狼瘡腎炎小鼠腎組織高遷移率族蛋白B1、Toll樣受體、水通道蛋白的表達(dá)以及三七注射液的干預(yù)機(jī)制▲

唐 宇 黃志敏 吳金玉

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，南寧市 530023，電子郵箱：521101154@qq.com)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多器官、多系統(tǒng)并會(huì)產(chǎn)生自身抗體的自身免疫疾病，全球總發(fā)病率在1.4%～21.9%之間[1]。SLE對(duì)系統(tǒng)的損害中腎臟受累最為常見，狼瘡腎炎是SLE最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是患者死亡的主要原因，大約50%的SLE患者并發(fā)狼瘡腎炎[2]，其中超過25%的狼瘡腎炎患者最終將發(fā)展至慢性腎衰竭[3]。免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎是狼瘡腎炎的主要發(fā)病機(jī)制之一，因此，阻斷免疫復(fù)合物在腎小球沉積，抑制腎小球腎炎的進(jìn)展是治療狼瘡腎炎的關(guān)鍵。目前，西醫(yī)治療狼瘡腎炎以激素、免疫抑制劑為主，必要時(shí)行腎臟替代治療，尚缺乏理想的有效治療手段。中醫(yī)藥防治狼瘡腎炎成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1，HMGB1)/Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號(hào)通路在狼瘡腎炎中發(fā)揮重要作用；水通道蛋白(aquaporin，AQP)在慢性腎衰竭發(fā)生發(fā)展中有重要作用[4]。盡管已經(jīng)明確腎臟組織中存在TLR及AQP的表達(dá)，但目前國(guó)內(nèi)外鮮見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告HMGB1/TLR信號(hào)調(diào)控AQP相互交叉對(duì)話在狼瘡腎炎發(fā)病機(jī)制中的作用。本研究利用理想的狼瘡腎炎模型-MRL-Faslpr小鼠，基于“瘀水互生”理論,探討HMGB1/TLR信號(hào)調(diào)控AQP對(duì)狼瘡腎炎發(fā)生的影響，并分析三七注射液干預(yù)狼瘡腎炎的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 11周齡雌性MRL-Faslpr小鼠15只，體重(192±32)g，購(gòu)自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0005。11周齡健康雄性清潔級(jí)小鼠5只，體重(200±36)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。 小鼠在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，室溫18℃～25℃、 相對(duì)濕度50%～60%、人工12 h晝/夜循環(huán)照明環(huán)境中飼養(yǎng)，用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料、分籠飼養(yǎng)， 每日定時(shí)清洗籠舍，小鼠能自由攝食及飲水。

1.2 主要的儀器、試劑和藥物 兔抗TLR4抗體(貨號(hào)：BA1717)，兔抗TLR7抗體(貨號(hào)：PB0473)，兔抗HMGB1 抗體(貨號(hào)：A00066-1)，兔抗AQP1抗體(貨號(hào)：PB0498)，兔抗AQP2抗體(貨號(hào)：bs-0261R)，兔抗AQP3抗體(貨號(hào)：BA1559)，兔抗β-肌動(dòng)蛋白(內(nèi)參)抗體(貨號(hào)：bs-0061R)，均購(gòu)自博士德生物工程有限公司；兔抗TLR9 抗體(Abcam公司，貨號(hào)：ab52967)，山羊抗兔的二抗(北京博奧森，貨號(hào)：ZB2301)，RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(北京索萊寶公司，貨號(hào)：R0020,P0100)，蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司，貨號(hào)：P0012S)，TRIzol試劑(Invitrogen公司，目錄編號(hào)：15596-026)，TIANScript RT Kit(天根生物科技有限公司，目錄編號(hào)： KR104-02)，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根生物科技有限公司，目錄編號(hào)： FP205)，氯仿、異丙醇、無水乙醇購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，型號(hào)ABI7500)，DYCZ-24DN型電泳儀(北京六一公司)，WSE-400型半干轉(zhuǎn)膜儀(日本ATTO公司)。電泳系統(tǒng)(Mini-protien Tetra System，Bio-Rad公司)，SNJ-1型凝膠成像儀(ChemiDoc XRS+ System，Bio-Rad公司)。

