OX26/ApoE共修飾的載小檗堿介孔二氧化硅納米粒藥動(dòng)學(xué)研究*

張鈺坤，李新悅，張 瀛，宋旭楠，孫新茹，秦 歡，郭 盼，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津 301617）

小檗堿（BBR）又名黃連素，是從黃連屬植物中提取的天然活性成分，為異喹啉類(lèi)生物堿，具有抗炎[1]、抗菌[2]、抗腫瘤[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]、降糖[5]、降脂[6]等作用。有研究報(bào)道BBR可以阻斷海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的鉀通道，對(duì)缺血性中風(fēng)具有神經(jīng)保護(hù)作用[7]。但BBR水溶性和胃腸道吸收差，口服生物利用度低且具有首過(guò)效應(yīng)，這極大程度上限制了其臨床應(yīng)用[8]。因此，開(kāi)發(fā)一種優(yōu)良的載藥體系以減少這些限制具有非常重要的意義。

介孔二氧化硅是一種具有有序孔道結(jié)構(gòu)的無(wú)機(jī)納米材料，大的比表面積和孔容積、高藥物包載率、良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性使其廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等不同領(lǐng)域[9]。通過(guò)將表面與孔道內(nèi)硅羥基進(jìn)行功能化，可延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)，同時(shí)靶向于病灶部位從而更好的發(fā)揮藥理作用[10-11]。介孔二氧化硅作為一種新興的納米材料，成為發(fā)展前景較為廣闊的藥物遞送載體。

血腦屏障（BBB）是存在于血漿與腦脊液之間的一種復(fù)雜結(jié)構(gòu)，會(huì)阻止血液中超過(guò)98%的小分子和近100%的大分子進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），導(dǎo)致許多潛在的腦部治療藥物無(wú)法進(jìn)入CNS發(fā)揮作用[12]。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）和低密度脂蛋白受體在脊椎動(dòng)物BBB上的表達(dá)尤為豐富[13-14]。小鼠抗大鼠TfR的單克隆抗體[15]（OX26）和載脂蛋白E[16]（ApoE）可以通過(guò)TfR和低密度脂蛋白受體 LDLR、LRP-1、VLDLR及ApoER-2介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)增加腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于納米粒的攝入。

本實(shí)驗(yàn)擬合成粒徑為100 nm以下的介孔二氧化硅納米粒，通過(guò)OX26和ApoE兩種抗體修飾構(gòu)建腦靶向納米載藥系統(tǒng)，包載小檗堿后得到小檗堿腦靶向介孔硅納米載體，通過(guò)與BBB上受體的特異性結(jié)合介導(dǎo)藥物入腦，提高藥物在腦內(nèi)的生物利用度。

1 材料與試劑

1.1 儀器 Agient 1260型高效液相色譜儀（VWD檢測(cè)器及Chem Station色譜工作站，美國(guó)安捷倫公司）；高速冷凍離心機(jī)（ST16R，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；智能磁力加熱攪拌器（鞏義市予華儀有限責(zé)任公司，SZCL-4B）；激光粒度分析儀（Nano ZS型，英國(guó)Malvern公司）；場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（Tecnai G2F20，美國(guó) FEI公司）；紅外光譜儀（Nicolet IS10，美國(guó)尼高力公司）；差示掃描量熱儀（Jade DSC，美國(guó)Perkin Elmer公司）；高性能多通道全自動(dòng)比表面與孔隙分析儀（RISTARⅡ3020型，美國(guó)麥克公司）；全自動(dòng)溶出取樣系統(tǒng)（DT-820，德國(guó)ERWEKA公司）；pH計(jì)（PB-10型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試劑 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，99%，GENVIEW）；正硅酸四乙酯（TEOS，≥28．4%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙二醇（阿拉丁，D1611016）；氨水（天津市津科精細(xì)化工研究所，20171029）；濃硫酸（95%～98%，天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；鹽酸（36．0%～38．0%，天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；氫氧化鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；2-氰基乙基三乙氧基硅烷（≥97%，阿拉丁）；BBR提取物（純度大于98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；OX26抗體（Bio-Rad公司，MCA155G）；AC（Santa Cruz Blotechnology，sc-390925）；水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；磷酸（美國(guó)Thermo Fisher公司，色譜純）；乙腈（美國(guó)Thermo Fisher公司，色譜純）；右旋四氫巴馬汀（純度大于98%，上海源葉生物科技有限公司）；甲酸（日本株式會(huì)社，K3JHG-LS）。

