Gankyrin促進(jìn)乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移和腫瘤干細(xì)胞特征的研究

牛明 于歌

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計在世界范圍內(nèi)每年大約2 088 849新發(fā)病例和626 679死亡病例[1]。盡管手術(shù)、放化療等治療方式不斷進(jìn)步，但乳腺癌的生存率并沒有顯著的改善[2]。因此，需要從基因水平方面發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤標(biāo)記物，為乳腺癌的治療提供靶點，進(jìn)一步改善乳腺癌患者的生存率。

Gankyrin由重復(fù)的ankyrin序列構(gòu)成[3]。研究表明Gankyrin可以結(jié)合并磷酸化Rb，釋放激活的轉(zhuǎn)錄因子E2F1[4-5]。Gankyrin能夠通過與MDM2結(jié)合，介導(dǎo)泛素/26S蛋白酶體對p53的降解[6]。在DEN誘導(dǎo)的小鼠模型中，Gankyrin促進(jìn)C/EBP蛋白泛素化誘導(dǎo)肝癌發(fā)生[7]。體內(nèi)實驗也驗證了Gankyrin可以降解Rb、P53、C/EBP和HNF4導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[8]。另外，Gankyrin可以通過激活Ras通路促進(jìn)肺癌發(fā)生[9]。近期研究還發(fā)現(xiàn)Gankyrin參與糖酵解和谷氨酰胺代謝加快腫瘤進(jìn)展[10-11]。Gankyrin在多種癌癥組織中過表達(dá)，包括乳腺癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]、肝癌[14]、結(jié)直腸癌[15]和食管癌[16]。然而Gankyrin表達(dá)與乳腺癌患者的臨床病理因素及作用機(jī)制尚不明確。本研究先通過數(shù)據(jù)庫分析Gankyrin與乳腺癌患者臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性，再利用乳腺癌細(xì)胞系敲減和過表達(dá)分析Gankyrin在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

通過UALCAN(http：//ualcan.path.uab.edu/)，GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn)，Kaplan-Meier Plot(http：//kmplot.com)分析Gankyrin在乳腺癌患者中基因表達(dá)情況及其與患者總生存期(Overall survival，OS)和無進(jìn)展生存期(Progression free survival，PFS)的相關(guān)性。通過MethHC tool(http：//methhc.mbc.nctu.edu.tw)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中Gankyrin基因及啟動子甲基化的相關(guān)性。OS為隨機(jī)化開始至死亡的時間；PFS指隨機(jī)化開始至腫瘤進(jìn)展或死亡的時間。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

乳腺癌細(xì)胞系BT549和MDA-MB-231購買于上海中科院細(xì)胞庫，細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并于37℃含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)。在BT549細(xì)胞轉(zhuǎn)染Gankyrin過表達(dá)病毒和陰性對照病毒，得到對照組549Flag細(xì)胞和過表達(dá)組549Ad-Gankyrin細(xì)胞。在MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染RNA干擾siGENOME SMARTpools和Non-Targeting siRNA各0.1 μM，得到對照組231NC細(xì)胞和敲減組231siGankyrin細(xì)胞。

1.3 實時熒光定量PCR

利用TRIzol提取細(xì)胞RNA，利用PrimeScriptTM RT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照SYBR?Premix Ex TaqII RT-PCR試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。引物合成購自長春庫美公司。引物序列為：Gankyrin：F 5′-AGCAGCCAAGGG-TAACTTGA-3′；R 5′-CCAGCAGTTTTGCTTCTTCC-3′；GAPDH：F 5′-GGA-GCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，R 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.4 CCK-8實驗

將細(xì)胞置于96孔板每孔接種細(xì)胞2 000個。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后加入CCK-8試劑，1 h后利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 流式細(xì)胞檢測

利用APC-CD44和PE-CD24，用預(yù)冷的PBS將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞洗滌3遍后，離心收集，加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，按照說明各加入5 μL的PC-CD44和PE-CD24孵育10～15 min，利用FACSCanto II檢測CD24-/CD44+細(xì)胞比例。

