免疫控制與慢性乙型肝炎功能性治愈的進(jìn)展與挑戰(zhàn)

鄭 昕， 劉 嘉， 吳 珺， 孟忠吉， 陸蒙吉， 楊東亮

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 感染病科， 武漢 430022； 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 感染病科，湖北 十堰 442008； 3 德國杜伊斯堡-埃森大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病毒研究所， 德國 埃森 45122

乙型肝炎疫苗接種極大地控制了HBV的傳播。但是，全球仍有約3億慢性HBV感染者，持續(xù)性HBV感染所致肝硬化及肝癌等終末期肝病依然是人類健康的重大威脅之一。雖然IFNα與核苷(酸)類似物(NAs)已應(yīng)用于慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治療多年，并取得了巨大進(jìn)步。但是IFNα仍存在副作用較大，抑制病毒復(fù)制作用有限，以及NAs需要長期服藥，停藥后易反彈，患者依從性不佳等問題[1-4]。

因此，在如何使得更多CHB患者實(shí)現(xiàn)功能性治愈方面仍存在巨大需求。需要在基礎(chǔ)研究、抗病毒藥物研發(fā)、個(gè)體化治療預(yù)測和評估指標(biāo)探索以及綜合利用抗病毒與免疫調(diào)節(jié)藥物開展功能性治愈新策略等方面深入研究。本期有幸邀請到國內(nèi)長期從事CHB基礎(chǔ)和臨床研究，尤其是在HBV感染免疫方面多有深入探索的部分團(tuán)隊(duì)圍繞HBV感染免疫控制與CHB功能性治愈研究進(jìn)展以及各自工作體會(huì)進(jìn)行了文獻(xiàn)回顧和綜述。相信將有助于加深對于該領(lǐng)域進(jìn)展的了解。

1 HBV感染的免疫控制

HBV感染的結(jié)局可以表現(xiàn)為急性一過性感染或持續(xù)的慢性感染。雖然迄今對于其詳細(xì)分子機(jī)制尚未完全闡明，但是已有的研究提示，HBV分子生物學(xué)特性、宿主的遺傳及免疫學(xué)因素以及兩者之間的相互作用是影響HBV感染結(jié)局的重要因素。當(dāng)比較急性乙型肝炎和CHB的免疫特征時(shí)，人們普遍認(rèn)為功能失調(diào)的免疫應(yīng)答在持續(xù)性HBV感染和肝臟炎癥中起著重要作用[5-8]。

已知HBV cccDNA在感染肝細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)以微染色體的形式持續(xù)穩(wěn)定存在，難以被靶向調(diào)控和清除。圍繞HBV cccDNA持續(xù)沉默或降解清除機(jī)制及策略的研究是當(dāng)前CHB功能性治愈目標(biāo)的重點(diǎn)之一[9]。本期復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院袁正宏教授團(tuán)隊(duì)綜述了目前對cccDNA基本生物學(xué)特性、轉(zhuǎn)錄和代謝調(diào)控機(jī)制及相關(guān)宿主因子的認(rèn)知，重點(diǎn)分析了cccDNA沉默清除的可能途徑和靶向調(diào)控策略。

慢性HBV感染的免疫應(yīng)答特點(diǎn)包括：(1)HBV特異性CD4和CD8 T淋巴細(xì)胞功能障礙和衰竭；(2)樹突狀細(xì)胞(DC)和自然殺傷細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙；(3)調(diào)控因子表達(dá)上調(diào)/增強(qiáng)，包括免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1、CTLA-4、T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白域和黏蛋白域3；(4)先天免疫應(yīng)答受損，尤其是Toll樣受體(TLR)下調(diào)和功能障礙等[10-11]。本期華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院劉嘉教授團(tuán)隊(duì)就肝內(nèi)固有抗原遞呈細(xì)胞調(diào)控抗乙型肝炎免疫應(yīng)答的作用及機(jī)制進(jìn)行了介紹。陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院鄧國宏教授團(tuán)隊(duì)結(jié)合自己的研究體會(huì)及同行近期研究結(jié)果就CHB患者的HBV特異性T淋巴細(xì)胞是否處于耗竭狀態(tài)進(jìn)行了深入討論。

