi)補(bǔ)鐵劑的研發(fā)備受學(xué)者的青睞。

目前，多糖鐵類(lèi)補(bǔ)鐵劑的研究主要包括銀耳[3]、紫菜[4]、茶葉[5]、大棗[6]等常見(jiàn)的植物類(lèi)多糖鐵復(fù)合物及人參[7]、白芍[8]、當(dāng)歸[9]、黨參[10]、黃芪[11]等中藥類(lèi)多糖鐵復(fù)合物。其中中藥類(lèi)多糖鐵復(fù)合物具有自身活血補(bǔ)血的特點(diǎn)[12]。

多糖鐵類(lèi)復(fù)合物（polysaccharide-ironcomplex，PIC）是以植物多糖為載體，絡(luò)合三價(jià)鐵后得到的，采用化學(xué)合成方法制備[13-14]。根據(jù)鐵鹽的特殊反應(yīng)，采用紅外光譜法可以對(duì)多糖-鐵（Ⅲ）進(jìn)行定性鑒別[9，15-17]。

瑪咖作為一種藥食兩用植物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[18]。其主要成分——瑪咖多糖不僅具有調(diào)節(jié)免疫力、抗疲勞、抗氧化、抗衰老等作用[19-21]，在治療貧血方面也具有一定的功效[8]。至今雖然研究瑪咖多糖[22-24]及PIC[3-11]的報(bào)道不少，但尚未有瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的研究報(bào)道。

本文報(bào)道了瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的制備方法，并對(duì)其進(jìn)行了定性表征和定量分析。以期這種制備瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的研究思路能為其它大分子螯合鐵類(lèi)補(bǔ)鐵劑的研發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-8000s型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁海儀器有限公司；ALPHA-Ⅱ型紅外光譜儀：德國(guó)布魯克·道爾頓公司；PHS25型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試劑及配制

硫酸亞鐵胺[Fe（NH4）（2SO4）2·6H2O]、鄰菲羅啉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6·3H2O]、三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）、鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）、醋酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸、無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、濃硫酸（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g，生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司。

100 mg/L鐵（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取0.702 3 g硫酸亞鐵胺，溶于少量蒸餾水后，加入3 mL鹽酸，定容至1 000 mL。

10.0 mg/L鐵（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)使用液（使用時(shí)現(xiàn)配）：精確吸取10.00 mL鐵（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至100 mL。

500 mg/L檸檬酸鈉溶液：稱取0.500 0 g Na3C6H5O·72H2O溶于蒸餾水中，稀釋至1 000 mL。

鄰菲羅啉顯色液：稱取0.1 g鄰菲羅啉，溶解于加有2滴鹽酸的蒸餾水中，稀釋至100 mL。

10%鹽酸羥胺溶液：稱取10 g NH2OH·HCl溶解并稀釋至100 mL。

醋酸鈉緩沖液（pH4.5）：稱取68 g醋酸鈉溶于500mL蒸餾水中，加入冰乙酸28.8mL，稀釋至1000 mL。

0.01 mol/L三氯化鐵溶液：稱取0.270 3 g FeCl3·6H2O用蒸餾水溶解并稀釋至100 mL。

0.01mol/L的硫酸亞鐵溶液：稱取0.2780 g FeSO·47H2O用蒸餾水溶解并稀釋至100 mL。

0.5 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取2 g氫氧化鈉用蒸餾水溶解并稀釋至100 mL。

10%的亞鐵氰化鉀溶液：稱取10 g亞鐵氰化鉀用蒸餾水溶解并稀釋至100 mL。

瑪咖：云南省昆明市豐熙茶行。

2 方法

2.1 瑪咖多糖的提取

瑪咖切片粉碎后，準(zhǔn)確稱取100g瑪咖粉末，按照料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，超聲 40 min 后，將溶液在90℃下浸提2 h，離心5 min，棄去沉淀，蒸發(fā)上清液。

用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）調(diào)節(jié) pH值至6.0左右，加入α-淀粉酶，在60℃下酶解，隨后加入無(wú)水乙醇醇析12 h；離心5 min收集沉淀，加入蒸餾水溶解，采用Sevag法除蛋白。對(duì)蛋白除盡的液體再次醇析12 h后，用乙醚、丙酮洗滌沉淀2次，真空干燥后，保存?zhèn)溆?。采用該法得到的瑪咖多糖?.291 5 g，產(chǎn)率約為5.29%。

