真菌在大曲酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

劉緒興 ，程 鵬，陳 才，馮 潛，文 章，楊生智，陳 杰

（1.宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司，四川宜賓 644000；2.勁牌有限公司，湖北黃石 435000）

真菌（Fungus）是真核生物中的一大類群，它與動、植物和其他真核生物并列，自成一界。目前白酒生產(chǎn)中的微生物研究較多的是細菌、酵母、霉菌，其中霉菌和酵母都屬于真菌。霉菌亦稱絲狀真菌，凡生長在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的真菌，統(tǒng)稱為霉菌。霉菌分為曲霉屬（Aspergillus）、根霉屬（Rhizopus）、毛霉屬（Mucor）、青霉屬（Paecilomyces）、紅曲霉屬（Monascus）、犁頭霉屬（Absidia）、木霉屬(Trichoderma)等，它是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上不可或缺的一類微生物。近年來霉菌在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化學、食品等工業(yè)中都已廣泛應(yīng)用。酵母菌是一類單細胞微生物，早在殷商時代，酵母菌就成為釀酒必不可少的微生物。釀造中最常見的酵母菌有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、假絲酵母（Candida）、畢赤酵母（Pichia）等。其中釀酒酵母應(yīng)用最為廣泛，假絲酵母次之。各類酵母在白酒、葡萄酒、啤酒、清酒及飲料中都有應(yīng)用。隨著時代的發(fā)展，真菌的潛力在不斷地被發(fā)掘，真菌的應(yīng)用也慢慢地變成了人們研究的熱點[1]。

1 真菌在大曲酒制曲生產(chǎn)中的應(yīng)用

1.1 真菌在清香大曲制曲生產(chǎn)中的應(yīng)用

清香大曲是以傳統(tǒng)汾酒為典型代表，發(fā)酵過程中頂點溫度在50 ℃以下的低溫大曲，它包括清茬曲、后火曲和紅心曲。清香大曲中的微生物主要來源于自然界中，如空氣、原料、輔料等。

1.1.1 霉菌

曲房空氣中的微生物主要為橫梗霉、根霉、毛霉、曲霉等。曲坯的“上霉”有利于保持曲坯的水分，霉菌對清香大曲發(fā)酵過程中“上色”也起著關(guān)鍵性作用。隨著溫度變化，因橫梗霉、根霉和黃曲霉數(shù)目不同可形成晾紅心、火紅心、金黃一道線、二道眉、單耳、雙耳等現(xiàn)象。

隨著科學的不斷進步，功能菌強化大曲漸漸進入了人們的視野，將功能菌篩選分離，可得到純化的優(yōu)良菌株，并且在制曲過程中發(fā)揮著不可忽視的作用。程偉等[2]研究的金種子菌株Mxzd-001 分離篩選出的黑曲霉菌株具有耐酸、耐酒精能力，并且能夠產(chǎn)生醇、酯、醛類等風味物質(zhì)和液化酶、糖化酶等各種酶類。功能菌強化大曲可使大曲的質(zhì)量進一步提升，在后期釀酒過程中得到更多、品質(zhì)更好的原酒。馬美榮等[3]研究表明，將紅曲霉添加到糖化發(fā)酵劑，或?qū)⒓t曲霉應(yīng)用到強化制曲中，可提高出酒率大約2%。