1.3 動(dòng)物 健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。動(dòng)物室溫度：（25±2）℃，相對(duì)濕度：（50±2）℃，相關(guān)研究遵照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則進(jìn)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 羧基介孔二氧化硅納米載體的制備 采用共縮合反應(yīng)[17]制備。1．2 g CTAB溶于180 mL去離子水和 5．5 mL（25%）氨水，加入 20 mL 乙二醇，1 000 rpm、60℃條件下劇烈攪拌約30 min，快速加入2．0 mL TEOS和0．4 mL 2-氰基乙基三乙氧基硅，反應(yīng)2 h，相同溫度下靜置沉化24 h。12 000 r/min離心20 min收集樣品，去離子水和乙醇洗滌數(shù)次。將干燥的產(chǎn)物在100℃用9 mol/L H2SO4溶液酸化處理。模板劑CTAB通過(guò)酸性乙醇萃?。s9 mL HCl在100 mL乙醇中65℃攪拌 24 h），12 000 r/min離心30 min分離得到產(chǎn)物，50℃真空干燥得MSNs-COOH。

2.2 OX26和ApoE共修飾的介孔二氧化硅的制備 參照文獻(xiàn)[18]采用碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)。60 mg MSNs-COOH 分散于 10 mL MES（pH 6．0）緩沖液中，加入EDC 60 mg和NHS 40 mg，室溫條件下震蕩1 h，離心后去掉上清液，重新分散于10mLPBS緩沖液中，分別加入 600 μg OX26、600 μg ApoE、300 μg OX26和300 μg ApoE，室溫條件下震蕩反應(yīng)12 h，洗滌兩遍并離心，得到MSNs-OX26、MSNs-ApoE、MSNs-OX26/ApoE，干燥備用。

2.3 小檗堿腦靶向載體的制備 浸漬法包載BBR。取濃度為1mg/mL的BBRNaOH溶液（pH10．5）20mL置于西林瓶中，加入20mgMSNs-OX26、MSNs-ApoE、MSNs-OX26/ApoE于磁力攪拌器，37℃、180 r/min攪拌24 h。剩余藥物溶液也于相同條件下攪拌24 h，作為對(duì)照。

2.4 介孔二氧化硅載體的表征

2.4.1 形態(tài)、粒徑及Zeta電位 采用場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡觀察MSNs-COOH及載藥后制劑形貌；通過(guò)激光粒度分析儀測(cè)定MSNs-COOH的粒徑、粒徑分布及Zeta電位。結(jié)果如圖1和圖2，MSNs-COOH均呈規(guī)則的球形，有清晰的孔道結(jié)構(gòu)，粒徑較為均一，載荷后載體形態(tài)與粒徑無(wú)明顯改變。MSNs-COOH 粒徑為（129．8±1．3）nm，Zeta 電位為-（36．00±1．0）nm。

圖1 MSNs-COOH（A）、BBR-MSNs（B）的透射電鏡圖

2.4.2 紅外吸收 采用溴化鉀壓片法進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜定性分析。分別掃描記錄MSNs-COOH、MSNs-OX26、MSNs-ApoE 及 MSNs-OX26/ApoE的紅外光譜圖，確定其組成成分。波譜范圍4000～400cm-1，分辨率為 2cm-1。結(jié)果如圖 3，1100cm-1位置的峰為Si-O鍵伸縮振動(dòng)峰，3 750～3 000 cm-1位置為硅羥基O-H伸縮振動(dòng)峰。圖A中1 715 cm-1位置的峰歸屬于C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，屬于-COOH結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，2 923 cm-1位置的吸收峰為2-氰基乙基三乙氧基硅烷結(jié)構(gòu)中C-H伸縮振動(dòng)峰，1 470 cm-1位置小峰為C-H變形振動(dòng)峰。B、C、D 3種抗體修飾的MSNs在1 715 cm-1位置-COOH結(jié)構(gòu)的特征吸收峰較A均減弱，推測(cè)可能是由于介孔硅載體上的一部分-COOH與抗體進(jìn)行了偶聯(lián)，由于抗體本身的數(shù)量少，且N-H振動(dòng)峰易與3 750～3 000 cm-1位置的硅羥基O-H伸縮振動(dòng)峰重合，故未發(fā)現(xiàn)抗體的特征峰。IR圖譜結(jié)果能夠表明MSNs-COOH載體表面的一部分-COOH基團(tuán)能與抗體進(jìn)行偶聯(lián)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)介孔硅的抗體修飾。

