不同來源中國被毛孢菌株培養(yǎng)特性與化學(xué)成分差異

張一帆 黃龍花 楊穎茵 何嘉豪 余 歡 陳少丹 謝意珍 楊小兵*

（1廣東省微生物研究所 廣東省科學(xué)院/華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510000；2 西藏康寶生物科技有限公司，西藏林芝850400；3廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州510000）

中國被毛孢（Hirsutella sinensis）現(xiàn)已被證明是冬蟲夏草的無性型[1-3]，然而是否是唯一的無性型，目前尚無定論[4-7]。中國被毛孢可在培養(yǎng)基上生長并獲得一定量的菌絲體[8-10]，但尚未有報(bào)道發(fā)現(xiàn)中國被毛孢培養(yǎng)物能直接在一定培養(yǎng)條件下形成肉眼可見的子座。中華被毛孢菌絲體及其分生孢子均可侵染宿主蟲體[11-12]，當(dāng)形成僵蟲后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可形成子實(shí)體[13]。

中國被毛孢與冬蟲夏草有相似的內(nèi)含物[14-15]，但未見系統(tǒng)性研究，例如在建立冬蟲夏草代謝物庫的基礎(chǔ)上，對(duì)同一來源兩者的代謝物組進(jìn)行比較，甚至對(duì)同一子實(shí)體上分離得到的中國被毛孢與其子實(shí)體的代謝物組進(jìn)行比較等。有報(bào)道指出中國被毛孢的甘露醇、甾醇不如冬蟲夏草含量高[16-17]，也有報(bào)道指出，在一些脂類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)方面優(yōu)于冬蟲夏草[18]。在利用宿主蟲體的半人工培養(yǎng)條件下，冬蟲夏草子實(shí)體形成率仍相當(dāng)?shù)停◤某晒η秩鞠x體到長出子實(shí)體少于千分之一）[19]。而中國被毛孢的菌絲體生物量卻可通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，較便捷、較大量獲得[9，20]。這使得中國被毛孢被認(rèn)為是冬蟲夏草子實(shí)體的一個(gè)較為理想的候選替代品。

不同來源的中國被毛孢有不同研究報(bào)道[21-23]。例如，一株來自西藏那曲市的中國被毛孢的多糖組分可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，顯著降低高脂喂食后小鼠的體重增加量，以及減少代謝紊亂[24]；在培養(yǎng)基中添加一定量的錳離子，可使一株來自于青海省的中國被毛孢的多糖產(chǎn)量顯著提高[25]；來自西藏、青海、云南、四川的四株中國被毛孢的分生孢子大小相互間有顯著差異[26]；在同一個(gè)產(chǎn)地中，不同個(gè)體分離得到的中國被毛孢，在相同培養(yǎng)條件下，其分生孢子數(shù)量相互間有顯著差異[27]。而不同來源中國被毛孢代謝物的相互比較尚未見報(bào)道。

因此，筆者對(duì)多個(gè)中國被毛孢菌株進(jìn)行ITS 序列分析與鑒定，并選取其中三個(gè)不同來源的中華被毛孢菌株，對(duì)其生長特性進(jìn)行了初步研究，并通過不同培養(yǎng)方法和提取方法，比較三個(gè)菌株中小分子代謝物整體組成的差異。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

選用廣東省微生物研究所食用菌研究與發(fā)展中心分離和保藏的菌株，代號(hào) Z2、Z3、Z3-la、Z4、I15、XG、P1（其中Z 開頭菌株分離材料來自西藏工布江達(dá)縣，I15 來自那曲市，XG 來自云南香格里拉市，P1 為引進(jìn)的蝙蝠蛾擬青霉）。另從中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）購得中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉各一株作為鑒定時(shí)參照菌株，菌株代號(hào)重新定為Z-YW和Ph-YW。

1.2 培養(yǎng)基配方

平板培養(yǎng)基配方為：蠶蛹15.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉10.0 g，葡萄糖15.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鋅0.3 g，硫酸錳0.3 g，維生素B60.05 g，瓊脂粉20.0 g，純凈水補(bǔ)足至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH。液體培養(yǎng)基配方與固體培養(yǎng)基配方相同，配制時(shí)先將蠶蛹進(jìn)行100 ℃水浴1 h，然后濾去蠶蛹顆粒，濾液混合其他成分。