1.6 遷移和侵襲檢測

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于Tanswell小室上室(104個/孔)，下室加入含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將小室用結(jié)晶紫染色后PBS清洗，利用顯微鏡選取5個良好視野拍照計數(shù)，取平均值計算細(xì)胞遷移的最終結(jié)果。小室上加入基質(zhì)膠重復(fù)上述步驟計算細(xì)胞侵襲的結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析，組間多重比較用SNK法，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gankyrin在乳腺癌過表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

首先通過UALCAN分析Gankyrin在乳腺癌中的表達(dá)情況。結(jié)果表明與正常乳腺組織相比，Gankyrin在乳腺癌組織中高表達(dá)(圖1A)(P<0.01)，同時Gankyrin高表達(dá)與較差的OS明顯相關(guān)(圖1B)(P=0.004)。為了進(jìn)一步驗證上述結(jié)論，利用GEPIA分析發(fā)現(xiàn)，Gankyrin高表達(dá)與患者較差OS明顯相關(guān)(圖1C)(P=0.004)。Kaplan-Meier Plot分析顯示Gankyrin高表達(dá)患者其PFS(圖1D)(P<0.001)和OS(圖1E)(P=0.062)都較差。因此，Gankyrin可以作為乳腺癌患者預(yù)測預(yù)后的標(biāo)志物。

2.2 Gankyrin的表達(dá)與啟動子甲基化的關(guān)系

本研究利用MethHC tool分析乳腺癌及乳腺正常組織中Gankyrin啟動子甲基化水平。結(jié)果表明，與乳腺癌組織相比，乳腺癌中Gankyrin啟動子甲基化水平較低(圖2A)(P<0.01)，并且乳腺組織及癌組織中Gankyrin的甲基化水平與其mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖2B)(r=-0.258，P<0.01)，表明Gankyrin在乳腺癌組織表達(dá)水平升高部分是由于其啟動子低甲基化所導(dǎo)致的。

2.3 Gankyrin與乳腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)系

在MDA-MB-231細(xì)胞系進(jìn)行Gankyrin敲減后，與對照組相比，敲減組Gankyrin mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)(圖3A)。CCK-8結(jié)果表明兩組細(xì)胞活力值存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=4.622，P=0.032)，5天后敲減組細(xì)胞增殖明顯低于對照組(P<0.01)(圖3B)。在BT-549細(xì)胞系進(jìn)行Gankyrin過表達(dá)后，與對照組相比，高表達(dá)組Gankyrin mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.01)(圖3A)。CCK-8結(jié)果表明兩組細(xì)胞活力值存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=49.101，P=0.006)，5天后過表達(dá)組細(xì)胞增殖明顯高于對照組(P<0.01)(圖3C)。

圖1 乳腺癌患者Gankyrin的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系Figure 1 The high expression of Gankyrin was related to the poor prognosis of patients with breast cancerNote：A.The expression of Gankyrin in normal breast tissues and breast cancer tissues；B.The expression of Gankyrin in breast cancer based on lymph node metastases；C.The expression of Gankyrin in breast cancer based on the stages；D.Effect of Gankyrin expression on breast cancer patient survival；E.The expression of Gankyrin and survival analysis was performed by GEPIA；F and G.Survival analysis of Gankyrin in breast cancer was performed at the online website Kaplan-Meier Plotter.**P<0.01，when compared with the normal group.

圖2 Gankyrin啟動子甲基化與其在乳腺癌表達(dá)的關(guān)系Figure 2 The Gankyrin promoter was hypermethylated in breast cancer tissues in the TCGA databaseNote：A.Comparison of average methylation values of Gankyrin gene in normal and breast cancer samples；B.The correlation between promoter methylation value and mRNA expression of Gankyrin in breast cancer by Pearson.**P<0.01，when compared with the normal group.

圖3 Gankyrin促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖Figure 3 The effect of Gankyrin on cell proliferation of breast cancerNote：A.Knockdown and overexpression efficiencies of Gankyrin were confirmed by qPCR；B.Gankyrin silencing inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells；C.Overexpression of Gankyrin promoted the proliferation ability in BT-549 cells.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

2.4 Gankyrin與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的關(guān)系

Transwell結(jié)果顯示敲減Gankyrin可以降低MDA-MB-231細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力(圖4A，圖4B)(P<0.01)。而過表達(dá)Gankyrin能促進(jìn)BT-549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力(圖4C，圖4D)(P<0.05)。

