里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝

權(quán)利要求書(shū)

1. 一種纖維素酶的制備方法， 其特征在于：所述纖維素酶使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉（Trichoderma reesei），其保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏號(hào)為CGMCC No.2785。

所述纖維素酶的制備方法如下：將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐（1）中進(jìn)行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子，然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐（2），并且在一定的發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵，最后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液，并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐（3）中以備用。 所述發(fā)酵工藝參數(shù)如下：

（1）里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基：1%～2%CMC，4%～8%營(yíng)養(yǎng)元素液，0.1%～0.5%微量元素液，2%～3%瓊脂，pH=6.0；

（2）里氏木霉菌種的培養(yǎng)：將菌種接于斜面培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中于（29±1） ℃條件下培養(yǎng)4～7 d 后使用或4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基：1%～3%葡萄糖，4%～8%營(yíng)養(yǎng)元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.4%微量元素液；

（4）纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源為0.1%～3%速生材硫酸鹽漿，8%～10%營(yíng)養(yǎng)元素液，0.2%～0.5%微量元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.2%表面活性劑Tween-80；

（5）液體種子發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～7，攪拌速度250～300 r/min，通風(fēng)量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時(shí)間36～48 h；

（6）纖維素酶發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～8，接種量2%～3%，攪拌速度250～300 r/min，通風(fēng)量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時(shí)間72～96 h。

所述營(yíng)養(yǎng)元素液其配方為：3～10 g 檸檬酸鈉，5～20 g 磷酸二氫鉀，1～10 g 硫酸銨，0.5～5 g 硫酸鎂，0.1～5 g 氯化鈣，溶解后定容至100 mL。

所述微量元素液配方為：1～5 g 硫酸亞鐵，0.1～1 g硫酸錳，0.1～1 g 氯化鋅，0.5～5 g 氯化鈷，1～10 mL 2 mol/L 的HCl，溶解后定容到100 mL；上述所有百分比均以質(zhì)量計(jì)。

2. 權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于：所述碳源為思茅松硫酸鹽漿。

3. 權(quán)利要求 所述的方法，其特征在于：酶液的制備過(guò)程中，種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用1%葡萄糖、4%營(yíng)養(yǎng)元素液、1%麩皮、0.1%微量元素液，在溫度30 ℃、pH=6、攪拌速度250 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h，得到所需要的液體種子；然后按照2%的接種量，將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐（2），發(fā)酵培養(yǎng)基采用碳源為0.1%的速生材硫酸鹽漿、8%營(yíng)養(yǎng)元素液、0.2%微量元素液、1%麩皮、0.2%表面活性劑Tween-80，在溫度30 ℃、pH=6、接種量2%、攪拌速度300 r/min、通風(fēng)量0.3 m3/h 的條件下發(fā)酵96 h。

4. 一種采用權(quán)利要求1 所述方法制得的纖維素酶用于酶促打漿的方法，其特征在于：紙漿為速生材硫酸鹽漿， 按照權(quán)利要求1 所述的方法制備纖維素酶并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐中以備用， 將纖維素酶存儲(chǔ)罐（3）中的酶液通過(guò)計(jì)量泵以7 u/g 的酶用量以FPA 酶活為單位，輸送到紙漿反應(yīng)池（4）對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)處理，處理?xiàng)l件為漿濃10%、溫度50 ℃、pH=7.8、處理時(shí)間1 h，經(jīng)纖維素酶處理后的紙漿輸送到盤(pán)磨機(jī)(5)進(jìn)行打漿。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種纖維素酶酶促打漿工藝， 尤其涉及一種里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝。

背景技術(shù)

打漿是制漿造紙過(guò)程的重要環(huán)節(jié)， 對(duì)紙幅的物理性能產(chǎn)生效應(yīng)。然而，打漿是一耗能工段。為了得到所需要的紙漿性質(zhì)， 打漿或磨漿將消耗大量的能源，大約占從原料到成紙所需總能源的18%。 因此，任何能夠顯著降低打漿或磨漿能耗的紙漿處理方法將對(duì)整個(gè)能量輸入產(chǎn)生有益影響。

Pratima Bajpai 發(fā)表在《TAPPI Journa1》2006年第5 卷11 期第25—32 頁(yè)“Use of enzymes for reduction in refining energy-laboratory studies”一文的研究表明：印度Biocon 公司的Biorefine L 纖維素酶和美國(guó)Dyadic 國(guó)際公司的FiberZyme LBR 纖維素酶能夠有利地降低打漿能耗， 并且紙漿的強(qiáng)度性能沒(méi)有受到影響。

鞠成民發(fā)表在《中國(guó)造紙》2006年第25 卷1 期第71—72 頁(yè) “生物酶對(duì)未漂針葉木打漿性能的影響” 一文中介紹了N613、N476、N342、HC、D401 和D501 等諾維信商品纖維素酶和半纖維素酶在提高打漿性能和改善紙漿強(qiáng)度方面的影響。

