儲(chǔ)存時(shí)間、銅源及其添加水平對(duì)脂溶性維生素穩(wěn)定性的影響

孔凡科 ，郭吉原，楊 青，周桂蓮，張 敏，燕 磊,3,4，孫春華

（1.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東青島 266100；2.畜禽飼料與畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610101；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610101；4.濰坊新希望六和飼料科技有限公司，山東濰坊 261100）

銅作為動(dòng)物體內(nèi)重要的微量元素，對(duì)促進(jìn)動(dòng)物的生理代謝[1]及增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力[2]具有非常重要的作用，是動(dòng)物飼料中不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)成分。維生素則是維持動(dòng)物繁殖性能及健康生長(zhǎng)的關(guān)鍵養(yǎng)分，動(dòng)物體內(nèi)缺乏維生素會(huì)導(dǎo)致維生素缺乏癥[3]。影響復(fù)合預(yù)混合飼料中維生素穩(wěn)定性的因素有多種，其中微量元素對(duì)維生素的穩(wěn)定性具有較強(qiáng)的破壞作用[4]。目前飼料廠常用的銅源主要有硫酸銅、堿式氯化銅。段俊紅等[5]研究表明，微量元素的添加量與維生素A 的損失率呈顯著正相關(guān)。趙金偉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，銅、鐵、錳、鋅4 種微量元素對(duì)預(yù)混料中維生素A 的破壞程度為錳＜鋅＜鐵＜銅?？梢娿~元素對(duì)飼料中脂溶性維生素的穩(wěn)定性有重要影響。國內(nèi)外的相關(guān)研究主要從多種微量元素的組合作用及動(dòng)物養(yǎng)殖試驗(yàn)方面考察飼料中微量元素對(duì)脂溶性維生素的影響。尚未發(fā)現(xiàn)只針對(duì)銅源與脂溶性維生素相互作用方面的研究。本試驗(yàn)選用五水硫酸銅和堿式氯化銅作為銅源，以磷酸氫鈣作為載體，分別添加同等量的維生素A、維生素D3、維生素E，研究不同銅源在不同處理時(shí)間和不同添加水平條件下對(duì)維生素A、維生素D3、維生素E 穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 脂溶性維生素 維生素A 乙酸酯微粒含量為50 萬IU/g；維生素D3乙酸酯微粒含量為50 萬IU/g；維生素E 乙酸酯微粒含量為50%。

1.2 試驗(yàn)銅源及載體 五水硫酸銅（S）含量為25%，堿式氯化銅（J）含量為58%。本試驗(yàn)所用載體為磷酸氫鈣。

1.3 復(fù)合添加劑組成 復(fù)合添加劑中銅的含量參照0.2%豬用微量元素預(yù)混料（銅含量9%）為基準(zhǔn)配制，共設(shè)4 個(gè)添加水平，銅含量分別為4.5%、9%、13.5%、18%；復(fù)合添加劑中維生素A、維生素D3、維生素E含量參照0.3%豬用維生素預(yù)混料中的要求配制，維生素A 為3 167 000 IU/kg、維生素D3為733 000 IU/kg、維生素E 為16 667 mg/kg。復(fù)合添加劑成分組成見表1。

1.3 試驗(yàn)溫度條件及試驗(yàn)分組 控制室溫在（25±2）℃，濕度控制在50%左右，將樣品避光密封保存。以磷酸氫鈣為載體，分別添加3 167 000 IU/kg 維生素A、733 000 IU/kg維生素D3、16 667 mg/kg 維生素E，對(duì)照組不添加銅源，試驗(yàn)組分別添加4.5%、9%、13.5%、18% 五水硫酸銅或堿式氯化銅，每個(gè)處理組3 個(gè)重復(fù)，每份處理樣品約為55 g。儲(chǔ)存處理時(shí)間為8 周。

1.4 試劑及儀器設(shè)備

1.4.1 維生素標(biāo)準(zhǔn)品及試劑 維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品、維生素D3乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國USP，產(chǎn)品標(biāo)識(shí)含量分別為33.4 mg/g、99.6%。維生素E 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma，產(chǎn)品標(biāo)識(shí)含量為98.9%。無水甲醇購自德國Merck，色譜純。

1.4.2 脂溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 以甲醇為溶劑，采用逐級(jí)稀釋法分別將維生素配制成7 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，即維生素A、維生素D3濃度分別為0、5、10、20、50、100、200 IU/mL，維生素E 濃度為0、5、10、20、50、100、200 μg/mL。

1.4.3 儀器與設(shè)備 超高效液相色譜儀（Waters UPLC H-Class）帶PDA 檢測(cè)器（e-λ PDA），恒溫培養(yǎng)箱（SANYO MIR-262），數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE），三維混合機(jī)（SYH-5）。

1.4.4 色譜條件 色譜柱：BEH-C18 色譜柱，內(nèi)經(jīng)2.1 mm，柱長(zhǎng)100 mm，粒徑1.7 μm。流動(dòng)相：98%甲醇水溶液。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣量：2 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：維生素A，326 nm；維生素D3，264 nm；維生素E，285 nm。