圖4 Gankyrin促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲Figure 4 Gankyrin promoted the migration and invasion of breast cancer cellsNote：A.and B.The Changes of cell migration and invasion abilities were measured after Gankyrin silencing in MDA-MB-231 cells；C.and D.The Changes of cell migration and invasion abilities were measured after Gankyrin overexpression in BT-549 cells.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

2.5 Gankyrin與腫瘤干細(xì)胞比例的關(guān)系

CD24-/CD44+細(xì)胞具有乳腺癌腫瘤干細(xì)胞特征。流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，敲降Gankyrin后的MDA-MB-231細(xì)胞中，CD24-/CD44+細(xì)胞比例明顯下降(圖5A)(P<0.01)。而在過表達(dá)Gankyrin的BT-549細(xì)胞中，CD24-/CD44+細(xì)胞比例明顯上升(圖5B)(P<0.01)。

圖5 Gankyrin增加乳腺癌腫瘤干細(xì)胞比例Figure 5 Gankyrin increased the percentage of cancer stem cell populationNote：A.Knockdown Gankyrin decreased CD24-/CD44+ proportion in MDA-MB-231 cells；B.Overexpression Gankyrin increased CD24-/CD44+ proportion in BT-549 cells.**P<0.01，when compared with the control group.

3 討論

Gankyrin又名p28GANK，或26S蛋白酶體非ATP酶亞基(PSMD10)，位于人類染色體Xq22.3上，全長約1.5 kb，編碼由226個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。Gankyrin最初發(fā)現(xiàn)于肝癌，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中過表達(dá)并與患者較差的預(yù)后相關(guān)，包括子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、食管癌和肝癌等[13，15-18]。Gankyrin可以抑制P53及Rb等多種抑癌基因，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，同時其可以調(diào)控多種信號通路。研究表明Gankyrin過表達(dá)可以激活A(yù)KT信號通路，不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[19]，而且還能夠提高β-catenin活性，促進(jìn)腫瘤形成[20]。Gankyrin可以激活STAT3信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，同時上調(diào)CyclinD1表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[14，17]。Gankyrin與NF-kB/RelA相互作用，抑制NF-kB/RelA向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制其活性[21]。因此，Gankyrin可以參與多種信號通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。

本研究結(jié)果顯示，與正常乳腺組織相比，Gankyrin在乳腺癌組織中表達(dá)明顯增高，我們進(jìn)一步分析了Gankyrin表達(dá)與表觀遺傳的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織Gankyrin表達(dá)增高與其啟動子甲基化水平較低具有相關(guān)性。利用多個數(shù)據(jù)庫分析Gankyrin表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示Gankyrin高表達(dá)的乳腺癌患者其預(yù)后較差，表明其在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用，可以促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。通過分子實驗表明，Gankyrin可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，這與該基因在其它癌癥的研究結(jié)果相似。眾所周知，腫瘤的轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[22]。Fu等[17]發(fā)現(xiàn)Gankyrin可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。近期研究表明Gankyrin能夠上調(diào)低氧誘導(dǎo)分子和Rac1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[12，23]，本研究結(jié)果進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論。

腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和分化能力，因此具有高致瘤性，對放化療抵抗的特征，其在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Qian等[24]發(fā)現(xiàn)Gankyrin可以通過降解Oct-4維持肝癌腫瘤干細(xì)胞特征。但是該基因是否參與調(diào)控乳腺癌腫瘤干細(xì)胞尚未有報道。乳腺癌腫瘤干細(xì)胞分子標(biāo)志物為CD24-/CD44+，本實驗在乳腺癌細(xì)胞中敲降Gankyrin后，CD24-/CD44+細(xì)胞比例明顯下降；而過表達(dá)該基因后，CD24-/CD44+細(xì)胞比例上升，表明Gankyrin對于維持乳腺癌腫瘤干細(xì)胞特征具有重要作用，其成瘤性及具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，通過分析發(fā)現(xiàn)Gankyrin在乳腺癌表達(dá)增高并且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。乳腺癌組織Gankyrin啟動子甲基化水平降低與其表達(dá)增高明顯相關(guān)。Gankyrin可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，維持腫瘤干細(xì)胞特征。因此，Gankyrin在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，基于Gankyrin關(guān)鍵分子的靶向治療有待進(jìn)一步探索。