為了維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境平衡，肝內(nèi)免疫系統(tǒng)優(yōu)先誘導(dǎo)對從門靜脈進(jìn)入抗原的耐受。在持續(xù)性HBV感染中，肝臟中的抑制機(jī)制調(diào)節(jié)和抑制了T淋巴細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)炎癥反應(yīng)可在肝內(nèi)原位誘導(dǎo)多條抑制通路，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能抑制。受損的肝細(xì)胞可釋放精氨酸酶和吲哚胺2,3-雙氧酶等，導(dǎo)致氨基酸的消耗，而氨基酸對維持T淋巴細(xì)胞功能非常重要。精氨酸損耗使得T淋巴細(xì)胞CD3ζ水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞受體-通路功能障礙。肝內(nèi)炎癥募集調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和髓系來源的抑制性細(xì)胞和活化的肝星狀細(xì)胞，導(dǎo)致IL-10和TGFβ增加。雖然肝內(nèi)抑制機(jī)制對于保護(hù)由炎癥引起的嚴(yán)重?fù)p害至關(guān)重要，但是，也同時(shí)進(jìn)一步損害了HBV特異性T淋巴細(xì)胞的功能[12]。

一般而言，高水平HBV DNA、HBsAg和HBeAg有助于維持針對HBV的特異性免疫耐受。因此，通過各種藥物減少外周血和肝內(nèi)的HBV顆粒和蛋白是重新建立有效的HBV特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的先決條件。此外，人們發(fā)現(xiàn)，向CHB患者過繼轉(zhuǎn)移抗-HBs陽性者骨髓可以清除受者體內(nèi)的HBV，以及通過肝移植將抗-HBs陽性供者免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移到HBV感染受者體內(nèi)能夠部分控制移植肝臟的HBV再感染，這些均提示免疫調(diào)節(jié)是有望實(shí)現(xiàn)CHB功能性治愈的重要策略之一[13]。

2 CHB的功能性治愈策略

2.1 基于現(xiàn)有抗病毒藥物的治療策略 如前所述，目前用于CHB抗病毒治療主要藥物包括IFNα與NAs兩大類，NAs主要以抑制病毒復(fù)制為主，但是HBsAg陰轉(zhuǎn)率普遍不高；IFNα具有抗病毒與免疫調(diào)節(jié)雙重作用，理論上講應(yīng)具有較高的HBsAg陰轉(zhuǎn)率和血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，但無論是普通IFNα還是PEG-IFNα，治療48周后總體HBsAg陰轉(zhuǎn)率約3%。近十余年來，國內(nèi)外研究表明，利用NAs與IFNα聯(lián)合治療有可能提高部分CHB患者HBsAg陰轉(zhuǎn)率。具體方案包括起始聯(lián)合、序貫/聯(lián)合、中間聯(lián)合以及脈沖(間斷)聯(lián)合等。治療48周時(shí)HBsAg陰轉(zhuǎn)率可提高到7.3%～26%，對于部分優(yōu)勢患者甚至更佳。提示NAs與IFNα聯(lián)合治療策略有利于發(fā)揮現(xiàn)有抗病毒藥物的潛能，有助于更多患者實(shí)現(xiàn)功能性治愈的目標(biāo)[14-17]。

2.2 基于免疫控制機(jī)制的治療策略

2.2.1 臨床研究 隨著對HBV感染免疫控制機(jī)制認(rèn)識的深入，人們意識到在有效抑制HBV復(fù)制的基礎(chǔ)上，如果能夠聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)藥物如IL-2、IL-12、GM-CSF、Ⅲ型IFN (PEG-IFNλ)、重組乙型肝炎疫苗、合成肽疫苗、HBsAg/抗-HBs免疫復(fù)合物等，不僅有助于恢復(fù)并提高機(jī)體的抗病毒免疫功能，亦有助于提高HBsAg陰轉(zhuǎn)率。國內(nèi)學(xué)者聯(lián)合NAs、IFN、GM-CSF及乙型肝炎疫苗使HBeAg陽性CHB初治患者的HBsAg陰轉(zhuǎn)率達(dá)到9.2%，NAs經(jīng)治CHB患者HBsAg陰轉(zhuǎn)率達(dá)到15.38%，同時(shí)對肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg和cccDNA的表達(dá)均有明顯的抑制作用。此外，治療性DNA疫苗、自體DC疫苗、抗PD-1抗體、TLR-7/8受體激動(dòng)劑以及新型的生物免疫調(diào)節(jié)劑AIC649等多種免疫調(diào)節(jié)劑正在臨床試驗(yàn)中[5-8]。