1.3 分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將15只MRL-Faslpr小鼠分為模型組、三七組、 HMGB1抗體組，每組5只。另取5只相同周齡清潔級(jí)小鼠為正常對(duì)照組。模型組、正常對(duì)照組分別予生理鹽水10 mL/(kg·d)腹腔注射；三七組給予三七注射液(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，100 mL/瓶，含生藥20 g/100 mL)2 g/(kg·d)腹腔注射； HMGB1抗體組給予HMG1/HMGB1單克隆抗體(艾美捷Abnova，貨號(hào)：MAB8971)1 mg/(kg·d)腹腔注射。均1次/d，4組小鼠在連續(xù)給藥6周后處死，摘除左腎，放入液氮保存以檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 腎組織HMGB1、TLR、AQP蛋白的檢測(cè)：采用免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠腎組織HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9以及AQP1、AQP2、AQP3蛋白的表達(dá)水平。取30 mg腎組織，加入1 000 μL RIPA蛋白裂解液，充分混勻，裂解2～3 h，12 000 r/min離心20 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。用考馬斯亮藍(lán)法蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣本蛋白濃度。將樣品加入相應(yīng)4×上樣緩沖液,100℃煮沸10 min，12 000 r/min離心1 min，根據(jù)目的蛋白分子量大小配制不同濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，膠凝固后，上樣蛋白以恒壓80 V，30 min之后恒壓120 V，1 h進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠從玻板上取下，裝配轉(zhuǎn)膜三明治，以300 mA恒流轉(zhuǎn)60 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)室溫封閉膜2 h；用新配制的封閉液稀釋一抗，兔抗AQP1抗體、兔抗AQP2抗體、兔抗AQP3抗體、TLR4抗體、兔抗TLR7抗體、兔抗TLR9 抗體、兔抗HMGB1抗體、兔抗β-肌動(dòng)蛋白抗體稀釋比分別為1 ∶400、1 ∶500、1 ∶200、1 ∶200、1 ∶400、1 ∶1 000、1 ∶200、1 ∶1 000。4℃，一抗孵育過夜；用TBST洗膜3次，5 min/次；用封閉液稀釋各蛋白一抗對(duì)應(yīng)的二抗(兔二抗1 ∶1 000)，室溫下孵育二抗1 h。用TBST洗膜3次，5 min/次；在暗室中將膜置于平鋪好的保鮮膜上，按1 ∶1比例混合A液和B液(ECL發(fā)光液，SC2048)，將混合液均勻滴加于膜上，反應(yīng)60 s。將膜放在吸水紙上瀝干多余的ECL底物反應(yīng)液，置于平板上，鋪上保鮮膜，用保鮮膜包裹聚偏氟乙烯膜(避免產(chǎn)生氣泡)，放入暗盒，再放上適當(dāng)大小的X光片，關(guān)閉暗盒，曝光。取出X光片，放入顯影液中，待條帶顯好后取出，在清水中漂洗，放入定影液中定影。取出X光片，晾干、拍照。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 腎組織HMGB1、TLR、AQP mRNA的檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)各組小鼠腎組織HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9、AQP1、AQP2、AQP3 mRNA的表達(dá)。取30～100 mg腎組織，利用TRIzol試劑提取組織樣本中總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行操作，取1 μL RNA用Denovix超微量紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)丹諾爾公司)檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量，取5 μL RNA 1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。用TIANScript RT Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行操作。獲得cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×SuperReal PreMix Plus 10 μL、上游引物(10 μM)0.6 μL、下游引物(10 μM)0.6 μL、cDNA 100 ng、50×ROX Reference Dye△ 0.4 μL，加RNase-Free ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)，95℃ 10 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，同時(shí)在60℃～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。 根據(jù)RT-PCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。目的基因和內(nèi)參基因引物見表1。

表1 基因引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey HSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)(Kruskal-Wallis)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組腎組織HMGB1/TLR蛋白及mRNA表達(dá)量的比較 與正常對(duì)照組比較，模型組及兩個(gè)給藥組HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9的蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，三七組與 HMGB1抗體組的HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9的蛋白及mRNA表達(dá)量均降低(均P<0.05)。見表2、表3及圖1。

