可口可樂和匯源橙汁及其所含飲料酸對組織蛋白酶K活性的影響

聶海丹，王瑛慧，劉娟，劉穎，喬峰，吳麗更

（1.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙體牙髓科,天津300070；2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院口腔科,北京100050;3.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科,天津300070）

組織蛋白酶K（cathepsin K）是木瓜類半胱氨酸蛋白酶家族的一員，因可以在多個位點裂解膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，而成為哺乳動物最有效的膠原酶[1-2]。近年來，組織蛋白酶K在口腔頜面部疾病中的作用受到越來越多的關注。研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K在牙本質(zhì)、牙髓、牙本質(zhì)牙髓復合體、齦溝液中均有表達，參與生理和病理條件下的基質(zhì)降解破壞與組織重建改造等重要生物活動[3]。研究證實，組織蛋白酶K與牙本質(zhì)齲病[4]、酸蝕癥、牙周炎[5]、種植體周圍炎、牙本質(zhì)粘接老化的發(fā)生、發(fā)展關系密切[6]。

組織蛋白酶K在合成之初以沒有活性的酶原形式存在，其蛋白質(zhì)水解活性受到一系列內(nèi)、外源性環(huán)境因素的調(diào)節(jié)[7]。如Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)不同黏接過程可對半胱氨酸組織蛋白酶的活性產(chǎn)生影響，酸蝕及酸蝕-沖洗黏接法能降低組織蛋白酶K活性，而自酸蝕粘接法則增加其活性?？梢娊M織蛋白酶K是一類在弱酸性環(huán)境中不穩(wěn)定的糖蛋白[9]。

食物是影響口腔環(huán)境的重要因素。研究表明，酸性飲料可以影響唾液、菌斑、牙齒表面、齦溝液的pH值[10]。目前，不同酸性飲料及不同飲料酸對組織蛋白酶K的作用情況，尚未見研究報道。因此，本研究擬比較組織蛋白酶K在可口可樂（含有磷酸）、匯源橙汁（含有檸檬酸）和兩種飲料酸的作用下降解膠原的能力，該研究將有助于進一步了解口腔環(huán)境中酸的種類和pH值對組織蛋白酶K降解膠原作用的影響,為下一步以組織蛋白酶K為靶點來預防和治療口腔疾病提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 組織蛋白酶K酶原（ALX-201-239-C010，Enzo Life Sciences）；可口可樂（可口可樂有限公司，北京，中國）、匯源橙汁（匯源果汁集團，北京，中國）；蛋白 marker（Fermentas，Thermo Fisher Scientific，Illinois state，USA）；磷酸、檸檬酸、明膠和亮抑酶肽（生工生物工程公司，上海，中國）。

1.2 方法

1.2.1 磷酸溶液的制備 配制10 mol/L的磷酸溶液，取3份，用0.1 mol/L氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)至pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5,備用。

1.2.2 檸檬酸溶液的制備 用無水檸檬酸配制2%的檸檬酸溶液,取3份，用0.1 mol/L氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)至 pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5，備用。

1.2.3 酶原溶液的制備 將濃度為150 ng/μL的組織蛋白酶 K酶原用稀釋液（20 mmol/L Tris，pH 7.5，5 mmol/L EGTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L β 磷酸甘油，10 mmol/L NaF，1 mmol/L 原釩酸鈉，1%Triton×100，0.1%Tween 20）稀釋至 2 μg/L，備用。

1.2.4 實驗步驟 實驗根據(jù)處理因素不同分為10組：（1）可口可樂組。（2）匯源橙汁組。（3）磷酸（pH 2.5）組。（4）磷酸（pH 3.0）組。（5）磷酸（pH 3.5）組。（6）檸檬酸（pH 2.5）組。（7）檸檬酸（pH 3.0）組。（8）檸檬酸（pH 3.5）組。（9）陰性對照組：處理因素為組織蛋白酶 K 酶原稀釋液（20 mmol/L Tris，pH 7.5，5 mmol/L EGTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L β 磷酸甘油，10 mmol/L NaF，1 mmol/L 原釩酸鈉，1%Triton×100，0.1%Tween 20）。（10）陽性對照組：處理因素為組織蛋白酶K的激活劑（100 mmol/L乙酸鈉，10 mmol/L DTT，5 mmol/L EDTA，pH 值 3.9）。依次取上述 10個處理組溶液各15 μL，每組取6份，分別加入15 μL酶原溶液（2 μg/L），混合均勻，于37℃水浴箱中孵育5～10 min。