1.5 試驗(yàn)步驟

1.5.1 試液的制備 試液的制備參照國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[7-9]：準(zhǔn)確稱取處理好的試驗(yàn)樣品1.0 g（精確至0.000 2 g）于100 mL 棕色容量瓶中，加甲醇60 mL，輕輕搖勻，將容量瓶放于超聲波清洗器中，在60℃條件下，超聲提取30 min，取出，將容量瓶放于通風(fēng)柜中冷卻至室溫，然后用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液1.00 mL于5 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，取1 mL 稀釋液，過0.22 μm 有機(jī)系微孔濾膜于棕色進(jìn)樣瓶中，上機(jī)待測(cè)。

1.5.2 上機(jī)檢測(cè) 將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和制備好的試液按照色譜條件1.4 上機(jī)測(cè)定。

1.6 結(jié)果計(jì)算

1.6.1 脂溶性維生素計(jì)算公式 樣品中的脂溶性維生素（維生素A/維生素D3/維生素E）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（KIU/kg或mg/kg）表示，計(jì)算公式如下：

式中，X為樣品中脂溶性維生素（維生素A/維生素D3/維生素E）的含量，kIU/kg（mg/kg）；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到的試液中脂溶性維生素（維生素A/維生素D3/ 維生素E）的含量，IU/mL（μg/mL ）；m為樣品質(zhì)量（g）；V為樣品稀釋體積（mL）。

1.6.2 損失率計(jì)算公式 樣品中的脂溶性維生素（維生素A/維生素D3/維生素E）損失率的計(jì)算公式如下：

式中，Xi為相同銅源相同銅添加水平下第i個(gè)處理水平的脂溶性維生素（維生素A/維生素D3/維生素E）的檢測(cè)結(jié)果，kIU/kg（mg/kg）；X1為脂溶性維生素（維生素A/維生素D3/維生素E）的理論添加值，kIU/kg（mg/kg）。

1.7 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)處理組不同處理時(shí)間的樣品平行測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，結(jié)果保留3 位有效數(shù)字，采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan's法進(jìn)行極差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖及相關(guān)系數(shù) 由圖1 可以看出，全反式維生素A、順式維生素A、維生素D3、維生素E 分離度良好，峰型對(duì)稱、尖銳，符合檢測(cè)要求。由表2 可以看出，維生素A、維生素D3、維生素E 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)均在0.995 以上，滿足標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的各項(xiàng)要求。

表1 復(fù)合添加劑成分組成 g

圖1 維生素A、D3、E 的檢測(cè)結(jié)果色譜圖

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 主效應(yīng)分析 由表3 可知，銅源對(duì)維生素A 的損失率影響不顯著，對(duì)維生素D3、維生素E 的損失率影響顯著。銅源添加水平及處理時(shí)間對(duì)維生素A、維生素D3、維生素E 的損失率影響顯著。

2.2.1 處理時(shí)間對(duì)脂溶性維生素的影響 由表3 可知，常溫處理1 周，維生素A 的損失率與對(duì)照組沒有顯著差異，維生素D3和維生素E 的損失率較對(duì)照組顯著增加。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，維生素A、維生素D3、維生素E 的損失率先快速上升、然后下降，而后穩(wěn)步增加，維生素A 和維生素E 的損失率在第7 周達(dá)到峰值，分別為17.35%、12.85%，維生素D3的損失率在第8 周達(dá)到峰值，為45.19%。

2.2.2 銅源及其添加水平對(duì)脂溶性維生素的影響 如表3 所示，銅源對(duì)維生素A 的損失率影響不顯著，銅源對(duì)維生素D3、維生素E 影響顯著，五水硫酸銅對(duì)維生素D3的破壞作用顯著大于堿式氯化銅，堿式氯化銅對(duì)維生素E 的破壞作用極顯著大于五水硫酸銅。如表3 所示，常溫條件下，添加銅能夠顯著增加維生素A 的損失率，但銅添加量在4.5%～18% 時(shí)，銅對(duì)維生素A 的損失率沒有顯著影響。銅添加水平對(duì)維生素D3的損失率有顯著影響，銅添加量較低時(shí)（≤4.5%），維生素D3的損失率與對(duì)照組差異不顯著，隨著添加量的增加，維生素D3的損失率顯著增加。銅添加水平對(duì)維生素E 的損失率有顯著影響，維生素E 的損失率隨著銅添加量增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。

