地中海貧血患者血漿環(huán)狀RNA的篩查及結(jié)果分析

周獻(xiàn)青，張?jiān)溃秩A，薛雯，陳潔晶，歐明林

中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二四醫(yī)院檢驗(yàn)科廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541002

地中海貧血(thalassmeia，簡(jiǎn)稱地貧)是因珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致血紅蛋白中相應(yīng)珠蛋白肽鏈合成缺失或不足，最終引起溶血性貧血等病理狀態(tài)[1]。據(jù)資料顯示，地貧在廣西人群中有較高發(fā)病率[2]，嚴(yán)重威脅人類健康。

環(huán)狀RNA(circRNA)是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型的內(nèi)源性非編碼RNA，由前體mRNA 下游序列(3'端)與其上游的RNA 序列(5'端)反向剪切形成環(huán)形結(jié)構(gòu)[3]。circRNA在真核細(xì)胞中具有豐富、保守及穩(wěn)定的特性，在生物體內(nèi)調(diào)控靶基因的表達(dá)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)生成。越來(lái)越多的研究證明，circRNA 可通過(guò)發(fā)揮其在生物學(xué)上的功能來(lái)參與疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等人類多種疾病中具有重要作用，在成為疾病預(yù)防、診斷、治療及預(yù)后的新型生物標(biāo)志物上顯示巨大潛力[4-8]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與學(xué)者們對(duì)circRNA 的認(rèn)識(shí)不斷加深，circRNA 與血液疾病的關(guān)系也逐漸被發(fā)現(xiàn)，影響疾病發(fā)生發(fā)展，本研究擬通過(guò)基因芯片法檢測(cè)地貧患者外周血中差異表達(dá)的circRNA，期望發(fā)現(xiàn)地貧診斷的潛在標(biāo)志物，為疾病診斷方法的建立提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1～12 月年桂林第924 醫(yī)院入院治療的α-地貧東南亞缺失型患者10 例作為實(shí)驗(yàn)組，男性3 例，女性 7 例，年齡(35.5±7)歲，均符合地貧診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)配對(duì)原則，設(shè)置對(duì)照組為健康體檢合格人群10例，男性5例，女性5例，年齡(31.1±4.0)歲。兩組受檢者清晨空腹抽取外周血3.5 mL。本研究方案經(jīng)廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol (美國(guó)Invitrogen公司)，PCR 試劑盒(美國(guó)Takara公司)，RNA酶抑制劑試劑盒 (美 國(guó) Epicentre 公 司)，SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase(美國(guó)Invitrogen公司)，Primer(中國(guó)英駿生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR 儀(美國(guó)BIO-Rad公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，DNA 微陣列掃描儀(美國(guó)Agilent 公司)，超凈工作臺(tái)(上海上凈凈化設(shè)備有限公司)；基因芯片AS-S-CR-H-V2.0 (Arraystar公司)。

1.3 方法

1.3.1 血漿提取 將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血樣置于高速離心機(jī)中，3 500 r/min，離心5 min。離心后取出，在超凈工作臺(tái)上使用移液槍吸取上層淡黃色血漿500 μL，保存于無(wú)菌的EP管中，超低溫冰箱保存待用。提取的血漿分兩份，一份用作基因芯片法初篩與相關(guān)的circRNA，另一份用作熒光定量PCR法驗(yàn)證篩選的circRNA。

1.3.2 基因芯片法篩選差異表達(dá)circRNA 通過(guò)NanoDrop ND-1000測(cè)定樣品總RNA樣品的純度和濃度，RNA質(zhì)控結(jié)果見表1。提取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血漿總RNA，利用基因芯片AS-S-CR-H-V2.0 進(jìn)行標(biāo)記基因序列雜交。首先，用Rnase R (E picentre，Inc.)消化酶解樣品總RNA，去除線性RNA，富集circRNARNA。第二，利用隨機(jī)引物法擴(kuò)增樣品circRNA 轉(zhuǎn)錄cRNA，并進(jìn)行熒光標(biāo)記；RNeasy Mini Kit (Qiagen)對(duì)標(biāo)記的cRNAs進(jìn)行純化處理；利用NanoDrop ND-1000測(cè)量成功標(biāo)記的cRNA(pmol Cy3/μg cRNA)的濃度比活性。第三，在5 μL 10×阻斷劑和1 μL 25×裂解緩沖液中添加1 μg標(biāo)記cRNA以進(jìn)行片段處理，60℃孵育30 min，后加入25 μL 2×雜交緩沖進(jìn)行稀釋。第四，吸取50 μL雜交溶液滴加在circRNA 基因芯片載玻片，65℃孵育17 h。最后，對(duì)circRNA 基因芯片進(jìn)行清洗、固定、掃描，提取芯片數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，尋找實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異表達(dá)的circRNA，通過(guò)Fold Change進(jìn)行篩選circRNA，驗(yàn)證差異倍數(shù)較大circRNA。