圖2 MSNs-COOH粒徑（上）與Zeta電位（下）圖

圖3 MSNs-COOH（A）、MSNs-OX26（B）、MSNs-ApoE（C）MSNs-OX26/ApoE（D）紅外光譜圖

2.4.3 氮?dú)馕郊懊摳?采用多通道全自動(dòng)比表面與孔隙分析儀對(duì)MSNs-COOH以及MSNs-OX26、MSNs-ApoE和MSNs-OX26/ApoE進(jìn)行分析，用BET法計(jì)算比表面積和孔徑，BJH模型計(jì)算孔容積。如圖4所示，4種制劑均呈現(xiàn)出無(wú)機(jī)有序介孔硅材料特有的Langmuir IV型等溫線和H1型回滯環(huán)[19]。經(jīng)計(jì)算，MSNs-COOH孔容積為1.430 cm3/g，孔徑為7.802 nm，比表面積為733.0 m2/g。MSNs-OX26孔容積為1.350 cm3/g，比表面積為752.66 m2/g。MSNs-ApoE孔容積為1.330 cm3/g，比表面積為793.5 m2/g；MSNs-OX26/ApoE 孔容積為 0.8406 cm3/g，比表面積為649.6 m2/g。因此，將介孔硅載體與抗體OX26、ApoE以及兩種抗體偶聯(lián)后并未對(duì)MSNs的比表面積、孔容積等參數(shù)產(chǎn)生影響，均具有較大的比表面積與孔容積。

圖4 MSNs-COOH（A）、MSNs-OX26（B）、MSNs-ApoE（C）和 MSNs-OX26/ApoE（D）的氮?dú)馕锢砦矫摳降葴鼐€

2.4.4 差示掃描量熱分析 稱(chēng)取BBR原料藥、MSNs、BBR與 MSNs的物理混合物以及 BBRMSNs，放入差示掃描量熱儀中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下以10℃/min的速率由30℃加熱至300℃，記錄樣品的熱力學(xué)曲線。結(jié)果如圖5所示，A顯示BBR有兩個(gè)吸收峰，129．5℃出現(xiàn)的第一個(gè)吸收峰是BBR失去兩個(gè)結(jié)晶水分子的脫水峰，191．8℃出現(xiàn)的吸收峰是BBR熔解時(shí)的熔融吸熱峰。B在191．8℃處也出現(xiàn)較小的吸收峰，表明物理混合物中BBR仍以晶體形式存在，但可能是介孔硅載體的存在影響了BBR的熔點(diǎn)峰。而C和D的圖譜中這些峰基本消失，說(shuō)明BBR并非吸附于載體表面，而是被介孔硅納米載體有效包載進(jìn)入介孔結(jié)構(gòu)中以非晶型存在。

圖5 BBR（A）、BBR與MSNs的物理混合物（B）、BBRMSN（C）和 MSNs（D）差式掃描量熱分析圖譜

2.5 HPLC色譜條件及載藥量的測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge Shield RP18（4．6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0．02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（B），梯度：27%乙腈等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃。

2.5.2 對(duì)照品、供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取適量BBR對(duì)照品，用甲醇溶解后配制成對(duì)照品溶液；收集載藥后的上清液，用pH 10．5的NaOH溶液配制成供試品溶液。

2.5.3 專(zhuān)屬性考察 照“2．3．1”項(xiàng)下色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶劑進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示pH 10．5的NaOH對(duì)于BBR的含量測(cè)定無(wú)干擾。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密量取BBR對(duì)照品，用pH 10．5的NaOH溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為1．01、2．02、5．04、10．08、25．20、50．40、100．80 μg/mL 的線性溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)（Y），待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)（X）建立回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=36．174X-62．438，r2=0．999 9，結(jié)果表明 BBR 在質(zhì)量濃度為 1．01～100．80 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖6 供試品溶液（A）、對(duì)照品溶液（B）、空白制劑溶液（C）和pH10.5溶液（D）專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)HPLC圖

