腸道菌群與原發(fā)性肝癌

王飛雪，于 君

原發(fā)性肝癌(PLC)是我國乃至全球惡性程度較高的消化道腫瘤。2018年全球腫瘤流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，肝癌在腫瘤發(fā)病率和相關(guān)死亡率方面分別位列第六位和第四位[1]。晚期診斷、術(shù)后易復(fù)發(fā)和治療選擇局限是造成肝癌患者預(yù)后差的主要原因。提高疾病的早期診斷和改善臨床治療效果對于解決目前原發(fā)性肝癌高死亡率具有重要的意義。近年來，大量關(guān)于腸道菌群的研究揭示了這個既往“被忽視的器官”在人類健康和疾病中扮演的重要角色。從早期的借助測序技術(shù)進(jìn)行的菌群分析的描述性研究到現(xiàn)階段關(guān)于腸道菌群在健康狀態(tài)和疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制探索，越來越多的證據(jù)表明腸道菌群在包括炎癥性疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，將菌群相關(guān)的研究成果轉(zhuǎn)為為臨床應(yīng)用，包括疾病的診斷和治療，是目前研究的方向。在這里，我們對腸道菌群與原發(fā)性肝癌的相關(guān)研究進(jìn)行了闡述。

1 腸肝軸和腸粘膜屏障：腸道菌群和肝癌之間的解剖學(xué)基礎(chǔ)

腸肝軸的概念最早是由病理生理學(xué)家提出，用來描述腸道和肝臟之間的雙向聯(lián)系。一方面，門脈系統(tǒng)收集來自腸道的血液為肝臟提供了將近75%血供，包括營養(yǎng)物質(zhì)和腸道菌群的代謝產(chǎn)物都可以經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟；另一方面，肝臟生成的各種物質(zhì)可以經(jīng)過膽道系統(tǒng)進(jìn)入腸道，進(jìn)而影響腸道的微環(huán)境。由門脈系統(tǒng)和膽管系統(tǒng)組成這種雙向的肝腸軸聯(lián)系是腸道菌群和肝臟疾病相互作用的解剖學(xué)基礎(chǔ)。與腸肝軸相對應(yīng)的功能學(xué)結(jié)構(gòu)是腸黏膜屏障，它是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有的觀點(diǎn)認(rèn)為腸黏膜屏障可以分為三部分，首先是位于黏膜上皮細(xì)胞表面的粘液層，包括杯狀細(xì)胞分泌的抗菌肽和各種免疫球蛋白，是分隔機(jī)體與外界環(huán)境的第一道生理屏障；其次，由緊密連接的腸道黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)成腸黏膜的物理屏障，保證了腸黏膜的選擇性透過性；最后，位于上皮黏膜細(xì)胞間的各種免疫細(xì)胞構(gòu)成腸道黏膜的免疫屏障[2]。多重屏障使腸肝軸不僅僅是簡單的解剖學(xué)通路，更是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的功能性結(jié)構(gòu)，它保證了即使大量的外界微生物和刺激因子通過腸道，只有有限的物質(zhì)可以通過腸粘膜屏障參與到腸肝循環(huán)中。

2 菌群失衡和腸泄漏：腸道菌群作用于肝癌的表現(xiàn)

肝腸循環(huán)及正常的腸道黏膜屏障是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的必要條件。在肝癌患者中，腸道菌群失衡和腸泄漏(leaky gut)則是兩個重要表現(xiàn)，這也從側(cè)面反映了腸道菌群在疾病發(fā)生發(fā)展中的可能作用。Qin et al在對肝硬化患者和健康人群的糞便進(jìn)行菌群分析和宏基因組關(guān)聯(lián)分析，得到肝硬化患者特征性腸道菌群和相關(guān)基因譜，認(rèn)為在肝硬化患者中明顯改變的腸道菌群組成有一定的臨床診斷價值[3]。通過對來自中國不同區(qū)域的419例糞便樣本進(jìn)行16sRNA測序分析，結(jié)果顯示從健康狀態(tài)到肝硬化階段，腸道菌群豐度逐漸降低。但是，與肝硬化患者比，早期肝癌伴肝硬化患者菌群豐度有所升高[4]。同樣，在基于西方人群的研究中，在比較分析非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver diseases, NAFLD)、NAFLD相關(guān)性肝硬化、肝癌患者和健康對照腸道菌群譜發(fā)現(xiàn)，不同疾病階段腸道菌群譜與系統(tǒng)性炎癥密切相關(guān)[5]。不同疾病階段菌群組成的動態(tài)變化反映了腸道菌群和肝癌發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系。