上述研究所用的纖維素酶都為商品酶， 并非根據(jù)實(shí)際情況而自制纖維素酶用于酶促打漿。 由于現(xiàn)在商品纖維素酶價(jià)格比較高， 使得工廠使用起來(lái)成本很高；此外，國(guó)內(nèi)的造紙?jiān)隙倘?，大部分速生木材如馬尾松、 落葉松和思茅松等針葉木的纖維又粗又長(zhǎng)，其硫酸鹽漿很難打漿，使得商品漿的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力弱，經(jīng)濟(jì)效益差。 為此，紙業(yè)界亟待開(kāi)發(fā)根據(jù)生產(chǎn)廠的具體情況， 采用就地自制的纖維素酶酶液進(jìn)行酶促打漿工藝， 以達(dá)到降低生產(chǎn)成本和打漿能耗的效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶及其酶促打漿工藝， 使用里氏木霉液體深層發(fā)酵纖維素酶對(duì)速生材硫酸鹽漿進(jìn)行酶促打漿，可降低打漿能耗和生產(chǎn)成本。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用的技術(shù)方案如下：

一種纖維素酶， 其特征在于所使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉（Trichoderma reesei），保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2785。 里氏木霉為好氧菌，生長(zhǎng)環(huán)境粗放，適應(yīng)性較強(qiáng)，易于控制，便于管理，其代謝物安全無(wú)毒，不會(huì)影響生產(chǎn)人員和環(huán)境，所產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性好，不宜退化。

纖維素酶的制備方法如下： 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐中進(jìn)行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子； 然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐， 并且在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵，最后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液，并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐中以備用。

發(fā)酵工藝參數(shù)如下：

（1）里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基：1%～2% CMC，4%～8%營(yíng)養(yǎng)元素液，0.1%～0.5%微量元素液，2%～3%瓊脂，pH=6.0；

（2）里氏木霉菌種的培養(yǎng)：將菌種接于斜面培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中于（29±1） ℃條件下培養(yǎng)4～7 d 后使用或4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

（3） 液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基：1%～3%葡萄糖，4%～8%營(yíng)養(yǎng)元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.4%微量元素液；

（4）纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源為0.1%～3%速生材硫酸鹽漿，8%～10%營(yíng)養(yǎng)元素液，0.2%～0.5%微量元素液，1%～4%麩皮，0.1%～0.2%表面活性劑Tween-80 ；

（5）液體種子發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～7，攪拌速度250～300 r/min，通風(fēng)量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時(shí)間36～48 h；

（6）纖維素酶發(fā)酵條件：溫度30～40 ℃，pH=5～8，接種量2%～3%，攪拌速度250～300 r/min，通風(fēng)量0.2～0.3 m3/h，發(fā)酵時(shí)間72～96 h；

所述營(yíng)養(yǎng)元素液的配方為：取3～10 g 檸檬酸鈉，5～20 g 磷酸二氫鉀，1～10 g 硫酸銨，0.5～5 g 硫酸鎂，0.1～5 g 氯化鈣，溶解后定容至100 mL；

所述微量元素液配方為：1～5 g 硫酸亞鐵，0.1～1 g硫酸錳，0.1～1 g 氯化鋅，0.5～5 g 氯化鈷，1～10 mL 2 mol/L 的HCl，溶解后定溶到100 mL；上述所有百分比均以質(zhì)量計(jì)。

在本發(fā)明的纖維素酶的制備方法中， 所用的發(fā)酵碳源為思茅松硫酸鹽漿。

在本發(fā)明的纖維素酶的制備方法中，其酶液的制備過(guò)程中， 種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用：1%葡萄糖，4%營(yíng)養(yǎng)元素液，1%麩皮，0.1%微量元素液，在溫度30 ℃，pH=6，攪拌速度250 r/min，通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h， 得到所需要的液體種子； 然后按照2%的接種量，將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基采用：碳源為0.1%的速生材硫酸鹽漿，8%營(yíng)養(yǎng)元素液，0.2%微量元素液，1%麩皮，0.2%表面活性劑Tween-80， 在溫度30℃，pH=6；接種量2%，攪拌速度300 r/min；通風(fēng)量0.3m3/h 的條件下發(fā)酵96 h。

用本發(fā)明的纖維素酶的制備方法所制得的纖維素酶產(chǎn)品的性能：纖維素酶酶液的酶活分別為FPA 酶活為900～1500 u/mL，Cx 酶活為3000～4000 u/mL，Cb酶活為10～100 u/mL，Cl 酶活為500～1000 u/mL。