表1 總RNA的定量和質(zhì)控結(jié)果

1.3.3 熒光定量PCR 驗(yàn)證 提取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血漿總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)上一步篩選差異表達(dá)的circRNA，使用Primer 5.0，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，見表 2。PCR 反應(yīng)體系：2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L的PCR特異引物F 0.5 μL，10 μmol/L 的PCR特異引物R 0.5 μL，cDNA 2 μL，加水至總體積為 10 μL。按照PCR 操作步驟進(jìn)行擴(kuò)增，95℃，10 min；40個(gè)PCR循環(huán)[95℃，10 s；60℃，60 s(收集熒光)]。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按95℃，10 s-60℃，60 s-95℃，15 s的順序加熱；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動(dòng)進(jìn)行-Ramp Rate為0.05℃/s)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，將閾值手定設(shè)定在0.015。

表2 引物序列表

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用R 軟件limma 軟件包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化及數(shù)據(jù)處理。通過(guò)散點(diǎn)圖、聚類熱圖等表現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA。通過(guò)生物信息學(xué)Circular RNA Interactome 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://circinteractome.nia.nih.gov/)對(duì)上、下調(diào) circRNA 進(jìn)行 miRNA 預(yù)測(cè)。circRNA 驗(yàn)證以管家基因β-actin 作為內(nèi)參基因，取平均 Ct 值作為該樣本最后 Ct 值，計(jì)算 2-ΔΔCt值反映驗(yàn)證circRNA表達(dá)水平。以管家基因β-actin(不同circRNA 的表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參，以地貧組circRNA 待測(cè)基因的值除以此樣品內(nèi)參的值，最終得到的比值該待測(cè)基因相對(duì)含量，倍數(shù)為地貧組的相對(duì)表達(dá)量除以對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組設(shè)定是1，上調(diào)表達(dá)閾值大于1，下調(diào)表達(dá)閾值大于0小于1。

2 結(jié)果

2.1 circRNA篩查數(shù)據(jù) 通過(guò)基因芯片法分析地貧實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組血漿中circRNA的相對(duì)表達(dá)水平，熒光信號(hào)清晰且無(wú)邊緣化效應(yīng)，背景強(qiáng)度低，結(jié)果可靠。經(jīng)芯片掃描后，共檢測(cè)到8 312個(gè)circRNA，如果以2.0倍為標(biāo)準(zhǔn)閾值，差異表達(dá)84個(gè)circRNA，47 個(gè)上調(diào)表達(dá)circRNA(＞2.0)，37個(gè)下調(diào)表達(dá)circRNA(＜-2.0)。表3整理了差異表達(dá)前10個(gè)上調(diào)circRNA，有hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_100789等，以及差異表達(dá)前10 個(gè)下調(diào)circRNA，有hsa_circRNA_001496、 hsa_circRNA_402563、hsa_circRNA_405439等。通過(guò)Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的進(jìn)行circRNA進(jìn)行靶miRNA預(yù)測(cè)。表4整理了部分差異表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)circRNA與其靶miRNA。通過(guò)圖1散點(diǎn)圖可知，X軸代表健康對(duì)照組，Y軸代表地貧實(shí)驗(yàn)組，綠線代表1.5倍變化閾值。在綠線上方說(shuō)明circRNA上調(diào)表達(dá)超過(guò)1.5倍，在綠線下方說(shuō)明circRNA下調(diào)表達(dá)超過(guò)1.5倍，存在部分circRNA上調(diào)表達(dá)超過(guò)1.5倍，下調(diào)表達(dá)超過(guò)1.5倍。

表3 地貧患者血漿前10個(gè)差異表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)的circRNA

表4 部分差異表達(dá)的上/下調(diào)circRNA 與其靶miRNA

2.2 circRNA 驗(yàn)證數(shù)據(jù) 為了進(jìn)一步研究篩選出來(lái)差異表達(dá)的circRNA 在地貧患者中的真實(shí)表達(dá)，隨即通過(guò)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出來(lái)的circRNA進(jìn)行驗(yàn)證。circRNA驗(yàn)證結(jié)果見表5，由相對(duì)表達(dá)量及表達(dá)倍數(shù)可知，差異表達(dá)的上調(diào)circRNA 是hsa_circRNA_100790，差異表達(dá)的下調(diào)circRNA 是 hsa_circRNA_001496，其表達(dá)趨勢(shì)與初篩結(jié)果一致。hsa_circRNA_100790與hsa_circRNA_001496熔解曲線見圖2，無(wú)特異性擴(kuò)增。