1.1.2 酵母

清香大曲中的酵母是由制曲原料帶來的，而研究表明[4]，清香型大曲中酵母菌的優(yōu)勢菌為扣囊復膜孢酵母和釀酒酵母。其中扣囊復膜孢酵母是一類能產(chǎn)生子囊孢子的二形態(tài)酵母[5]，是少有的能產(chǎn)生淀粉酶、酸性蛋白酶等水解酶的酵母菌[6]。扣囊復膜酵母在黃酒和米酒及清香型白酒和丟糟方面研究較多，其他酒類較少?？勰覐湍そ湍概c釀酒酵母的協(xié)調(diào)作用還可以提高纖維素的利用率，提升出酒率[7]。在酵母菌中，全國各大酒廠都采用生香酵母來提升白酒的品質(zhì)。生香酵母主要作用是增酯和產(chǎn)香，可以用于任何香型白酒生產(chǎn)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)篩選分離出優(yōu)良的菌種可利于大曲質(zhì)量的提升。其中汾酒廠分離出的汾酒Ⅰ號和Ⅱ號，將其應(yīng)用于大曲生產(chǎn)，能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益[8]。

1.2 真菌在濃香大曲制曲生產(chǎn)中的應(yīng)用

濃香大曲呈磚狀，曲塊比小曲大，一般采用小麥、豌豆等為原料，經(jīng)粉碎加水拌和后壓制成磚塊狀，再經(jīng)人工控制溫度和濕度自然接種發(fā)酵而成。濃香大曲發(fā)酵過程中頂溫一般在55～60 ℃，因此又被稱為中溫大曲。

1.2.1 霉菌

濃香大曲中的微生物基本都是從自然界中網(wǎng)羅所得，在發(fā)酵前期，環(huán)境及曲藥溫度較低，適宜霉菌、酵母的生長繁殖。大曲發(fā)酵過程中，“菌絲起引水作用，孢子起著色作用”。菌絲是由外向內(nèi)生長的，當菌絲長入大曲坯體時，能夠促進曲坯內(nèi)部水分的揮發(fā)，因此有“菌絲內(nèi)插，水分揮發(fā)”的培養(yǎng)原理。其次，霉菌還有助于大曲的“穿衣”。研究發(fā)現(xiàn)，通過使用0.1‰的大曲生衣復合菌，可以使大曲的穿衣率由原來的20 %～50 %提高至90 %以上，并且還能夠提升大曲的質(zhì)量[9]。另外，采用微生物技術(shù)篩選分離出功能菌在濃香大曲中也發(fā)揮著出色的作用。姚萬春等[10]在優(yōu)質(zhì)大曲中，通過篩選分離得到9 株優(yōu)良菌種，將其制成的大曲，結(jié)果表明，無論感官還是理化指標均明顯地優(yōu)于傳統(tǒng)大曲，并且能夠有效地提高出酒率。在制曲過程添加純化后的紅曲霉、產(chǎn)酯酵母等功能性微生物即可得到強化大曲。強化曲可添加一種或多種微生物功能菌，人工接種與自然接種相結(jié)合，增加大曲中功能菌種類及數(shù)量。用紅曲霉制成強化大曲來提高酯的合成，可以使酯含量在較短的發(fā)酵時間內(nèi)大量提升。

1.2.2 酵母

濃香型大曲中的酵母主要有扣囊復膜酵母、畢赤酵母、卡利比克邁氏酵母、釀酒酵母等，不同地區(qū)不同酒企的酵母種類及數(shù)量也存在差異。酵母菌品種的優(yōu)劣很大程度上決定了大曲發(fā)酵力的高低。同時發(fā)酵力對溫度的敏感程度也極高，低溫曲發(fā)酵力高，高溫曲發(fā)酵力低，因此篩選出能在高溫環(huán)境中有著高發(fā)酵力的酵母也極其關(guān)鍵。湯有宏[11]在古井貢的高溫大曲中分離出1 株能耐高溫酵母菌株，將其制成大曲，在高溫下仍具有較高的發(fā)酵力，將其分離純化作為功能菌添加到大曲中，就可以人為地控制發(fā)酵過程中發(fā)酵力的高低。另外通過功能菌培養(yǎng)，還可以得到有利于生產(chǎn)的優(yōu)良菌株，如蒲春等[12]從洋河大曲中分離得到8 株產(chǎn)酯酵母，其中酶活最高的菌株鑒定為異常畢赤酵母，利用該酵母制備的麩曲酯化力高達19.36 mg/100 mL。胡沂淮等[13]從洋河大曲中篩選出1株能產(chǎn)香的異常畢赤酵母，其發(fā)酵培養(yǎng)物具有濃郁的復合香氣，風味物質(zhì)的組分多達27種。