2.5.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取低、中、高3種質(zhì)量濃度的BBR對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，一天內(nèi)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；后連續(xù)3天測(cè)定計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示日內(nèi)精密度的RSD值為0．76%，日間精密度為0．68%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液6份進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示RSD值為1．9%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取BBR對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品的穩(wěn)定性。經(jīng)計(jì)算RSD值為1．15%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.5.8 加樣回收率 取樣品溶液適量，按 0．8∶1，1∶1，1．2∶1的比例加入對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以所測(cè)值與真實(shí)值之比計(jì)算回收率。結(jié)果分別為（91．59±0．071）%、（93．49±0．011）%、（90．82±0．032）%，加樣回收率符合要求。

2.5.9 載藥量的測(cè)定 將載藥后樣品離心（12000r/min，10 min），取上清液稀釋后進(jìn)樣測(cè)含量，所得為未包載的游離藥物含量；同法檢測(cè)對(duì)照組藥物溶液，為藥物總量。根據(jù)下列公式計(jì)算載藥量：

2.6 體外釋放 用ACSF和PBS（pH7．4）作為釋放介質(zhì)，考察BBR原料藥、BBR與MSNs的物理混合物、BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE 及 BBRMSNs-OX26/ApoE 5種制劑中BBR的釋放特征。在（37±0．5）℃下，取 5種制劑各 3 mL 于透析袋內(nèi)（含BBR量均為3mg），采用小杯法，同一時(shí)刻放入200mL溶出介質(zhì)中，攪拌速度為 75r/min。于 5、10、15、30、60、120、180、240、360、480、600、720 min 分別取樣 2 mL，同時(shí)補(bǔ)充同體積介質(zhì)。取出液經(jīng)0．45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。

由圖7，8可知，在兩種介質(zhì)中，BBR原料藥組與物理混合物組均在兩小時(shí)內(nèi)累計(jì)溶出度達(dá)90%左右，釋放趨于平衡，BBR-MSNs-OX26、BBRMSNs-ApoE和BBR-MSNs-OX26/ApoE 3組在兩種介質(zhì)中均在8～10 h左右達(dá)到平衡，在ACSF溶出介質(zhì)中12 h內(nèi)的累積溶出度分別分別為（94．18±1．0）%、（89．84±3．2）%和（91．18±6．0）%；在 PBS 溶出介質(zhì)中在12 h內(nèi)的累積溶出度分別為（91．61±0．72）%、（88．86±0．82）%和（89．88±2．9）%，均表現(xiàn)出一定的緩釋特性，未見(jiàn)突釋現(xiàn)象。

圖7 BBR原料藥、物理混合物和BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE和BBR-MSNs-OX26/ApoE在ACSF中的累積溶出度（%，±s，n=3）

圖8 BBR原料藥、物理混合物和BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE和BBR-MSNs-OX26/ApoE在PBS中的累積溶出度（%，±s，n=3）

2.7 藥動(dòng)學(xué)研究

2.7.1 動(dòng)物分組及給藥 健康雄性SD大鼠（220～250 g），給藥前12 h禁食不禁水。將180只大鼠隨機(jī)分為 BBR 溶液，BBR-MSNs、BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE以及BBR-MSNs-OX26/ApoE 5組，每組36只。采用尾靜脈注射方式給藥，分別于給藥后 5 min、10 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h 腹主動(dòng)脈取血，4 ℃，4 000 rpm條件下離心10 min，取血漿于離心管中-20℃保存。取血后生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，斷頭取腦，將腦組織用生理鹽水沖洗后，濾紙吸干水分，稱(chēng)質(zhì)量，加入4倍量的生理鹽水在高速勻漿機(jī)中勻漿，-20℃條件下保存。

2.7.2 血漿和腦勻漿處理方法 精密量取100 μL大鼠血漿和腦勻漿樣品，加入300 μL乙腈（含右旋四氫巴馬汀，濃度為 4．08 ng/mL），渦漩混合 5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行測(cè)定。