腸泄漏是針對正常的腸黏膜屏障受損提出的一個通俗的概念。大量的研究證據(jù)表明腸黏膜通透性改變是一種普遍的病理學(xué)信號，在包括炎癥性疾病、代謝性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病等多種疾病中均有所表現(xiàn)[6-7]。根據(jù)腸黏膜屏障的主要構(gòu)成，多種檢測腸道通透性的方法在臨床和基礎(chǔ)研究中得到應(yīng)用。人口服攝取探針后，通過檢測尿液中分泌比例可以間接地反映腸道通透性。在活檢組織，通過電子顯微鏡和蛋白質(zhì)電泳方法檢測緊密連接蛋白，如ZO-1[8]和 Claudin-1[9]表達(dá)可以直接提示腸道黏膜屏障的完整性[10]。除此之外，檢測血清革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁主要成分脂多糖(LPS)等內(nèi)毒素的方法是反映腸黏膜屏障功能的間接方法。Higashi Y比較分析了肝癌患者腸道Claudin-1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞低分化和門脈浸潤密切相關(guān)[11]。在一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究中，F(xiàn)edirko V分析了肝癌患者血清抗脂多糖水平，結(jié)果證實(shí)抗體響應(yīng)率與肝癌發(fā)生風(fēng)險呈正相關(guān)，由此認(rèn)為腸泄漏導(dǎo)致的菌群產(chǎn)物異位分布在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色[12]?；谌巳旱木悍治龊湍c黏膜屏障破壞的描述性分析可以反映腸道菌群和肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，但并不足以作為說明腸道微生物參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。無菌小鼠模型和抗生素介導(dǎo)的菌群清除的動物實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證腸道微生物在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮的作用提供了直接的有力證據(jù)，多個研究表明清除腸道微生物可以抑制肝癌的進(jìn)展[13,14]。

3 免疫和代謝：腸道菌群作用于肝癌的主要機(jī)制

病毒感染、酒精和代謝異常等多種慢性致病因素導(dǎo)致的菌群失衡和腸泄漏使肝臟和腸道菌群及其代謝產(chǎn)物直接接觸，進(jìn)而引起菌群和肝臟的直接作用?，F(xiàn)有的觀點(diǎn)認(rèn)為，免疫和代謝是菌群和肝臟相互作用的主要機(jī)制。病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)是腸道菌群通過介導(dǎo)免疫通路影響肝癌發(fā)生發(fā)展的理論基礎(chǔ)。腸道菌群及其相關(guān)產(chǎn)物作為外界刺激因子可以被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別，引起一系列的免疫反應(yīng)。目前，研究比較充分的是脂多糖-Toll樣受體4(TLR4)通路。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可以激活TLR4，引起相關(guān)促炎反應(yīng)，并能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的分化，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[13-15]。另一方面，相關(guān)研究證實(shí)腸道菌群也參與了肝臟腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控。在肥胖相關(guān)性肝癌的動物模型中，腸道革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的主要成分脂壁酸(lipoteichoic acid，LTA)向肝臟移位可以調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的表型變化和上調(diào)環(huán)氧合酶2(COX2)，后者可以抑制抗腫瘤免疫，促進(jìn)肝癌的發(fā)展[16]。

代謝是腸道菌群參與肝癌進(jìn)展的另一重要機(jī)制。目前，大量研究證實(shí)膽汁酸代謝在腸道菌群和肝癌的聯(lián)系中發(fā)揮重要作用[17,18]。在肥胖相關(guān)性肝癌的研究中，Yoshimoto S et al證實(shí)肥胖引起菌群代謝產(chǎn)物次級膽汁酸脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)水平上升，通過門脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟的DCA可以引起肝臟星狀細(xì)胞向衰老相關(guān)的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)轉(zhuǎn)化，從而分泌各種促炎因子和促癌分子，促進(jìn)肝癌進(jìn)展[19]。Greten TF團(tuán)隊(duì)在2018年發(fā)表于Science上的研究，借助于抗生素介導(dǎo)的菌群清除模型和相關(guān)免疫缺陷小鼠模型，證實(shí)腸道菌群通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝影響肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面趨化因子CXCL16表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)NKT細(xì)胞在肝臟中的募集，控制抗腫瘤免疫，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展[14]。短鏈脂肪酸(SCFA)是另一類主要的菌群代謝產(chǎn)物。Singh et al研究發(fā)現(xiàn)可溶性纖維素飲食在改善代謝綜合征的同時引起膽汁淤積并促進(jìn)肝癌的發(fā)生，這一促進(jìn)作用依賴于腸道菌群分解纖維素產(chǎn)生的SCFA而實(shí)現(xiàn)[20]，這一研究結(jié)果對高纖維素飲食有利于健康的傳統(tǒng)觀念產(chǎn)生了極大的沖擊。通過建立高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD相關(guān)性HCC模型，我們團(tuán)隊(duì)的最新研究證實(shí)高膽固醇可以通過引起腸道菌群和菌群代謝產(chǎn)物的改變，包括?；悄懰?taurocholic acid，TCA)的增加和3-吲哚丙酸(3-indolepropionic acid，IPA)的減少，促進(jìn)肝癌的發(fā)生，給予模型小鼠降脂藥物處理和腸道菌群調(diào)控可以有效緩解腫瘤進(jìn)展[21]。現(xiàn)階段，對于腸道菌群、代謝、免疫和肝癌之間的復(fù)雜聯(lián)系尚需更加全面系統(tǒng)和深入的研究。