1.3 真菌在醬香大曲制曲生產(chǎn)中的應(yīng)用

醬香型白酒所用的大曲為高溫大曲，即通過潤麥、粉碎、加母曲拌和、壓制、堆積發(fā)酵、入庫儲存等一系列過程制成的最高溫可達60～65 ℃的大曲。醬香型白酒擁有自身獨特的風味與高溫大曲在制曲過程中微生物發(fā)酵及美拉德反應(yīng)有著密切的聯(lián)系[14]。

1.3.1 霉菌

高溫大曲在發(fā)酵過程中頂溫極高，而霉菌在低溫期可大量繁殖，隨著發(fā)酵時間的延長，頂溫上升后，部分霉菌仍能夠耐受高溫。霉菌能產(chǎn)生液化酶、糖化酶、蛋白酶等多種酶類，WANG 等[15]從茅臺大曲中分離出的微生物群落顯示高溫大曲中擁有眾多霉菌，其中最多的是黑曲霉。黑曲霉能夠產(chǎn)生大量的淀粉酶和酸性蛋白酶，在高溫環(huán)境下仍具有酶活性[16]。班世棟[17]在貴州某酒企對黃曲、白曲以及黑曲3 種大曲的霉菌進行分離鑒定也發(fā)現(xiàn)部分曲霉和犁頭霉及青霉能夠同時產(chǎn)生多種酶活，且活性都較高。

1.3.2 酵母

醬香型大曲頂溫較高，很大程度地限制了酵母菌的生長，因此酵母主要的生長繁殖集中在前期的低溫培養(yǎng)期，溫度較高時，酵母數(shù)量急劇減少，后期溫度降下來后又會有所上升。雖然醬香大曲中酵母數(shù)量并不多，但是并不影響其高度多樣性?？拙S兵等[18]在醬香大曲中分離出了伊薩酵母屬、德巴利酵母屬等多種酵母菌，表明醬香大曲中酵母具有高度多樣性，對醬香大曲酵母菌的研究也開辟了道路。

2 真菌在大曲酒制酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 真菌在清香型大曲酒制酒中的應(yīng)用

清香型白酒是我國白酒四大香型之一，它是以糧谷為原料，經(jīng)傳統(tǒng)固態(tài)法發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成的白酒。它具有“入口綿，落口甜，清香不沖鼻，飲后有余香”的固有風格，因此以清香著稱[19]。

2.1.1 霉菌

霉菌能產(chǎn)出活性較強的糖化酶，在清香型大曲制酒中的糖化培菌過程起著至關(guān)重要的作用。將霉菌制成強化大曲，能夠進一步地提升糖化效果，對酒質(zhì)、出酒率也有明顯地提升。牛欄山[20]將從大曲和酒醅中分離出來的米根霉制成米根霉麩曲與大曲結(jié)合后，提高了清香大曲的酒質(zhì)和出酒率。

根霉具有更高的糖化力，更強的適應(yīng)力及更快的繁殖速度，近幾年從黑曲霉中選育出來的宇左美曲霉、滬輕Ⅱ號、UV-11 等都是優(yōu)良的糖化菌，具有較強的糖化酶活力。