采用本發(fā)明制得的纖維素酶用于酶促打漿，其打漿工藝為：紙漿為速生材硫酸鹽漿，按照本發(fā)明所述的方法制備纖維素酶并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐中以備用， 將纖維素酶存儲(chǔ)罐中的酶液通過(guò)計(jì)量泵以3～9 u/g 的酶用量（以FPA 酶活為單位），輸送到紙漿反應(yīng)池對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)處理。

處理?xiàng)l件為：漿濃3%～10%、溫度40～60 ℃、pH=6～8、處理時(shí)間1～2 h，經(jīng)纖維素酶處理后的紙漿輸送到盤(pán)磨機(jī)進(jìn)行打漿。

在本發(fā)明的打漿工藝中，所述速生材硫酸鹽漿為思茅松硫酸鹽漿，酶用量7 u/g（以FPA 酶活為單位），將濃10%，溫度50 ℃，pH=7.8（紙漿本身pH），處理時(shí)間1 h。

本發(fā)明的有益效果是：1. 工藝簡(jiǎn)單， 生產(chǎn)成本低；2. 采用所要處理的紙漿為發(fā)酵碳源能夠顯著提高酶液的適應(yīng)性；3. 纖維素酶的酶活高、用量少、針對(duì)性強(qiáng)、效果好；4. 降低打漿能耗，對(duì)纖維本身的損傷小。

具體實(shí)施方式

圖1 是本發(fā)明纖維素酶酶促打漿工藝流程示意圖。 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明。

圖1 纖維素酶酶促打漿工藝流程示意圖

實(shí)施例1

參見(jiàn)圖1，一種纖維素酶的制備，其使用的生產(chǎn)菌株為里氏木霉。 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐1 中進(jìn)行種子發(fā)酵得到所需要的液體種子； 然后按照一定的接種量將液體種子接入纖維素酶發(fā)酵罐2，并且在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵，最后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液， 并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐3 中以備用。

酶液的具體制備： 將里氏木霉試管斜面菌種接入液體種子發(fā)酵罐1 中， 種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用1%葡萄糖、4%營(yíng)養(yǎng)元素液、1%麩皮和0.1%微量元素液，在溫度30 ℃、pH=5.76、攪拌速度250 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵48 h 得到所需要的液體種子； 然后按照2%的接種量將種子接入纖維素酶發(fā)酵罐2； 發(fā)酵培養(yǎng)基采用0.1%思茅松硫酸鹽漿、8%營(yíng)養(yǎng)元素液、0.2%微量元素液、1%麩皮和加入量為0.2%的表面活性劑Tween-80，在溫度30 ℃、pH=6、攪拌速度300 r/min、通風(fēng)量0.2 m3/h 的條件下發(fā)酵96 h， 然后經(jīng)過(guò)離心分離制得所需纖維素酶酶液，并將其儲(chǔ)存在纖維素酶存儲(chǔ)罐3 中以備用。 所制纖維素酶酶液的酶活分別為：FPA 酶活981.67 u/mL，Cx 酶活3083.19 u/mL，Cb 酶活為27.79 u/mL，Cl 酶活571.42 u/mL。

酶促打漿工藝：紙漿為思茅松硫酸鹽漿，將纖維素酶存儲(chǔ)罐3 中的酶液通過(guò)計(jì)量泵以7 u/g 的酶用量(以FPA 酶活為單位)輸送到紙漿反應(yīng)池4，對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)處理，處理?xiàng)l件為漿濃10%、溫度50 ℃、pH=7.8(紙漿本身pH 值)、處理時(shí)間1 h，經(jīng)纖維酶處理以后的紙漿輸送到盤(pán)磨機(jī)5 進(jìn)行打漿。

實(shí)施例2

比照漿樣分別采用空白漿樣和商品纖維素酶酶促打漿漿樣。 按本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備空白漿樣， 即不使用本發(fā)明的纖維素酶對(duì)紙漿進(jìn)行打漿。 在相同處理?xiàng)l件下， 采用商品纖維素酶進(jìn)行酶促打漿。

按照國(guó)家紙漿物理性能檢測(cè)方法， 測(cè)定本發(fā)明打漿漿樣、 空白漿樣和商品纖維素酶打漿漿樣的物理性能，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同漿樣的物理性能

從表1 中可以看出， 本發(fā)明的酶處理漿樣能夠明顯降低磨漿機(jī)負(fù)荷， 從而節(jié)省磨漿能耗， 節(jié)能約25%，與商品纖維酶打漿的節(jié)能值相當(dāng)，并且紙漿的物理性能沒(méi)有受到太大影響。

采用里氏木霉發(fā)酵纖維素酶進(jìn)行速生材硫酸鹽漿酶促打漿，其工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備投資少、成本低、工藝流程緊湊，具有降低打漿能耗的效果，適合應(yīng)用于我國(guó)現(xiàn)有造紙?jiān)辖Y(jié)構(gòu)狀況下的制漿原料的打漿工藝。