1.2.5 明膠酶譜法檢測CK的活性 分別取5 μL上述孵育后的各組樣品，在含有0.2%明膠底物的12.5%SDS-PAGE上于4℃、100 V的條件下電泳，直至溴酚藍到達凝膠的邊緣。將凝膠取出，經(jīng)震蕩洗脫（65 mmol/L Tris，20%甘油，pH 7.4，30 min），震蕩水洗10 min，漂洗（10 mmol/L磷酸鈉，0.1 mmol/L EDTA，0.2 mmol/L DTT，pH 6.0，30 min）， 孵 育（37℃，23 h），洗滌（10 min），0.2%考馬斯亮藍染色1 h，然后用脫色液脫色至清晰條帶出現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用ChemiDoc XRS+成像器（伯樂，加利福尼亞州，美國）采集明膠酶譜法所得電泳條帶圖，用“Quantity One”泳道/條帶軌跡定量法（Trace Tracking）對所得條帶進行光密度分析，以每個實驗組6個樣本所測得的光密度的平均值代表各實驗組膠原降解量的多少，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）將兩個飲料組膠原降解量與陰性對照組和陽性對照組進行比較分析。通過單變量多因素方差分析（UNIANOVA）對不同pH的磷酸組和不同pH的檸檬酸組的膠原降解量進行比較分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 可口可樂和匯源橙汁對組織蛋白酶 K活性的影響 與陰性對照組相比，可口可樂處理組膠原降解量升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.49，P＜0.05）。以陽性對照組膠原降解量作為酶活性的參考（100%），可口可樂處理組組織蛋白酶 K的相對酶活性為45%；與陰性對照組相比，匯源橙汁處理組的膠原降解量升高,差異有統(tǒng)計學意義（t=18.98，P＜0.05）。匯源橙汁處理組的相對酶活性為83%。可口可樂處理組膠原降解量與匯源橙汁處理組相比差異有統(tǒng)計學意義（t=10.37，P＜0.05）（圖 1）。

2.2 磷酸對組織蛋白酶 K活性的影響 不同pH（2.5～3.5）的磷酸對組織蛋白酶K總體呈激活作用，在磷酸作用下，組織蛋白酶K的相對酶活性為38%～56%。且隨著磷酸溶液pH的升高，組織蛋白酶K的酶活性逐漸加強（t=5.69、5.21，均P＜0.05，圖 2）。

2.3 檸檬酸對組織蛋白酶 K活性的影響 不同pH（2.5～3.5）的檸檬酸對組織蛋白酶K總體呈激活作用，在檸檬酸作用下，組織蛋白酶K的相對酶活性在41%～125%。且隨著檸檬酸溶液pH值的升高，組織蛋白酶 K的酶活性逐漸減弱（t=4.98、20.47，均P＜0.05，圖 3）。

3 討論

可口可樂和匯源橙汁是目前飲料市場份額占比較高的飲料，這兩種飲料由于對牙齒硬組織的化學酸蝕和破壞潛力非常強而被定義為具有極度酸蝕能力的飲料[11-12]。在口腔中除牙體硬組織外，組織蛋白酶的活性也易受到酸性環(huán)境的影響[13]。本實驗應用明膠酶譜法對可口可樂和匯源橙汁及其所含飲料酸對組織蛋白酶K活性的影響進行了觀察。