圖1 差異表達(dá)的circRNA

表5 驗(yàn)證circRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖2 hsa_circRNA_100790和hsa_circRNA_001496熔解曲線

3 討論

cirRNA 作為常見的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA 的一種，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)中廣泛存在，影響發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖及凋亡等多項(xiàng)生物進(jìn)程。近年來(lái)，隨著高通量技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，特別是RNA-seq 技術(shù)誕生后，人們對(duì)circRNA的研究越來(lái)越深入，circRNA在作為人類疾病診斷與治療的生物標(biāo)記物上顯示出巨大的潛能。目前地貧患者circRNA研究尚未見報(bào)道。

circRNA可與多個(gè)miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，充當(dāng)miRNA 的海綿，從而調(diào)節(jié)miRNA 靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響生物體的細(xì)胞、組織正常發(fā)育，參與免疫反應(yīng)，調(diào)控地貧的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。目前對(duì)于地貧患者中circRNA的功能研究還比較少，可以通過(guò)預(yù)測(cè)與circRNA 結(jié)合的miRNA，進(jìn)而間接推測(cè)circRNA 的生物學(xué)功能。miRNA在地貧(β型)患者紅細(xì)胞增生和幼紅細(xì)胞比例增高發(fā)揮重要作用。miR-144/451在成熟紅細(xì)胞存在高表達(dá)[9]，過(guò)高的表達(dá)量常與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。鄧妮[10]在地貧(β型)雜交小鼠體內(nèi)、在地貧(β型)患者的前體紅細(xì)胞中都觀察到了miR-144/451表達(dá)量明顯升高，把地貧(β型)雜交小鼠體內(nèi)的miR-144/451敲除時(shí)，小鼠的貧血等癥狀得到明顯改善；隨后檢測(cè)了miR-144/451 在小鼠外周血、骨髓以及胚胎肝紅細(xì)胞中表達(dá)趨勢(shì)，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-144/451基因表達(dá)缺失可以很好改善貧血癥狀，由此說(shuō)明miR-144/451調(diào)控了地貧(β型)患者體內(nèi)紅細(xì)胞的成熟過(guò)程，miR-144/451可通過(guò)干預(yù)紅細(xì)胞的生成進(jìn)而達(dá)到疾病的治療及預(yù)后目的。SVASTI 等[11]通過(guò)熒光定量PCR 也觀察到miR-451在地貧(β型)患者純化紅細(xì)胞祖細(xì)胞培養(yǎng)中的雙相上調(diào)。地貧(β型)患者中觀察到不同胎兒血紅蛋白(HbF)水平可能很大程度上受miR-486-3p 調(diào)控[12]。γ-珠蛋白的表達(dá)水平跟地貧(β型)發(fā)展息息相關(guān)，紅血球細(xì)胞中miR-486-3p上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致BCL11A基因表達(dá)減少，γ-珠蛋白基因表達(dá)增加；重型地貧(β型)患者中γ-珠蛋白基因持續(xù)表達(dá)，BCL11A基因相對(duì)表達(dá)量表達(dá)下降[13]；在K-562細(xì)胞系中，miR-26b調(diào)控γ-珠蛋白基因上調(diào)表達(dá)，基于miR-26b對(duì)γ-珠蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用，學(xué)者認(rèn)為miR-26b在未來(lái)靶向治療中有可能將其應(yīng)用于地貧治療[14]。在地貧患者的紅細(xì)胞生成過(guò)程中，hsa-miR-503下調(diào)表達(dá)，甚至缺失，出現(xiàn)貧血特征[15]。

circRNA 廣泛存在于的機(jī)體各種組織細(xì)胞中，具有高度穩(wěn)定性，對(duì)多種疾病調(diào)控功能。隨著檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，將更有利于尋找更多的circRNA，并且探明其具體的功能。但目前有關(guān)地貧的circRNA 的研究仍處于起步階段，如孫士鵬等[16]探討了地貧分子機(jī)制及其相關(guān)microRNA 表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展等，在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具體的機(jī)制仍不是很清楚，因此明確circRNA 的靶基因及其對(duì)靶基因的作用對(duì)人們深入了解地貧發(fā)病機(jī)制和預(yù)后治療都有著重要的意義。

綜上所述，本研究表明在地貧患者外周血血漿中發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)circRNA，circRNA 有可能作為地貧新的生物標(biāo)志物和精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)，可能為未來(lái)地貧的療效評(píng)估、預(yù)后判斷帶來(lái)新的希望。