從HBV特異性免疫細(xì)胞角度談慢性乙型肝炎功能性治愈

劉小菊， 張 政

1國(guó)家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(深圳市第三人民醫(yī)院)， 廣東 深圳 518112；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 感染科， 廣州 510515

目前，全球約有2.57億慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年約有88.7萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)疾病[1]。極少數(shù)的CHB患者可以通過(guò)抗病毒治療實(shí)現(xiàn)功能性治愈，即完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續(xù)檢測(cè)不到、HBeAg轉(zhuǎn)陰、伴或不伴HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，肝臟炎癥緩解和組織病理學(xué)改善，終末期肝病發(fā)生率顯著降低[2]。多數(shù)CHB患者需要進(jìn)行長(zhǎng)期甚至終身治療，這無(wú)疑給患者和衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。CHB患者實(shí)現(xiàn)功能性治愈代表患者獲得了持久的病毒學(xué)抑制和免疫學(xué)控制。長(zhǎng)期應(yīng)用一線抗病毒藥物如PEG-IFNα、核苷(酸)類似物(如替諾福韋或恩替卡韋)等可以實(shí)現(xiàn)病毒學(xué)抑制，但難以實(shí)現(xiàn)功能性治愈[3]。目前報(bào)道的抗病毒策略，包括病毒進(jìn)入抑制劑、病毒衣殼釋放抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或治療性疫苗，都未能實(shí)現(xiàn)更多功能性治愈；其主要原因是肝細(xì)胞內(nèi)仍然殘留HBV cccDNA，且目前缺乏針對(duì)HBV cccDNA的特異性靶向藥物，完全消除HBV難以實(shí)現(xiàn)[4]。HBV建立慢性感染后，長(zhǎng)期持續(xù)刺激宿主免疫細(xì)胞，肝臟微環(huán)境中特異淋巴細(xì)胞(CD8 T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)功能被抑制甚至耗竭[5-7]。HBV清除取決于有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，即HBV特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，發(fā)揮靶向抑制感染HBV的肝細(xì)胞和(或)病毒的效應(yīng)。本文從特異性免疫細(xì)胞角度出發(fā)，對(duì)HBV特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞耗竭及功能重建策略進(jìn)行總結(jié)，為恢復(fù)或增強(qiáng)抗HBV適應(yīng)性免疫提供線索，以實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV的持續(xù)免疫學(xué)控制。

1 HBV特異性T淋巴細(xì)胞耗竭及功能重建

急性自限性HBV感染多表現(xiàn)為強(qiáng)烈的、多表位、多功能性的特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)；然而慢性感染中，HBV特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)較弱且功能不足[8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，肝臟的環(huán)境特征，包括肝細(xì)胞和肝臟歸巢細(xì)胞的耐受性以及慢性HBV感染者肝內(nèi)富集的IL-10、TGFβ和精氨酸酶等，均對(duì)T淋巴細(xì)胞功能具有不良影響。CHB患者HBV特異性T淋巴細(xì)胞并非完全功能耗竭。在低病毒載量患者中，HBV特異性T淋巴細(xì)胞可表現(xiàn)出記憶樣表型，推測(cè)可能與接受較弱的HBV抗原持續(xù)刺激有關(guān)。PD-1等共抑制分子在調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞效應(yīng)作用以及T淋巴細(xì)胞衰竭中起著核心作用。HBV特異性T淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，不僅取決于感染的階段，還取決于靶向的HBV表位。不同表位的HBV特異性CD8 T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)分子的表達(dá)和抗病毒功能上也有所不同。與核心抗原(HBV-core)特異性CD8 T淋巴細(xì)胞相比，聚合酶(HBV-pol)特異性CD8 T淋巴細(xì)胞則表現(xiàn)出更嚴(yán)重的耗竭狀態(tài)和更低的增殖能力。因此，不同感染階段不同表位特異性T淋巴細(xì)胞具有不同的表型和功能特征[11-12]。在設(shè)計(jì)和監(jiān)測(cè)HBV特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，必須考慮不同表位引起的潛在偏倚。而且不同表位HBV特異性T淋巴細(xì)胞具有不同的治療潛力，并且會(huì)對(duì)PD-1阻斷劑的免疫治療產(chǎn)生不同的應(yīng)答。

記憶CD8 T淋巴細(xì)胞庫(kù)特異識(shí)別病毒后能夠大量擴(kuò)增，并顯著抑制HBV[8]。逆轉(zhuǎn)耗竭T淋巴細(xì)胞功能，可恢復(fù)對(duì)CHB患者的保護(hù)性免疫。額外添加細(xì)胞因子可挽救耗竭T淋巴細(xì)胞功能。例如，轉(zhuǎn)錄因子T-bet調(diào)節(jié)效應(yīng)CD8 T淋巴細(xì)胞中IFNγ和細(xì)胞毒性分子的產(chǎn)生，其表達(dá)可控制病毒慢性感染。病毒抗原和IL-2刺激誘導(dǎo)T-bet表達(dá)可以部分恢復(fù)功能受損CD8 T淋巴細(xì)胞的功能。IL-12也可增強(qiáng)對(duì)病毒的控制，聯(lián)合應(yīng)用IL-12與阻斷PD-1途徑可進(jìn)一步提高CD8 T淋巴細(xì)胞功能[13]。IL-21也具有促進(jìn)HBV特異性CD8 T淋巴細(xì)胞的增殖能力[14]。