Sevag法除蛋白：移取瑪咖多糖溶液100 mL，按體積比5∶1加入三氯甲烷-正丁醇（5∶1，體積比）混合液，振搖30 min，經(jīng)離心分離后吸取上清液。重復(fù)此過(guò)程，直至瑪咖多糖稀釋液在260 nm～280 nm不出現(xiàn)吸收峰。

2.2 瑪咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物的制備

移取1 mL 500 mg/L瑪咖多糖溶液、0.25 mL檸檬酸鈉溶液和3 mL三氯化鐵溶液，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，用蒸餾水補(bǔ)至15 mL。將上述溶液分別置于不同溫度的水浴中加熱1 h。即得瑪咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物。

3 結(jié)果與討論

3.1 瑪咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物最佳反應(yīng)條件的探究

向瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物溶液中加入1 mL 10%鹽酸羥胺溶液、2.5 mL鄰菲羅啉溶液和5 mL醋酸鈉溶液，用蒸餾水稀釋至50 mL，顯色15 min后，測(cè)定吸光度，考察反應(yīng)溫度、pH值、絡(luò)合時(shí)間對(duì)瑪咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物吸光度的影響。

3.1.1 溫度與pH值的選擇

反應(yīng)溫度和pH值對(duì)瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物吸光度的影響見(jiàn)圖1。

從圖1可見(jiàn)，當(dāng)溫度為70℃、pH9時(shí)，吸光度最低，表明此時(shí)游離Fe3+濃度最小，瑪咖多糖和Fe（Ⅲ）的絡(luò)合程度最高。

圖1 反應(yīng)溫度和pH值對(duì)瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物吸光度的影響Fig.1 The effect of temperature and pH value on absorbance of Maca polysaccharide-Fe（Ⅲ）complex

3.1.2 絡(luò)合時(shí)間的選擇

在pH9的反應(yīng)條件下，控制反應(yīng)溫度為70℃，在不同絡(luò)合時(shí)間下測(cè)定樣品的吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 絡(luò)合時(shí)間對(duì)瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物吸光度的影響Fig.2 The effect of time on absorbance of Maca polysaccharide-Fe（Ⅲ）complex

由圖2可見(jiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度先減小后增大，當(dāng)絡(luò)合時(shí)間為150 min時(shí)吸光度最低。

綜上所述，制備瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的最佳反應(yīng)條件為：溶液pH9，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間150min。

3.2 瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的定性鑒別

3.2.1 配合物的性質(zhì)

采用該方法制備得到的瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物為無(wú)臭、無(wú)味、易溶于水、不溶于有機(jī)試劑的棕色粉末。

在0.01 mol/L的三氯化鐵溶液、0.01 mol/L的硫酸亞鐵溶液和500 mg/L瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物溶液中分別滴加0.5 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH酸度計(jì)測(cè)定它們分別在剛產(chǎn)生沉淀和產(chǎn)生大量沉淀時(shí)的pH值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三氯化鐵溶液剛產(chǎn)生沉淀時(shí)的pH值為2.56，產(chǎn)生大量沉淀時(shí)的pH值為6.62；硫酸亞鐵溶液剛產(chǎn)生沉淀時(shí)的pH值為3.33，產(chǎn)生大量沉淀時(shí)的pH值為5.57；而瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物在pH值≥13時(shí)都沒(méi)有出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，這一事實(shí)表明瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物在堿性條件下具有一定的穩(wěn)定性。

3.2.2 游離鐵的鑒別

取少量500 mg/L瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物溶液，加入10%的亞鐵氰化鉀溶液，未見(jiàn)普魯士藍(lán)沉淀現(xiàn)象發(fā)生，表明配合物中沒(méi)有游離的Fe3+。

取少量瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）溶液，滴加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，無(wú)明顯現(xiàn)象，進(jìn)一步表明配合物中沒(méi)有游離的Fe3+。

3.2.3 絡(luò)合鐵的鑒別

移取10 mL瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）溶液，加入5 mL濃鹽酸，煮沸5 min。溶液由透明棕色變?yōu)橥该鼽S色。冷卻后，加入10%的亞鐵氰化鉀溶液，出現(xiàn)普魯士藍(lán)沉淀現(xiàn)象，說(shuō)明該配合物為瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物。

取同樣量的瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）溶液進(jìn)行酸化煮沸后，滴加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，溶液迅速產(chǎn)生紅棕色沉淀，進(jìn)一步說(shuō)明該配合物為瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物。