總之，基于免疫控制的治療策略是通過活化和調(diào)節(jié)肝內(nèi)天然免疫和獲得性免疫、靶向精準(zhǔn)清除HBV感染的肝細(xì)胞，并減少肝組織損傷。本期南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院張小勇教授團(tuán)隊(duì)及南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市第三人民醫(yī)院張政教授團(tuán)隊(duì)分別圍繞HBV感染相關(guān)天然免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展、激活肝內(nèi)天然免疫應(yīng)答治愈CHB的新策略以及恢復(fù)或者增強(qiáng)HBV特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CHB功能性治愈策略進(jìn)行了詳細(xì)介紹。

2.2.2 基礎(chǔ)研究 針對TLR配體、RIG-I激動(dòng)劑、STING激動(dòng)劑、APOBEC3等天然免疫分子通路的基礎(chǔ)研究提示，天然免疫的觸發(fā)導(dǎo)致抗HBV應(yīng)答和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并在不同程度上抑制病毒復(fù)制[18-25]。然而，僅激活天然免疫可能無法控制HBV感染，適應(yīng)性免疫的誘導(dǎo)可能更為重要[26-29]。阻斷免疫負(fù)調(diào)控信號進(jìn)而增強(qiáng)特異性T淋巴細(xì)胞免疫的策略取得了一定進(jìn)展，如聯(lián)合應(yīng)用PD-L1抗體、恩替卡韋和DNA免疫在土撥鼠肝炎病毒感染的土撥鼠中成功增強(qiáng)了病毒特異性T淋巴細(xì)胞功能，導(dǎo)致病毒復(fù)制持續(xù)受到了抑制，在部分動(dòng)物體內(nèi)清除了土撥鼠肝炎病毒表面抗原并產(chǎn)生了土撥鼠肝炎病毒表面抗體[30-32]。

此外，蛋白質(zhì)/多肽疫苗、DNA疫苗、基于病毒的疫苗、DC疫苗也被用于探索恢復(fù)和重建慢性HBV感染者受損的適應(yīng)性免疫。鑒于降低HBV抗原尤其是HBsAg水平將有助于適應(yīng)性免疫的恢復(fù)，有學(xué)者對抗-HBs介導(dǎo)的免疫治療策略進(jìn)行了探索，雖然可以降低HBV DNA水平，但并未能實(shí)現(xiàn)持久的HBV抑制[33-35]。隨著基因編輯和細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)步，HBV特異性T淋巴細(xì)胞療法成為可能。研究[36]表明，利用嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞免疫療法和T淋巴細(xì)胞受體-T淋巴細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)生的HBV特異性T淋巴細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移有利于HBV感染的免疫控制。但是其治療CHB的有效性和安全性尚有待研究。

3 免疫控制治療策略相關(guān)預(yù)測和評估指標(biāo)

3.1 病毒學(xué)生物標(biāo)志物 潛在的病毒學(xué)生物標(biāo)志物包括如下幾種。(1)血清HBsAg：由HBV cccDNA或整合的病毒DNA指導(dǎo)表達(dá)。HBsAg陰轉(zhuǎn)是功能性治愈的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。需要建立更敏感的以及能夠區(qū)分來自整合HBV DNA和cccDNA的HBsAg的檢測方法。(2)HBV cccDNA：迄今，尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的肝內(nèi)HBV cccDNA定量和轉(zhuǎn)錄活性分析，基于定量PCR的檢測方法正在標(biāo)準(zhǔn)化。(3)循環(huán)HBV RNA：可以作為肝內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的直接指標(biāo)。但是對于循環(huán)中HBV RNA的多樣性、它們是如何被包裝和釋放的以及它們與cccDNA水平的相關(guān)性仍有待深入研究。定量分析方法也需要進(jìn)一步優(yōu)化。(4)血清乙型肝炎核心相關(guān)抗原(HBcrAg)：HBcrAg水平與血清HBV DNA、肝內(nèi)cccDNA和總HBV DNA水平密切相關(guān)，與血清HBsAg水平中度相關(guān)。HBcrAg的存在似乎預(yù)示著NAs治療中止后病毒復(fù)發(fā)。由于許多HBeAg陰性患者無法檢測到HBcrAg使得其臨床價(jià)值受到限制，提高檢測靈敏度有可能解決這一問題[37-38]。