2.1.2 酵母

傳統(tǒng)的白酒企業(yè)憑借自身多年積累的釀酒酵母、假絲酵母等酵母發(fā)酵，其成品酒的質(zhì)量都較高，但是卻存在出酒率低的問題。在增加清香型大曲酒出酒率的研究方面，董家武[21]采用THADY 與糖化酶進行減曲4%和周劍平等[22]采用固定化復合酵母增殖細胞，都能夠在不影響原酒風味的前提下，使出酒率提高3%。隨著科學的進步，只有通過現(xiàn)代化的生物技術(shù)得到高產(chǎn)酯的釀酒酵母才能夠從根本上解決釀酒酵母產(chǎn)酯能力的問題。馬紅霞等[23]的研究表明，添加高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母重組菌株MY15 能夠有效地提升乙酸乙酯含量，但是同時也會增加高級醇含量。

研究發(fā)現(xiàn)，加入生香ADY，能夠在使乳酸乙酯不變的情況下大幅度提升乙酸乙酯的含量，使酒香更協(xié)調(diào)，口感更佳，增加了優(yōu)質(zhì)酒率。而添加THAADY 能夠增加酵母菌數(shù)量，使原料中淀粉分解更加徹底，提高原料利用率，在提高出酒率的同時還能節(jié)約原料，增加經(jīng)濟效益[24-27]。

2.2 真菌在濃香型白酒制酒中的應(yīng)用

濃香型白酒又稱瀘型白酒，它以醇香濃郁，甘洌清爽，飲后尤香，回味悠長優(yōu)美風韻而蜚聲中外，飲者甚眾[19]。

2.2.1 霉菌

濃香型白酒的主體香味物質(zhì)是己酸乙酯，而酒質(zhì)的優(yōu)劣主要是由己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯等物質(zhì)含量多少及其比例關(guān)系來決定的。為了提高白酒的質(zhì)量，人們對大曲酯化力的研究從20 世紀80 年代后期就開始了[28-29]。許多白酒企業(yè)分離出了能夠產(chǎn)酯的細菌、酵母和霉菌。其中紅曲霉可提高己酸乙酯的含量，研究發(fā)現(xiàn)，通過80 d的酯化，己酸乙酯的含量可達7230 mg/100 mL[30]。另外紅曲霉加入窖池中，和己酸菌、產(chǎn)香酵母發(fā)酵，對比不添加紅曲霉的窖池，酯的含量及酒的風味都有明顯提升[3]。用酯化酶技術(shù)與黃水結(jié)合做成酯化液，用來直接勾兌白酒能夠提升酒的優(yōu)質(zhì)率[31]。紅曲霉與根霉一同添加可解決一些傳統(tǒng)濃香工藝生產(chǎn)中存在的問題。信春暉[32]的研究表明，在多糧發(fā)酵工藝生產(chǎn)中的秋季轉(zhuǎn)排困難時補加紅曲霉及根霉能夠使發(fā)酵正常并提高出酒率，使酒體更豐滿。另外，紅曲霉還具有一定的糖化力，可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸等有機酸，提高白酒風味。

2.2.2 酵母

濃香型白酒中酵母菌主要有釀酒酵母和假絲酵母等。濃香型白酒提高香味物質(zhì)的現(xiàn)代微生物技術(shù)主要有：強化大曲技術(shù)、人工老窖技術(shù)、香醅制備技術(shù)和酯化酶技術(shù)[33]。各大酒企紛紛對各自的微生物進行篩選，分離出能夠耐高溫、高酸及高產(chǎn)量的功能菌。王琛[34]、曾娟[35]、葛隱[36]、湯有宏[11]、王濤等[37-38]均從各大酒廠的糟醅、黃水、窖泥等含菌材料中，通過不同乙醇濃度和pH 條件下定向富集和耐受性篩選的方法得到了能夠耐高溫、耐高酸的優(yōu)良酵母菌株。此外，生香ADY、TH-AADY 在濃香白酒生產(chǎn)中能夠有效地“增己降乳”，且出酒率和名優(yōu)酒率都比較高[39-40]。

人工老窖技術(shù)、香醅制備技術(shù)以及酯化酶技術(shù)主要發(fā)揮作用的是己酸菌等細菌，真菌在此涉獵較少，不過在此技術(shù)上添加酵母，仍有不小的作用。羅惠波等[41]在酯化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上加入耐高溫ADY，在提高總酯含量的同時，己酸乙酯上升了9倍。