1.3 菌種鑒定

取平板培養(yǎng)基菌絲體，使用試劑盒（Magen，Hi?Pure Fungal DNA Mini Kit II）提取總 DNA 模板，與ITS 通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行 PCR，回收目的條帶，送樣華大基因測序，獲得各樣品ITS序列。

1.4 菌絲生長速度測定

將供試三個(gè)不同來源的菌株（Z4，XG，I15）接種平板培養(yǎng)基上，18 ℃避光培養(yǎng)，待菌落初步形成后，以劃線法進(jìn)行菌絲生長速度測定，每7 d 記錄一次生長情況（菌落前端位置）。記錄5 次生長區(qū)間，完成后用毫米直尺量取生長區(qū)間，取均值即為該菌株菌絲的生長速度。

1.5 質(zhì)譜檢測

1.5.1 質(zhì)譜分析前樣品制備

分別取相應(yīng)菌株接種在平板培養(yǎng)基上和液體培養(yǎng)基中，18 ℃避光培養(yǎng)60 d，液體搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速120 r/min（哈東聯(lián)DLHR Q200）。提取平板培養(yǎng)基上的菌絲體時(shí)，用鑷子掀起培養(yǎng)基表面菌落，用移液器槍頭刮去菌落背面的培養(yǎng)基，并用二級(jí)水漂洗去除殘余固體培養(yǎng)基；提取液體培養(yǎng)基中的菌絲體時(shí)，用200 目濾網(wǎng)墊于布氏漏斗中，接抽濾裝置，收集菌絲球并去除培養(yǎng)殘液，并用二級(jí)水漂洗菌絲球至濾出液無明顯顏色為止。所得的兩種菌絲體凍干并粉碎，每種菌絲體樣品再分別用超純水、乙酸乙酯按0.90 g 樣品、2.0 mL 溶劑進(jìn)行超聲提?。ǔ暡ㄇ逑磧x，AUTO SCIENCE AS10200BDT），工作頻率40 kHz、功率300 W、水浴溫度40 ℃、處理時(shí)間60 min。水提樣品在提取后離心除盡樣品殘?jiān)?，上清液過水相濾膜（0.22 μm）后待上機(jī)；乙酸乙酯樣品在提取后離心除盡樣品殘?jiān)锨逡涸谑覝叵聯(lián)]發(fā)至剩下少量黏稠狀殘余物，并且不再有乙酸乙酯氣味，然后用2.0 mL 甲醇復(fù)溶黏稠狀殘余物，復(fù)溶后的溶液過有機(jī)相濾膜后（0.22 μm）待上機(jī)。

1.5.2 色譜與質(zhì)譜條件

所用儀器為超高效液相——高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（UHPLC-HRMS，儀器型號(hào)為Thermo Q Exacutive Focus）。色譜條件為：Thermo Hypersil GOLD? C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm），流動(dòng)相（A）0.1%甲酸水溶液，（B）乙腈，梯度洗脫（0～12 min，10%～95%B；12～16 min，95%B），柱 溫 25 ℃ ，流 速0.30 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件為：加熱電噴霧離子源，鞘氣流速45 單位，輔助氣流速8 單位，噴霧電壓3.00 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，輔助氣流加熱溫度350 ℃，S-Lens RF 水平50%。數(shù)據(jù)采集模式為一級(jí)全掃描（正負(fù)模式切換掃描）。一級(jí)質(zhì)譜條件：掃描70～1000.0 m/z，分辨率35 000，自動(dòng)增益控制1e6，最大注入時(shí)間50 ms。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 聚類分析

ITS 序列輸入軟件ClustalX 中進(jìn)行多重比對(duì)，再把數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入軟件MEGA 中，聚類法采用Neigh?bor-joining 法，Bootstraping 為 1000 次，模型為 p-dis?tance，構(gòu)建聚類樹。