3.2 免疫學(xué)生物標(biāo)志物 由于CHB患者個(gè)體間遺傳和免疫學(xué)背景差異較大，對外周血及肝內(nèi)免疫細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，將有助于基于感染免疫控制的功能性治愈策略的療效預(yù)測及評估。流式細(xì)胞術(shù)、ELISOPT和ELISA等技術(shù)已經(jīng)廣泛用于分析HBV感染者體內(nèi)細(xì)胞因子水平、免疫細(xì)胞表型和功能。但是，這些技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化如HBV肽庫的選擇和四聚體質(zhì)量的控制仍是巨大挑戰(zhàn)。此外，雖然肝內(nèi)免疫細(xì)胞及單細(xì)胞分析更能準(zhǔn)確和全面反映患者免疫狀態(tài)，但是肝活檢的有創(chuàng)性極大地限制了其臨床廣泛應(yīng)用。隨著對B淋巴細(xì)胞在HBV感染免疫控制中重要性的認(rèn)識，建立和完善B淋巴細(xì)胞表型及功能分析方法已成為乙型肝炎功能性治愈研究中亟待解決的重要問題之一[5-6]。

4 小結(jié)與展望

實(shí)現(xiàn)CHB功能性治愈有兩種策略：(1)利用直接抗病毒藥物在不殺死感染細(xì)胞的情況下抑制HBV復(fù)制，進(jìn)而清除HBV；(2)利用免疫調(diào)節(jié)藥物及分子恢復(fù)和重建CHB患者受損的免疫控制機(jī)制，安全清除HBV及其感染的肝細(xì)胞?，F(xiàn)有資料提示，聯(lián)合兩種策略對患者進(jìn)行個(gè)體化治療與管理將是大多數(shù)CHB患者實(shí)現(xiàn)功能性治愈目標(biāo)的重要途徑。但是，如何實(shí)現(xiàn)兩者的有效聯(lián)合與精準(zhǔn)調(diào)控，既能實(shí)現(xiàn)CHB的“治愈”，又不會(huì)造成嚴(yán)重的肝損傷和疾病進(jìn)展仍是有待深入研究和解決的重大課題。

在HBV感染免疫控制機(jī)制中，HBV特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答扮演了極為重要的角色。但是，其他免疫細(xì)胞如B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、其他非實(shí)質(zhì)性肝細(xì)胞、肝內(nèi)微環(huán)境，以及非免疫性遺傳等因素對控制HBV復(fù)制及清除HBV的重要作用亦越來越得到重視。這方面的研究值得進(jìn)一步深入。此外，深入探索CHB免疫控制治療策略相關(guān)的預(yù)測和評估指標(biāo)，對CHB患者肝內(nèi)受HBV感染肝細(xì)胞數(shù)量的精確量化研究不僅有利于更多患者實(shí)現(xiàn)功能性治愈，而且也有助于避免免疫調(diào)節(jié)治療相關(guān)肝臟毒性，使得治療過程更加安全。

總之，不論是在基礎(chǔ)研究、新藥研發(fā)、最優(yōu)治療目標(biāo)人群確定、療效預(yù)測和評估指標(biāo)，還是抗病毒與免疫調(diào)節(jié)聯(lián)合治療方案及個(gè)體化治療與管理策略等方面仍存在許多有待解決的問題和挑戰(zhàn)，但CHB的功能性治愈仍是可實(shí)現(xiàn)的治療目標(biāo)。相信隨著研究的深入，消除HBV對人類健康的威脅將不再遙遠(yuǎn)。