表2 4組小鼠腎組織HMGB1及TLR蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

表3 4組小鼠腎組織HMGB1及TLRmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

圖1 各組腎組織TLR、HMGB1、AQP蛋白表達(dá)

2.2 4組腎組織AQP蛋白及mRNA表達(dá)量的比較 與正常對(duì)照組比較，模型組及兩個(gè)給藥組的AQP1、AQP2、AQP3的蛋白和mRNA表達(dá)量均升高(均P<0.05)；與模型組比較，三七組與 HMGB1抗體組的AQP蛋白、mRNA水平均降低(均P<0.05)。見表4、表5及圖1。

表4 4組小鼠腎組織AQP蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s，n=5)

表5 4組小鼠腎組織AQPmRNA表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

狼瘡腎炎屬于中醫(yī)學(xué)“水腫”“陰陽(yáng)毒”“蝴蝶斑”“關(guān)格”“血癥”等范疇?！澳I虛”“濕阻”和“血瘀”為狼瘡腎炎的主要病機(jī)[5]，其中以“腎虛”為根本，內(nèi)生水濕及瘀血加速了病情的進(jìn)展，瘀血阻滯是其病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]，也是直接損害腎臟組織并促進(jìn)病情發(fā)展的關(guān)鍵因素，水液代謝障礙是疾病最終結(jié)局。研究表明，AQP1、AQP2、AQP3與腎臟調(diào)節(jié)水重吸收功能密切相關(guān)，而中醫(yī)理論的腎臟在水液代謝中的作用與AQP的生理特性極為相似，其中這可能是中醫(yī)“腎主水”的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。因此，基于“瘀水互生”中醫(yī)理論基礎(chǔ)，我們分析狼瘡腎炎小鼠腎組織HMGB1、TLR、AQP的表達(dá)，探討狼瘡腎炎的可能病理機(jī)制及三七注射液對(duì)HMGB1、TLR、AQP表達(dá)的影響。

HMGB1是一種參與細(xì)胞核內(nèi)多種生物學(xué)功能的核內(nèi)蛋白，通過與DNA結(jié)合以穩(wěn)定核小體，參加 DNA 轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、基因表達(dá)與調(diào)控等多種生命活動(dòng)。HMGB1與TLR結(jié)合能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟，產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，而且成熟的樹突狀細(xì)胞表面共同刺激分子能提供“第二信號(hào)”給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并通過激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而參與SLE所致的腎臟損害[8-11]。其中TLR4、TLR7、TLR9與SLE的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，TLR的活化導(dǎo)致前炎性因子表達(dá)增加，其可能可以反映狼瘡腎炎疾病的嚴(yán)重程度[12-13]。Patole等[14]發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎小鼠浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的腎組織TLR9表達(dá)明顯增加，TLR9的活化與狼瘡腎炎進(jìn)展相關(guān)；Ehlers等[15]研究發(fā)現(xiàn)TLR9的活化能促進(jìn)IgG2a和IgG2b抗體識(shí)別宿主產(chǎn)生的DNA，從而進(jìn)一步加重SLE的發(fā)展；而Pacheco等[16]發(fā)現(xiàn)，TLR7基因拷貝數(shù)變異和TLR7 mRNA水平增加是女性SLE進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。TLR7與其配體之間的相互作用可以直接激活樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，從而擴(kuò)大T細(xì)胞和B細(xì)胞識(shí)別自身特異性抗原效應(yīng)，進(jìn)一步加重SLE免疫反應(yīng)[15]。有研究顯示，TLR4過度表達(dá)可以導(dǎo)致自身免疫性腎小球腎炎和狼瘡腎炎[16-17]。本研究研究結(jié)果提示，狼瘡腎炎小鼠腎組織中TLR4、TLR7、TLR9、HMGB1蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似，提示HMGB1/TLR通路與狼瘡腎炎的發(fā)生密切相關(guān)。