表3 處理時(shí)間、銅源及其添加水平對(duì)脂溶性維生素A、D3、E 的影響 %

3 討 論

3.1 處理時(shí)間對(duì)脂溶性維生素的影響 國內(nèi)外研究表明儲(chǔ)存時(shí)間是影響維生素穩(wěn)定性的重要因素。趙金偉等[6]研究表明，復(fù)合預(yù)混合飼料存儲(chǔ)60 d，維生素A 的損失率能達(dá)到24.86%～64.78%。周俊華等[10]曾報(bào)道，儲(chǔ)存120 d 后，添加無機(jī)微量元素的預(yù)混料中維生素A 每月平均損耗約9%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，處理時(shí)間能顯著增加維生素A、維生素D3、維生素E 的損失率，維生素A 和維生素E 的損失率在第7 周達(dá)到峰值，分別為17.35%、12.85%，維生素D3的損失率在第8 周達(dá)到峰值，為45.19%，未見明顯減緩的跡象。因此，復(fù)合預(yù)混合飼料在常溫條件下保存時(shí)間不宜超過6 周。在常溫條件下維生素E 的穩(wěn)定性最好，維生素A 的穩(wěn)定性次之，維生素D3的穩(wěn)定性最差。

3.2 銅源及其添加量對(duì)脂溶性維生素的影響

3.2.1 銅源對(duì)脂溶性維生素的破壞作用 氯化銅、硫酸銅、氫氧化銅、堿式氯化銅為常見固體催化劑，在特定條件下能夠催化烯烴發(fā)生氧化還原反應(yīng)[11]。銅離子能夠催化產(chǎn)生活性氧，活性氧能引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而對(duì)維生素造成破壞[12]。維生素A 乙酸酯是由視黃醇和乙酸通過酯化反應(yīng)生成，視黃醇是一種類異戊二烯分子，是由異戊二烯構(gòu)件分子生物合成的[13]，在空氣中易被氧化，高溫高濕及堿性條件下，維生素A 在堿式氯化銅中殘留的氯化銅和氫氧化銅的催化下，會(huì)加速維生素的變性與失活。維生素D3是甾族化合物，為己三烯衍生物，又稱膽鈣化醇[14]，有3 個(gè)雙鍵，性質(zhì)較活躍，容易受到銅鹽和堿的催化作用而失活。維生素E 又稱生育酚，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上為苯并二氫吡喃的衍生物，以α-生育酚活性最高。在高溫高濕及堿性條件下，苯羥基易發(fā)生取代反應(yīng)，而使其失活。林月霞等[15]報(bào)道，飼料中堿式氯化銅源對(duì)維生素E 穩(wěn)定性的影響明顯優(yōu)于硫酸銅源。本試驗(yàn)結(jié)果表明，銅源對(duì)維生素A 的損失率影響不顯著，對(duì)維生素D3、維生素E 影響顯著，五水硫酸銅對(duì)維生素D3的破壞作用顯著大于堿式氯化銅，損失率偏高約4.7%，堿式氯化銅對(duì)維生素E 的破壞作用顯著大于五水硫酸銅，損失率偏高約2.1%。造成這種現(xiàn)象的原因可能是：堿式氯化銅及其中含有的少量氯化銅、氫氧化銅及銨鹽等對(duì)維生素E 的催化作用要強(qiáng)于五水硫酸銅，五水硫酸銅對(duì)維生素D3的催化作用要強(qiáng)于堿式氯化銅。

因此，在常溫地區(qū)使用五水硫酸銅生產(chǎn)復(fù)合預(yù)混合飼料對(duì)維生素E 較為穩(wěn)定，使用堿式氯化銅生產(chǎn)復(fù)合預(yù)混合飼料對(duì)維生素D3較為穩(wěn)定，營(yíng)養(yǎng)師可以根據(jù)飼料產(chǎn)品的實(shí)際情況選擇銅源進(jìn)行飼料配方設(shè)計(jì)。

3.2.3 銅源添加水平對(duì)脂溶性維生素的影響 段俊紅等[5]研究結(jié)果表明，堿式碳酸銅的添加量對(duì)維生素A 的損失率影響極為顯著。孫海霞[16]研究表明，提高銅添加量對(duì)維生素A 的損失率影響不顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明，常溫條件下，添加銅源能夠顯著增加維生素A、維生素D3及維生素E 的損失率，隨著銅添加量的增加（≥4.5%）維生素A 的損失率沒有顯著變化，維生素D3的損失率隨著銅添加量的增加顯著增加，維生素E 的損失率隨著添加量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。因此，在復(fù)合預(yù)混合飼料中要將脂溶性維生素D3的損失率控制在20%以內(nèi)，銅的添加量建議控制在4.5%以下。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，隨著存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)，維生素A、維生素D3、維生素E 的損失率顯著增加，復(fù)合預(yù)混合飼料在常溫條件下保存時(shí)間不宜超過6 周；銅源對(duì)維生素A的損失率影響不顯著，對(duì)維生素D3、維生素E 影響顯著，在低溫干燥的地區(qū)使用五水硫酸銅生產(chǎn)復(fù)合預(yù)混合飼料對(duì)維生素E 較為穩(wěn)定，使用堿式氯化銅生產(chǎn)復(fù)合預(yù)混合飼料對(duì)維生素D3較為穩(wěn)定；常溫條件下，添加銅源能夠顯著增加維生素A、維生素D3及維生素E 損失率，復(fù)合預(yù)混合飼料中銅的添加量應(yīng)控制在4.5%以內(nèi)。