研究結(jié)果顯示，組織蛋白酶K在有可口可樂或匯源橙汁存在的條件下酶活性增加，降解膠原的量顯著增加。說明可口可樂或匯源橙汁能夠激活無活性的組織蛋白酶K酶原，產(chǎn)生具有活性的組織蛋白酶K。組織蛋白酶K作為一種蛋白水解酶，其主要底物是I型膠原[14]。Ⅰ型膠原纖維是牙本質(zhì)有機基質(zhì)和骨基質(zhì)的主要成分。組織蛋白酶K通過降解Ⅰ型膠原纖維，在骨基質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)破壞和改建中發(fā)揮重要作用。已有的研究證實，齦溝液中組織蛋白酶K活性的升高與牙槽骨吸收顯著相關[15]；并且組織蛋白酶K活性的升高與種植體周圍炎的骨吸收也密切相關[16]。提示攝入可口可樂或匯源橙汁會造成口腔環(huán)境中組織蛋白酶K活性的顯著升高，可能加速牙周炎和種植體周圍炎時牙周組織及骨組織的破壞。

本研究結(jié)果顯示，匯源橙汁對組織蛋白酶K的激活能力顯著高于可口可樂，是可口可樂的1.8倍。以pH值表示的H+濃度和飲料酸的緩沖性是決定酸性飲料酸蝕性的主要因素。本實驗中可口可樂是含有磷酸的飲料，pH值為2.5；匯源橙汁是含有檸檬酸的飲料，pH值為3.5。磷酸和檸檬酸均屬于三元酸，但是檸檬酸為有機酸，緩沖作用很強，有研究顯示使橙汁飲料pH值達到5.5～7.0所需堿的量是使可口可樂pH值達到5.5～7.0所需堿量的2倍[10]。由于緩沖作用強，匯源橙汁可以使自身pH值在較長時間內(nèi)維持在較低的水平，這可能是匯源橙汁對組織蛋白酶K的激活作用顯著高于可口可樂的原因。

Avanija等[11]對380種飲料的pH值進行檢測發(fā)現(xiàn)，93%飲料的pH值在4.0以下，磷酸和檸檬酸是大多數(shù)酸性飲料中加入的酸性成分，在酸性飲料的酸蝕特性中扮有重要角色。因此本研究評價了pH值（2.5～3.5）檸檬酸溶液和磷酸溶液對組織蛋白酶K活性的影響。

（1）檸檬酸溶液對組織蛋白酶K活性的影響：實驗結(jié)果顯示，pH值分別為2.5、3.0、3.5的3種檸檬酸溶液對組織蛋白酶K均有激活作用，組織蛋白酶K的活性隨檸檬酸溶液pH值的升高呈下降趨勢，組織蛋白酶K在檸檬酸溶液pH=2.5時顯示了最高的酶活性，相對酶活性達到125%。由此推測，攝入pH值（2.5～3.0）較低的檸檬酸飲料或食物，如檸檬汁等，會使暴露于口腔不同組織中組織蛋白酶K活性極度增加，對暴露的膠原纖維有強大的破壞作用。這種破壞作用隨檸檬酸在口腔中清除和唾液的緩沖逐漸減弱。

（2）磷酸溶液對組織蛋白酶K活性的影響：本實驗結(jié)果顯示，pH值分別為2.5、3.0、3.5的3種磷酸溶液對組織蛋白酶K均有激活作用，組織蛋白酶K的活性隨磷酸溶液pH值的升高酶活性逐漸加強。在pH3.0和pH3.5時，磷酸和檸檬酸對組織蛋白酶K的作用相當。研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K在環(huán)境pH值為4.0～5.5時，隨著環(huán)境pH值的上升，酶的活性逐漸增強，其發(fā)揮活性的最佳pH值為5.5[17-18]。因此，推測在攝入含有磷酸的飲料后，口腔環(huán)境pH值迅速降低，會使暴露于口腔不同組織中組織蛋白酶K活性增加，并發(fā)揮降解膠原基質(zhì)的作用。伴隨唾液的緩沖作用，口腔環(huán)境中pH值逐漸升高，組織蛋白酶K活性會更強，直到口腔環(huán)境pH恢復至5.5以上時，組織蛋白酶對膠原的破壞作用才逐漸減弱。

綜上所述，可口可樂和匯源橙汁及其所含的飲料酸均能使組織蛋白酶K活性增強，pH＜3.0的檸檬酸對組織蛋白酶K活性的增強作用尤為顯著。因此，攝入酸蝕性強的飲料尤其是含有檸檬酸的飲料，可能促進組織蛋白酶K介導的牙本質(zhì)及牙周組織膠原纖維降解，加速齲病、牙周炎、種植體周圍炎的進展。