1.6.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

樣品原始數(shù)據(jù)文檔導(dǎo)入軟件工具M(jìn)SConvert GUI，使用Peak Picking 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并轉(zhuǎn)換文件格式為mzML。轉(zhuǎn)換格式后的文件導(dǎo)入軟件工具M(jìn)Zmine 中，按順序進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測（Mass Detection）、譜峰構(gòu)建（ADAP Chromatogram Builder）、譜峰反卷積（Chromatogram Deconvolution）、同位素峰歸組（Isotopic Grouper）、譜峰比對(duì)（RANSAC Aligner）、比對(duì)表行信號(hào)過濾（Feature List Rows Filter）、比對(duì)表補(bǔ)缺（Gap Filling）后，獲得比對(duì)文件。將比對(duì)文件峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件工具SIMCA，設(shè)置保留時(shí)間為主要分類項(xiàng)（Primary ID），對(duì)各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行建模打分，獲得主成分分析（PAC）結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株聚類分析與鑒定

基于ITS的聚類分析顯示，中國被毛孢（H.sinensis）與蝙蝠蛾擬青霉（P.hepiali）所在分支分屬兩個(gè)不同簇。試驗(yàn)菌株Z2、Z3-1a、Z4、XG、I15、Z-YW與中國被毛孢、冬蟲夏草歸為一族，可基本判定屬于同一個(gè)種；試驗(yàn)菌株P(guān)-YW、P1在聚類分析中與蝙蝠蛾擬青霉歸為一簇，但P1 與蝙蝠蛾擬青霉同簇的Bootstrap支持率較低，經(jīng)BLAST 分析，其序列與多孔木霉無性型（Tolypocladium inflatum，MK020177.1）相 似 度 為100%。Z3 與Z3-la 原是同一條冬蟲夏草上分別從子座和蟲體上分離得到的培養(yǎng)物，兩者菌落外觀相似，但經(jīng)多次重復(fù)，其基于ITS 序列的聚類分析結(jié)果始終不與中國被毛孢歸為一簇，而更偏向于蝙蝠蛾擬青霉。推測原因可能是，冬蟲夏草是多種微生物共生體系，傳統(tǒng)的菌種分類手段可能會(huì)因分離部位、培養(yǎng)基等原因而富集到某一個(gè)物種。

圖1 供試菌株基于ITS的聚類分析

圖2 三種不同來源中國被毛孢菌落形態(tài)（標(biāo)尺5 mm）

如圖2 所示，三種不同來源的中國被毛孢菌株菌落外觀差別明顯。來源于工布江達(dá)縣的菌株Z4菌落灰白色（近似色號(hào)1631，2.5B 9/1，CBCC 中國建筑色卡，下同）、圓形、邊緣整齊、臍突狀隆起、表面放射狀皺褶；來源于香格里拉市的菌株XG 菌落顏色偏黃（近似色號(hào)0022，8.1Y 9/2）、圓形、邊緣整齊、扁平無隆起（接種點(diǎn)膨大除外）、表面密集發(fā)射狀皺褶；而來源于那曲市的菌株I15 菌落顏色黃白（近似色號(hào)1305，2.5Y 9/1）、圓形、邊緣整齊、凸透鏡狀隆起、表面無皺褶。

2.2 pH對(duì)中國被毛孢菌絲體生長速度的影響

隨著培養(yǎng)基 pH 的升高（5.5～7.0），不同來源的中國被毛孢菌株菌絲體生長速度呈現(xiàn)不同的變化，如圖3 所示。Z4 在較低的pH5.5 時(shí)菌絲生長較快，隨著pH的升高，生長速度降低；I15則相反，隨著培養(yǎng)基pH 升高，菌絲生長速度加快（0.15～0.20 mm/d）；XG 在試驗(yàn)pH 范圍內(nèi)菌絲生長速度變化不明顯。