AQP是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與體液代謝關(guān)系密切的蛋白，是一族位于細(xì)胞膜上的特異性水轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)，與水通透性(吸收、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn))密切相關(guān)，能維持細(xì)胞內(nèi)外水平衡?，F(xiàn)已明確在腎組織中存在8種AQP，即AQP1～4、AQP6～8和AQP11，其中AQP1～3與腎臟調(diào)節(jié)水重吸收功能密切相關(guān)[17-19]。AQP1特異性表達(dá)于腎近曲小管和髓袢降支細(xì)段[20]，參與水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及水平衡調(diào)節(jié)，對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)具有高度選擇性，AQP1缺乏會(huì)導(dǎo)致腎小管重吸收功能障礙[21]；AQP2主要分布于集合管主細(xì)胞管腔膜及細(xì)胞內(nèi)囊泡，其表達(dá)水平及穿梭調(diào)節(jié)與集合管處水重吸收量的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[22]。AQP3在腎間質(zhì)和腎小球周圍的表達(dá)疑似沉積的AQP3免疫復(fù)合物，AQP3是否 作為自身抗原參與了免疫發(fā)病機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究[23]。本研究結(jié)果顯示，狼瘡腎炎小鼠AQP1、AQP2、AQP3蛋白表達(dá)升高，即狼瘡腎炎狀態(tài)下AQP表達(dá)活躍，提示AQP表達(dá)上調(diào)可能與狼瘡腎炎相關(guān)。

HMGB1/TLR信號(hào)通路是調(diào)控各種炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的重要通路，能夠參與SLE的腎臟損害，抑制該通路的表達(dá)能延緩狼瘡腎炎的疾病進(jìn)展。本研究建立了HMGB1抗體組，給予狼瘡腎炎小鼠注射HMG1/HMGB1單克隆抗體，抑制了狼瘡腎炎小鼠腎組織HMGB1的表達(dá)，結(jié)果顯示其腎組織TLR4、TLR7、TLR9、AQP1、AQP2、AQP3 的蛋白及mRNA表達(dá)也隨之下調(diào)。因此，我們推測(cè)HMGB1/TLR信號(hào)調(diào)控AQP表達(dá)可能是狼瘡腎炎小鼠發(fā)病的機(jī)制之一。

目前，研究表明，三七注射液能下調(diào)整合素連接激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、P38絲裂原活化蛋白激酶水平，同時(shí)可下調(diào)Smad3蛋白、TLR1、TLR2蛋白表達(dá)的水平，上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)水平，抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/P38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路活化，干預(yù)Smad蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)補(bǔ)體-炎癥受體系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)抗腎纖維化，從而達(dá)到緩解慢性腎炎發(fā)展到腎衰竭的進(jìn)程[24-27]，但三七注射液能否通過HMGB1/TLR信號(hào)通路降低AQP蛋白表達(dá)，達(dá)到延緩狼瘡腎炎進(jìn)展的目的目前還尚未清楚。因此，本研究使用三七注射液干預(yù)狼瘡腎炎小鼠，觀察三七注射液對(duì)HMGB1/TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白和AQP蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步分析三七注射液在治療狼瘡腎炎中的作用機(jī)制。結(jié)果顯示三七組小鼠腎組織中HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9、AQP1、AQP2、AQP3 的蛋白及mRNA表達(dá)水平均較模型組降低。因此，我們推測(cè)三七注射液可能是通過下調(diào)HMGB1/TLR信號(hào)通路表達(dá)水平，降低AQP蛋白的表達(dá)水平，來實(shí)現(xiàn)治療狼瘡腎炎和延緩狼瘡腎炎疾病進(jìn)展的目的。

綜上所述，狼瘡腎炎小鼠腎組織的TLR4、TLR7、TLR9、HMGB1、AQP表達(dá)水平均升高，HMGB1/TLR信號(hào)調(diào)控AQP表達(dá)可能是狼瘡腎炎的發(fā)生機(jī)制之一；三七注射液可能通過干預(yù)HMGB1/TLR信號(hào)調(diào)控AQP表達(dá)發(fā)揮治療狼瘡腎炎的作用。