另外，產(chǎn)酯酵母有助于白酒風味的提升，方心芳教授的研究發(fā)現(xiàn)：在己酸發(fā)酵液中添加乙醇和產(chǎn)酯酵母，能產(chǎn)生大量的己酸乙酯，提高原酒的名優(yōu)酒率。施安輝等[42]在山東蘭陵美酒廠串香的香醅中添加產(chǎn)酯酵母，使理化指標提升明顯，感官上也更加香濃，純正，雜味較少。

2.3 真菌在醬香型白酒制酒中的應(yīng)用

醬香型白酒又稱為茅香型白酒，其質(zhì)量風格以微黃透明、醬香突出、優(yōu)雅細膩、酒體醇厚、空杯留香持久而著稱，有低而不淡、香而不艷之口感[19]。

2.3.1 霉菌

目前從醬香型大曲中分離得到的霉菌主要有毛霉、根霉、犁頭霉、曲霉、青霉、紅曲霉等，充分體現(xiàn)了醬香酒釀造中霉菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性[43]。在霉菌中，根霉和紅曲霉能夠產(chǎn)較高的α-淀粉酶與酸性蛋白酶，這兩種酶能在釀酒的高溫及酸性環(huán)境下發(fā)揮作用，還能產(chǎn)生活性較高的糖化酶[44-45]。周靖[46]從醬香型大曲中分離出1 株紅曲霉，其具有較高的酯化酶活，能夠促進白酒生產(chǎn)中的酯類物質(zhì)的生產(chǎn)。另外霉菌的協(xié)同作用對白酒的風味物質(zhì)還有一定的影響，霉菌在醬香型白酒發(fā)酵過程中能生成醇、醛、酮、酯等呈香物質(zhì)，這些物質(zhì)是形成醬香酒獨特風味物質(zhì)的前體物質(zhì)。鄧皖玉等[47]從高溫大曲中分離得到幾株霉菌，通過一系列檢測，確定該菌株可產(chǎn)具有硫香的醬味。霉菌與微生物之間的相互作用對醬香白酒發(fā)酵也有不可忽視的影響。許士池等[48]將霉菌與白曲霉按適當比例混合，對其進行混合釀酒實驗，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵對總酸、總酯的含量有著重要影響。其實霉菌具有極大的潛力，但目前人們對霉菌的研究基本還停留在多樣性上，其在釀酒中的功能性認識還較少，多數(shù)霉菌都被認為無作用或作用較小甚至被認為是有害的，因此區(qū)分霉菌在釀造過程中的利弊，根據(jù)好壞來研究釀酒中霉菌應(yīng)是今后的切入點。

2.3.2 酵母

醬香型白酒酵母菌主要有扣囊復膜酵母、異常畢赤酵母、東方伊薩酵母、畢赤酵母等，他們分布于堆積糟、酒醅等各個工序。每個酒企有著自己獨特的酵母種群，在發(fā)酵過程中最終得到的原酒也有自身獨特的風格。

隨著人們對功能菌研究的不斷深入，發(fā)掘出自身酒企中耐高溫、高酸、高產(chǎn)酒精的酵母菌已刻不容緩。李紅[49]、馬榮山[50]、徐超英[51]、任道群[52]、莊名揚等[53]分別在貴州茅臺集團、四川郎酒等醬香型白酒企業(yè)的堆積糟、酒醅中篩選分離出能夠耐高溫、強耐酒精，高產(chǎn)乙醇，酶活力高、發(fā)酵力強的理想酵母菌。分離篩選后，采用優(yōu)良菌種培養(yǎng)出來的酒曲在生產(chǎn)中能夠很大程度地改善原酒酒質(zhì)和出酒率。