圖3 中國被毛孢菌株菌絲體在不同pH平板培養(yǎng)基上的菌絲生長速度

2.3 代謝物組成差異分析

三個(gè)不同來源的中國被毛孢菌株，分別通過液體和平板培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得菌絲球和菌落兩種材料，每種材料再分別使用水、乙酸乙酯進(jìn)行提取，共獲得12 種提取物。各種提取物經(jīng)LC-MS 分析后，如圖4 建立PCA 模型。圖4 中兩主成分累計(jì)解釋率達(dá)65.4%（橫軸解釋率大于縱軸）。12種提取物的數(shù)據(jù)點(diǎn)，只要是提取溶劑（水或乙酸乙酯）以及材料獲得方式（液體或平板培養(yǎng)）都相同，則相對(duì)聚攏在一起，使整體數(shù)據(jù)較明顯地分為四組（圖4中坐標(biāo)軸四個(gè)象限內(nèi)），每一組中都存在三個(gè)不同菌株的提取物數(shù)據(jù)點(diǎn)。另外，比較四個(gè)分組中樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)的靠近程度發(fā)現(xiàn)，平板培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的提取物數(shù)據(jù)點(diǎn)（AQS、EAS）比液體培養(yǎng)所得的（AQL、EAL）分散程度高。

圖4 中國被毛孢菌絲體代謝物的PAC得分分布圖

3 小結(jié)與討論

三個(gè)不同來源中國被毛孢菌株菌落外觀形態(tài)存在明顯差異（圖2），但從ITS聚類分析結(jié)果來看，三者與已入庫的中國被毛孢聚類分組較為接近（圖1），說明三者都是中國被毛孢。何蘇琴等曾對(duì)多個(gè)分離于甘肅的冬蟲夏草中國被毛孢菌株進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示部分菌株在相同培養(yǎng)基上生長時(shí)，菌落外觀也存在一定差別[28]。另外，觀察發(fā)現(xiàn)三個(gè)菌株經(jīng)多次傳代，在平板培養(yǎng)基上仍展現(xiàn)出各自菌落相對(duì)穩(wěn)定的特征。造成這種現(xiàn)象的原因可能是三者相互處于更次一級(jí)的分類學(xué)單位，或是基于ITS 的聚類分析精度未足夠，又或是三者存在尚未研究清楚的表觀遺傳情況。

中國被毛孢菌株的不同來源也影響了他們各自對(duì)培養(yǎng)基pH 的響應(yīng)。試驗(yàn)三個(gè)不同來源的中國被毛孢菌株的菌絲生長速度，在相同的培養(yǎng)基pH變化內(nèi)呈現(xiàn)出三種不同的變化模式。不少文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)中國被毛孢培養(yǎng)基的最適pH 為6.5[8-9，29]，但同時(shí)也有研究通過單因素試驗(yàn)或正交試驗(yàn)等得出比6.5更低的最適pH[30-31]。另外，在王錦鋒等的研究中，多個(gè)中華被毛孢菌株在同一種培養(yǎng)基上菌絲生長速度差異顯著[32]。這提示在進(jìn)行中華被毛孢的優(yōu)選培養(yǎng)試驗(yàn)，尤其是深層發(fā)酵時(shí)，需根據(jù)所選菌株選擇其最適pH培養(yǎng)基。

通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，同一菌株使用同一種提取溶劑提取時(shí)，其代謝物整體組成因培養(yǎng)基固液狀態(tài)存在明顯差異。YU 等在研究中國被毛孢揮發(fā)性成分以及李淑林在分析中國被毛孢的代謝組學(xué)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)存在這種差異[33-34]。由此可見，培養(yǎng)基固液狀態(tài)對(duì)某些目標(biāo)代謝產(chǎn)物可能有重要影響。另一方面，由于主成分分析中橫軸的解釋率約是縱軸2.5倍，而且四個(gè)分組數(shù)據(jù)點(diǎn)在橫軸的距離更大，推測提取液差異對(duì)代謝物組成差異的貢獻(xiàn)要大于材料來源方式，這也比較符合用乙酸乙酯提取樣品小極性代謝物，而用水提取中大極性代謝物的特性。再者，使用兩種溶劑提取時(shí)，都發(fā)現(xiàn)平板培養(yǎng)三個(gè)菌株所得數(shù)據(jù)點(diǎn)分散程度比液體培養(yǎng)的高，推測在比較不同菌株代謝物時(shí)，采用固體培養(yǎng)方式可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多或更明顯的成分差異。