2.7.3 檢測(cè)條件及線性關(guān)系考察 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI源）；掃描方式：正離子（ESI+）檢測(cè)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）。電噴霧電壓：5 kV，霧化氣體：N2，噴霧氣流速（Gas1）：40 p．s．i；離子源溫度：300℃。

色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2．1 mm×100 mm，1．8 μm）；流動(dòng)相：A（0．1%甲酸溶液）-B乙腈梯度洗脫：0～5 min：85%～30%A，柱溫：35℃。

精密稱(chēng)定適量BBR對(duì)照品，配制成質(zhì)量濃度為508 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。用乙腈稀釋成 2．540、5．080、10．16、50．80、101．6、254．0、508．0、1 016、2 032 ng/mL的線性溶液。分別取100 μL的線性溶液于離心管中，氮?dú)獯蹈?，加入大鼠空白血漿或腦勻漿液100μL，渦旋5 min，加入300 μL乙腈（含右旋四氫巴馬汀，濃度為 4．080 ng/mL），漩渦混合 5 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液進(jìn)樣。以待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到BBR在血漿中線性回歸方程為Y=0．115 109X-0．055 515，r2=0．999 9，在腦組織勻漿中的線性方程為Y=0．115 720X-0．095 362，r2=0．999 9，表明質(zhì)量濃度在 2．54～2 032．00 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.4 方法學(xué)考察 取空白血漿樣品、空白腦勻漿樣品、對(duì)照品血漿樣品、對(duì)照品腦勻漿樣品和待測(cè)樣品進(jìn)樣檢測(cè)，由圖9可知血漿和腦勻漿中內(nèi)源性成分對(duì)BBR的含量測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。取低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品，同一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定 6 次，RSD 值分別為 1．12%、1．08%、0．83%，表明日內(nèi)精密度良好。每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3d，RSD 值分別為 3．6%、1．4%、0．02%，表明日間精密度良好。另取大鼠空白血漿及空白腦勻漿，加入對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液適量，配制成低、中、高質(zhì)量濃度的血漿與腦勻漿樣品，每個(gè)濃度6份，進(jìn)樣測(cè)定方法回收率和提取回收率。結(jié)果顯示低、中、高3種濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液在血漿和腦勻漿中的提取回收率在91．05%～99．68%之間，方法學(xué)回收率在 97．02%～110．2%之間，符合生物樣品測(cè)定要求。另取低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，加入乙腈離心取上清。每個(gè)濃度各3份，測(cè)定其在4℃放置24 h的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 BBR溶液、BBR-MSNs、BBRMSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE 以及 BBR-MSNs-OX26/ApoE五組在血漿中及腦勻漿中的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖10和圖11，以及相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。由結(jié)果可知，靜脈注射相同劑量的小檗堿后，5組藥物含量均為逐漸下降趨勢(shì)，BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE及BBR-MSNs-OX26/ApoE 3組在血漿中體內(nèi)清除率較溶液組低，明顯延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間。在腦勻漿中，BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE及 BBR-MSNs-OX26/ApoE 3組與溶液組相比，AUC0-t均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），明顯提高了BBR在腦內(nèi)的生物利用度。且 BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE及 BBRMSNs-OX26/ApoE 3組與溶液組相比，達(dá)峰時(shí)間和平均滯留時(shí)間延長(zhǎng)，半衰期延長(zhǎng)，體內(nèi)清除率降低，均具有顯著性差異（P＜0．05）。由此可知，所構(gòu)建的小檗堿腦靶向介孔硅載體能夠顯著提高小檗堿的腦內(nèi)生物利用度，且具有一定的腦靶向性。

圖9 BBR樣品專(zhuān)屬性圖譜

圖10 大鼠尾靜脈注射后5組制劑的血藥濃度-時(shí)間曲線（n=3）

圖11 大鼠靜脈注射后5組制劑的腦勻漿藥物濃度-時(shí)間曲線（n=3）

表1 大鼠尾靜脈注射后5組制劑血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s）

表1 大鼠尾靜脈注射后5組制劑血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s）

注：與 BBR 原料藥組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與非修飾組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