研究[15]還發(fā)現(xiàn)，HBeAg陰性患者在停止核苷(酸)類似物治療后，HBV復(fù)發(fā)可能會(huì)改變特異性T淋巴細(xì)胞表型，并增強(qiáng)其體外對(duì)抗原的反應(yīng)性；阻斷PD-L1可以進(jìn)一步增強(qiáng)這些HBV特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。例如，一項(xiàng)停藥研究[16]顯示，長(zhǎng)期抗病毒治療的患者外周血HBV聚合酶/核心抗原特異性T淋巴細(xì)胞頻率逐漸增加，并與停藥后肝炎不復(fù)發(fā)相關(guān)；這也提示HBV特異性T淋巴細(xì)胞增高患者可以停止抗病毒治療，為臨床提供了一種潛在的免疫學(xué)標(biāo)志。然而，與急性HBV感染者相比，長(zhǎng)期治療患者HBV特異性T淋巴細(xì)胞的抗病毒能力仍不健全，還需要其他措施來(lái)挽救其功能損傷。研究[17]發(fā)現(xiàn)，識(shí)別HBV表位的PD-1hiT淋巴細(xì)胞顯著上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1，Glut1hiHBV特異性T淋巴細(xì)胞依賴于葡萄糖供應(yīng)。因此，細(xì)胞的線粒體功能障礙大大限制了耗竭的HBV特異性T淋巴細(xì)胞的代謝可塑性；用線粒體靶向的抗氧化劑有望改善耗竭的HBV特異性CD8 T淋巴細(xì)胞抗病毒功能[5]。

2 HBV特異性B淋巴細(xì)胞耗竭及功能重建

表面抗體的產(chǎn)生標(biāo)志著CHB功能性治愈，此時(shí)CHB患者體內(nèi)B淋巴細(xì)胞能夠分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)一系列HBV抗原的多克隆抗體。很多研究[18]已經(jīng)提示，B淋巴細(xì)胞在控制HBV感染中起著重要作用，但抗原特異性B淋巴細(xì)胞的檢測(cè)一直是個(gè)技術(shù)難題，阻礙了HBV特異性B淋巴細(xì)胞功能的研究。

近期研究[7]顯示，利用雙熒光染料偶聯(lián)病毒特異抗原的方法可檢測(cè)到外周及組織中特異性B淋巴細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HBV表面抗原特異性B淋巴細(xì)胞在慢性HBV感染中持續(xù)存在，但與HBsAg滴度無(wú)顯著相關(guān)性。這種細(xì)胞也存在于乙型肝炎疫苗接種者和HBV感染恢復(fù)者體內(nèi)。利用高通量流式細(xì)胞分選技術(shù)可以從CHB患者中分離出HBsAg特異B淋巴細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)提示，CHB患者HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞增殖能力降低，且在刺激后不能產(chǎn)生抗-HBs。但HBsAg轉(zhuǎn)陰患者，其HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞卻能在刺激后產(chǎn)生抗-HBs，提示其功能損傷獲得恢復(fù)。進(jìn)一步分析顯示，CHB患者HBsAg特異B淋巴細(xì)胞和總B淋巴細(xì)胞中經(jīng)典記憶性細(xì)胞亞群減少，而非經(jīng)典記憶B淋巴細(xì)胞增加。這種非經(jīng)典記憶B淋巴細(xì)胞主要特征是CD21和CD27低表達(dá)，但抑制性標(biāo)志物PD-1和轉(zhuǎn)錄因子T-bet高表達(dá)；并且這類細(xì)胞在肝臟感染部位積聚，其抗病毒/炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生等能力以及分化成抗體生成細(xì)胞的能力均顯著降低。這種表型和功能障礙不僅局限于HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞，還影響HBV感染者的整體B淋巴細(xì)胞群。阻斷PD-1或添加IL-2、IL-21和CD40配體可在體外部分恢復(fù)HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞功能[6-7,19]。因此，B淋巴細(xì)胞功能障礙是HBV感染者不能產(chǎn)生抗-HBs的主要原因之一。然而，還有許多問(wèn)題懸而未決。例如，導(dǎo)致HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞功能障礙的細(xì)胞和分子機(jī)制還不清楚，機(jī)體B淋巴細(xì)胞亞群受損機(jī)制和臨床意義也不明確。未來(lái)研究應(yīng)力圖尋找恢復(fù)HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞功能的最佳策略。

利用雙熒光染料偶聯(lián)的HBcAg同樣可以檢測(cè)到HBcAg特異性B淋巴細(xì)胞。研究[20]發(fā)現(xiàn)，CHB患者體內(nèi)HBcAg特異性B淋巴細(xì)胞頻率高于HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞。并且，與HBsAg特異性B淋巴細(xì)胞不同，HBcAg特異性B淋巴細(xì)胞在體外可以有效分化為抗體分泌細(xì)胞。在慢性HBV感染者中，血清抗HBcAg水平與HBcAg特異性B淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能顯著相關(guān)[20]。值得注意的是，HBcAg特異性B淋巴細(xì)胞除了產(chǎn)生抗-HBc外，可能還具有其他免疫調(diào)節(jié)作用。例如，抗-HBc可能會(huì)推動(dòng)急性暴發(fā)性肝炎的發(fā)生發(fā)展；在肝臟中抗-HBc與HBcAg形成大顆粒抗原抗體復(fù)合物，可以激活經(jīng)典的補(bǔ)體途徑從而加重肝壞死[21]。因此，將來(lái)研究應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)抗-HBc在CHB中的發(fā)病機(jī)理研究，以及HBcAg特異性B淋巴細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力與功能性治愈的關(guān)系研究。

3 總結(jié)與展望

總之，從免疫學(xué)角度來(lái)看，實(shí)現(xiàn)CHB功能性治愈治療HBV慢性感染的首要目標(biāo)應(yīng)該是恢復(fù)患者HBV特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能。將來(lái)免疫治療策略需要聯(lián)合應(yīng)用抗病毒藥物，才能有效降低HBV抗原載量并恢復(fù)耗竭的抗HBV特異性免疫細(xì)胞功能。