3.3 瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的結(jié)構(gòu)分析

3.3.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析

鄰菲羅啉分光光度法作為表征和檢測(cè)多糖鐵中鐵含量的主要方法在多糖鐵的合成中被廣泛應(yīng)用。由于瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物中不含有游離的Fe3+，但當(dāng)加入強(qiáng)酸加熱后，再向溶液加入鑒別試劑時(shí)卻能表現(xiàn)出特殊的鐵鹽反應(yīng)。瑪咖多糖和瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖3。

圖3 瑪咖多糖和瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.3 The ultraviolet-visible absorption spectra of Maca polysaccharides and Maca polysaccharides-Fe（Ⅲ）complex

由圖3可知，瑪咖多糖的吸收峰出現(xiàn)在340 nm左右；而瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的吸收峰出現(xiàn)在270 nm。通過(guò)與瑪咖多糖的吸收光譜進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的吸收峰在波長(zhǎng)200 nm～450 nm時(shí)上升緩慢，但吸光度均大于瑪咖多糖的吸光度。

綜上，瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的紫外吸收光譜出現(xiàn)的明顯變化歸因于結(jié)構(gòu)的改變，即表明采用該方法可以成功地制得瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物。

3.3.2 紅外吸收光譜分析

采用KBr壓片法分析了樣品的紅外吸收光譜。圖4為瑪咖多糖和瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的紅外譜圖。

圖4 瑪咖多糖和瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的紅外吸收光譜Fig.4 Infrared absorption spectra of Maca polysaccharides and Maca polysaccharides-Fe（Ⅲ）complex

通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，這兩種物質(zhì)的紅外光譜圖存在顯著的差異?，斂Ф嗵窃? 600 cm-1～3 100 cm-1處出現(xiàn)精確的吸收峰，而瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物只在3 412 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)吸收峰，對(duì)應(yīng)于O-H的伸縮振動(dòng)；瑪咖多糖在1 668 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰對(duì)應(yīng)于C=O伸縮振動(dòng)，在1 417 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰對(duì)應(yīng)于C-O伸縮振動(dòng)，在1 078 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰對(duì)應(yīng)于C-O-C的對(duì)稱伸縮振動(dòng)；瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物在這3處的吸收峰增強(qiáng)并移動(dòng)到1 598、1 402 cm-1和1 142 cm-1處?，斂Ф嗵?鐵（Ⅲ）配合物的紅外譜圖在848 cm-1出現(xiàn)了鐵的氫氧化物的特征吸收峰。這是由于鐵（Ⅲ）與瑪咖多糖的絡(luò)合引起-OH吸收峰發(fā)生改變。這一結(jié)果說(shuō)明瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物中的-OH參與了Fe3+的配位反應(yīng)。

3.4 瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物中鐵含量的測(cè)定

由于在強(qiáng)酸且加熱的條件下，瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，導(dǎo)致絡(luò)合鐵變?yōu)橛坞x鐵[10]，因此采用鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物中鐵的含量。

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取 10 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液 0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00mL及10.00mL，分別加入10%鹽酸羥胺溶液1mL、鄰菲羅啉顯色液2.5 mL和1 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用蒸餾水稀釋至50 mL，搖勻，放置10 min～15 min，以第一份溶液為參比，測(cè)定510 nm處的吸光度。以鐵濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖5所示，得到回歸方程：A=0.214 4c-0.013 7，R2=0.991 8。

圖5 鐵溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard calibration curve of iron solution

3.4.2 樣品中鐵的含量

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物，加入3 mL濃鹽酸溶液和少量蒸餾水，煮沸5 min，冷卻至室溫（25℃）后，定容至100 mL。分別從中吸取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 置于比色管中，按 3.4.1 方法測(cè)定溶液的吸光度（n=3），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品中鐵含量的測(cè)定Table 1 Determination of the content of Fe（Ⅲ）in Maca polysaccharides-Fe（Ⅲ）complex

計(jì)算得到瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物中鐵含量為13.31%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.46%。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以瑪咖粉為原料，采用熱水浸提法結(jié)合超聲波輔助法提取粗瑪咖多糖，用Sevag法除去其中的游離蛋白質(zhì)；采用三氯化鐵法使提取純化的瑪咖多糖和鐵（Ⅲ）反應(yīng)制備瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物。該絡(luò)合反應(yīng)的最佳條件為：70℃、調(diào)節(jié)溶液的pH9，反應(yīng)150min。該方法制備的瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物為無(wú)臭、無(wú)味、易溶于水、不溶于有機(jī)試劑，且具有良好穩(wěn)定性的棕色粉末。采用鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定瑪咖多糖-鐵（Ⅲ）配合物中鐵的含量為13.31%，RSD為0.46%。