組別BBR原料藥組未修飾組OX26修飾組ApoE修飾組OX26/ApoE修飾組組別BBR原料藥組未修飾組OX26修飾組ApoE修飾組OX26/ApoE修飾組n 3 3 3 3 3 n 3 3 3 3 3 Cmax（ng/mL）Tmax（h）AUC0-t（h·ng/mL）Lz（h）AUMC0-t/（h·h·ng/mL）729．41±270．78 0．11±0．05 450．93±164．25 0．10±0．01 2 657．38± 364．59 645．97±260．49 0．08±0．00 366．57±72．28 0．06±0．03 1 931．41± 977．99 345．45±41．99* 0．11±0．05 321．22±51．13 0．05±0．02* 3 199．15± 534．38 572．32±20．17 0．11±0．05 812．26±128．91**△△ 0．06±0．02 9 077．21±2 840．83**△△350．72±88．19* 0．14±0．05 332．47±101．18 0．06±0．03 2 586．96± 497．88 T1/2（h）Vz/F/（mL/kg）CL/F/（mL·h/kg）MRT（h）6．88±0．22 96 167．95± 46 205．31 9 502．83±3 728．14 6．46±2．35 14．08±8．10 202 088．28± 67 401．92 10 843．29±2 335．94 5．14±2．24 16．93±9．28 260 789．67±129 791．30* 10 833．13±1 205．52 9．96±0．29△11．66±4．37 72 923．46± 18 930．82 4 471．17± 807．90*△ 11．02±1．79*△△12．29±5．20 208 798．39±105 083．71 11 415．09±2 398．74 8．43±3．33

表2 大鼠靜脈注射后5組制劑腦勻漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s）

表2 大鼠靜脈注射后5組制劑腦勻漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s）

注：與 BBR 原料藥組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與非修飾組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

組別BBR原料藥組未修飾組OX26修飾組ApoE修飾組OX26/ApoE修飾組組別BBR原料藥組未修飾組OX26修飾組ApoE修飾組OX26/ApoE修飾組n 3 3 3 3 3 n 3 3 3 3 3 Cmax（ng/mL）Tmax（h）AUC0-t（h·ng/mL）Lz（h）AUMC0-t/（h·h·ng/mL）729．41±270．78 0．11±0．05 450．93±164．25 0．10±0．01 2 657．38± 364．59 645．97±260．49 0．083±0．00 366．57± 72．28 0．06±0．03 1 931．41± 977．99 345．45± 41．99* 0．11±0．05 321．22± 51．13 0．05±0．02* 3 199．15± 534．38 572．32± 20．17 0．11±0．05 812．26±128．91**△△ 0．06±0．02 9 077．21±2 840．83**△△350．72± 88．19* 0．14±0．05 332．47±101．18 0．06±0．03 2 586．96± 497．88 T1/2（h）Vz/F（mL/kg）CL/F/（mL·h/kg）MRT（h）6．88±0．22 96 167．95± 46 205．31 9 502．83±3 728．14 6．46±2．35 14．08±8．10 202 088．28± 67 401．92 10 843．29±2 335．94 5．14±2．24 16．93±9．28 260 789．67±129 791．30* 10 833．13±1 205．52 9．96±0．29△11．66±4．37 72 923．46± 18 930．82 4 471．17± 807．9*△ 11．02±1．79*△△12．29±5．20 208 798．39±105 083．71 11 415．09±2 398．74 8．43±3．33

表3 大鼠靜脈注射后BBR溶液、BBR-MSNs組、BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE以及BBR-MSNs-OX26/ApoE腦靶向指數(shù)（h·ng/mL，±s）

表3 大鼠靜脈注射后BBR溶液、BBR-MSNs組、BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE以及BBR-MSNs-OX26/ApoE腦靶向指數(shù)（h·ng/mL，±s）

AUC0-t n BBR溶液組 BBR-MSNs BBR-MSNs-OX26 BBR-MSNs-ApoE BBR-MSNs-OX26/ApoE Brain 3 1 702．12±164．14 1 933．15±211．92 2 306．94±239．29 3 040．39±119．84 2 135．58± 30．38 Blood 3 450．93±164．25 366．57± 72．28 321．22± 51．13 812．26±128．91 332．47±101．18 DTI 3 - 1．39 1．90 0．99 1．70