4 早期診斷、干預(yù)和治療：腸道菌群在肝癌患者中的臨床應(yīng)用

從臨床發(fā)現(xiàn)問題，最終服務(wù)于臨床是醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的終極目標(biāo)。如何將腸道菌群應(yīng)用于肝癌的早期防治和治療是我們進(jìn)行大量基礎(chǔ)研究的主要目的。將腸道菌群應(yīng)用到肝癌的早期診斷和臨床治療是目前的主要方向。在肝癌的早期診斷方面，通過分析和比較不同階段慢性肝臟疾病和肝癌患者腸道菌群組成，鑒定出肝癌患者的特征性菌群譜，作為臨床診斷標(biāo)記物是一個方向。通過分析中國人群早期肝癌患者和健康對照在慢性肝臟疾病不同階段的菌群組成，研究者確定了最佳的30種微生物標(biāo)記物，并在中國西北部和中部地區(qū)的隊(duì)列研究中得到了跨區(qū)域交叉驗(yàn)證，證實(shí)了特征性腸道菌群標(biāo)記物在肝癌診斷中的巨大的應(yīng)用潛力[4]。也有研究者從血清循環(huán)菌群及微生物DNA入手，通過對肝癌、肝硬化和健康人群血清進(jìn)行宏基因組學(xué)分析，結(jié)合針對血清微生物DNA的高通量焦磷酸測序，定義了一組肝癌患者特異性的血清微生物宏基因組學(xué)特征譜，并構(gòu)建了基于5個微生物基因的肝癌診斷模型，其受試者工作特征曲線下面積(AUC)可以達(dá)到0.879，準(zhǔn)確度也達(dá)到了0.816[22]。與傳統(tǒng)的診斷手段相比，通過分析比較單純肝硬化患者和肝硬化伴早期肝癌患者腸道菌群組成，基于腸道菌群和相關(guān)代謝產(chǎn)物尋找特異性標(biāo)記物可以實(shí)現(xiàn)對肝硬化患者的定期無創(chuàng)檢測，從而提高肝癌的早期診斷。

將腸道菌群應(yīng)用于高危人群的早期預(yù)防和輔助臨床治療是其臨床應(yīng)用的另一主要方向。一方面，從腸道菌群參與肝癌發(fā)生的分子機(jī)制出發(fā)，開發(fā)相關(guān)靶點(diǎn)藥物，包括TLR拮抗劑、FXR激動劑和相關(guān)細(xì)菌代謝產(chǎn)物抑制劑，應(yīng)用于高危人群早期預(yù)防是腸道菌群臨床轉(zhuǎn)化的主要思路，臨床已經(jīng)開展相關(guān)靶點(diǎn)藥物的研究。另一方面，益生菌和菌群移植是調(diào)控腸道菌群的直接方法。在基于動物模型的研究中，肝癌小鼠模型在接受混合益生菌處理后，腫瘤大小和個數(shù)顯著下降，伴隨腸道菌群失衡的改善和免疫微環(huán)境的變化，具體表現(xiàn)為可以有益菌增加、抑制炎癥性代謝產(chǎn)物增加[23]。但是，通過直接調(diào)節(jié)腸道菌群對肝癌高?；颊哌M(jìn)行干預(yù)和治療在臨床上應(yīng)用的可行性并不大，目前還沒有相關(guān)的臨床研究。此外，將腸道菌群應(yīng)用到肝癌患者的臨床治療也是一個潛在的方向。鑒于腸道菌群在調(diào)節(jié)腫瘤免疫的重要作用，是否能夠?qū)⒕赫{(diào)節(jié)運(yùn)用到肝癌患者的臨床聯(lián)合治療是一個很好的方向。腸道菌群和腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)答已在黑色素瘤和肺癌中得到了初步驗(yàn)證。那么，能否通過菌群調(diào)節(jié)提高肝癌患者的免疫治療效果？一項(xiàng)在肝癌患者中聯(lián)合應(yīng)用PD-1受體抑制劑(Nivolumab)、萬古霉素和他達(dá)拉非的臨床研究(NCT03785210)目前正在招募患者階段。毫無疑問，該研究結(jié)果將對肝癌患者的免疫治療產(chǎn)生重大的影響。

我們系統(tǒng)總結(jié)了腸道菌群參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程的理論依據(jù)和現(xiàn)階段的研究進(jìn)展，腸道菌群在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和代謝方面的巨大潛力及其與肝臟之間密切的解剖學(xué)和功能聯(lián)系為它在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用研究提供了理論依據(jù)。將基于菌群在肝癌發(fā)生中相關(guān)基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用是目前肝癌診斷和治療領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)，能否將腸道菌群應(yīng)用于肝癌患者的早期診斷并聯(lián)合應(yīng)用于免疫治療，將有待進(jìn)一步研究和闡明。