2.7.6 腦靶向指數(shù)評(píng)價(jià) 以靜脈注射BBR溶液后腦勻漿中的藥時(shí)曲線下的面積（AUC）為參比，將BBR-MSNs、BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE以及BBR-MSNs-OX26/ApoE 4組制劑靜脈注射后的AUC與其比較，計(jì)算腦靶向指數(shù)（DTI）。計(jì)算公式如下。計(jì)算得制劑組腦靶向指數(shù)均大于1，具有一定的靶向性。

3 討論

本研究前期運(yùn)用模板劑法制備了非功能化介孔二氧化硅、氨基功能化介孔二氧化硅及羧基功能化介孔二氧化硅，通過(guò)一系列表征得出MSNs-COOH粒徑較小，易于進(jìn)入細(xì)胞，負(fù)電性也可使納米粒子易在體內(nèi)被清除而不引起蓄積毒性。通過(guò)激光粒度分析儀測(cè)得MSNs-COOH平均粒徑為（129．8±1．3）nm，而 TEM 圖顯示 MSNs-COOH 粒徑小于100 nm，這是由于MSNs大的比表面積使得納米粒之間存在較大的相互作用力，如范德華力、庫(kù)侖力等，通過(guò)力的相互作用，納米粒容易團(tuán)聚進(jìn)而使測(cè)得的粒徑比實(shí)際偏大[20]。

體外釋放采用 PBS（pH7．4）和 ACSF 作為溶出介質(zhì)是模擬體內(nèi)血液循環(huán)和腦部的生理環(huán)境，結(jié)果顯示，BBR溶液組在2h時(shí)就出現(xiàn)了突釋現(xiàn)象，累計(jì)溶出度達(dá)90%以上，而另外3組可能因?yàn)榕悸?lián)抗體后大分子可封堵孔道以及阻礙吸附于載體表面的藥物向外擴(kuò)散，因此出現(xiàn)了一定的緩釋作用。此結(jié)果證明抗體修飾的載小檗堿介孔二氧化硅制劑在兩種介質(zhì)中具有一定的緩釋作用。

藥動(dòng)學(xué)研究中，以4 mg/kg的給藥劑量通過(guò)尾靜脈注射 BBR溶液組、BBR-MSN、BBR-MSNs-OX26、BBR-MSNs-ApoE 和 BBR-MSNs-OX26/ApoE 5組制劑后，血漿中藥物含量呈逐漸下降趨勢(shì)，腦組織中藥物含量為先上升后下降趨勢(shì)。血漿中藥動(dòng)學(xué)參數(shù)顯示抗體修飾組在血漿中體內(nèi)清除率降低，明顯延長(zhǎng)了體內(nèi)滯留時(shí)間。腦組織勻漿中藥動(dòng)學(xué)參數(shù)顯示，抗體修飾組明顯提高了BBR的腦內(nèi)生物利用度，延長(zhǎng)了藥物的達(dá)峰時(shí)間、平均滯留時(shí)間和藥物的半衰期，降低了藥物的腦內(nèi)清除率，且均具有顯著性差異（P＜0．05）。

體外釋放結(jié)果表明，將BBR包載于介孔二氧化硅中可以達(dá)到緩釋作用，降低藥物進(jìn)入體內(nèi)后的突釋現(xiàn)象。體內(nèi)藥時(shí)曲線和主要藥動(dòng)參數(shù)表明，相比較于BBR溶液組，小檗堿腦靶向介孔硅載體到達(dá)體內(nèi)后有一定的緩釋作用，明顯提高了BBR在體內(nèi)的生物利用度，其表現(xiàn)出的緩效作用與體外釋放動(dòng)力學(xué)考察的結(jié)果相吻合。綜上所述，OX26/ApoE共修飾的小檗堿腦靶向介孔硅載體能夠顯著提高小檗堿的腦內(nèi)生物利用度，且BBR-MSNs、BBR-MSNs-OX26和BBR-MSNs-OX26/ApoE三組載體腦靶向指數(shù)均大于1。因此，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的小檗堿腦靶向介孔硅載體能提高藥物在腦內(nèi)的生物利用度，實(shí)現(xiàn)藥物腦部靶向治療，具有一定的腦靶向性。本研究對(duì)難溶性藥物靶向遞送至腦內(nèi)病灶而發(fā)揮作用具有一定的意義。