醬香型白酒中由于制曲時溫度較高，導致大部分酵母菌死亡，而在堆積過程，能夠從外界再次網(wǎng)羅酵母菌，使酵母數(shù)量大幅度增加。微生物具有糖化和生香作用，但是醬香大曲中生香是主要的，在發(fā)酵過程中細菌與酵母等微生物共同作用下才產(chǎn)生了獨特的醬香風味[54]。通過研究發(fā)現(xiàn)，將功能酵母混合加入窖池，能夠提高白酒中酯類物質(zhì)的含量，增加醬香白酒的風味，且不影響出酒率[55]。

2.4 真菌在丟糟中的應(yīng)用

白酒的生產(chǎn)雖然會將蒸餾完的糟醅重新投放到窖池中，一方面是糟醅能夠起到疏松的作用，使酒醅能夠更好地發(fā)酵；另一方面是糟醅中殘余淀粉較多，重新進入發(fā)酵可有效地利用這些殘余淀粉，因此有著“千年窖泥萬年糟”的說法。但是一輪一輪的蒸酒，還是不可避免地要丟棄一部分糟醅，即丟糟。丟糟中的殘余淀粉含量仍然較高，在堆放過程中由于水分較大，因此極不易儲存[56]，大量的中小型白酒企業(yè)的丟糟是直接轉(zhuǎn)賣用作飼料，但是其蛋白質(zhì)含量較低，牲畜適口性不佳，價格也極其便宜，因此如何將丟糟資源化是人們亟需解決的問題。

在丟糟回收利用的問題上，真菌在此應(yīng)用上也有一席之位。扣囊復膜酵母酵母具有較高的產(chǎn)淀粉酶能力，對丟糟的利用有幫助，能夠節(jié)約原料。莊名揚等[57]將丟糟集中至專門的窖池中，通過添加耐溫耐酸的酵母菌，使出酒率顯著提升，且酒體風味純正，無異雜味。

霉菌中的木霉含有多種酶系，尤其是纖維素酶，是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌種，它能夠利用農(nóng)副產(chǎn)品，如麥稈、木材、木屑等纖維素原料使之轉(zhuǎn)變?yōu)樘琴|(zhì)原料。在白酒生產(chǎn)的丟糟中，仍含有較多的淀粉和纖維素，通過加入木霉纖維素酶將丟糟再次發(fā)酵，可進一步提取酒精。研究發(fā)現(xiàn)所有復合菌均可使丟糟酸度及纖維素含量下降，同時能有效增加丟糟蛋白質(zhì)含量[58]。另外木霉生產(chǎn)的纖維素酶加入糖化酶和TH-AADY，可使丟糟出酒率達3.5 %[59]，木霉中的纖維素酶合理地利用也可具有顯著的經(jīng)濟和環(huán)境效益[60]。

3 真菌的純種培養(yǎng)工藝流程

在釀酒中應(yīng)用的真菌主要是霉菌跟酵母菌，通過系統(tǒng)的篩選分離鑒定，可得到純種的優(yōu)良菌株。霉菌跟酵母的培養(yǎng)過程存在差異，一般霉菌可全程采用固體培養(yǎng)，而酵母則需在擴大培養(yǎng)過程中采用液態(tài)培養(yǎng)，最終大規(guī)模生產(chǎn)時兩者基本差不多，都可接種后采用通風制曲進行生產(chǎn)。

3.1 原料

純種培養(yǎng)采用的原料一般為麩皮，主要是因為麩皮的松散性和其擁有足夠菌種生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)，如淀粉、蛋白質(zhì)以及各種微量無機鹽，另外在霉菌和酵母培養(yǎng)方面，可適當?shù)奶砑佑衩?、早秈米，使微生物能夠更好地生長繁殖。

3.2 初級培養(yǎng)

3.2.1 試管培養(yǎng)

菌種的純種培養(yǎng)首先就是試管培養(yǎng)，試管培養(yǎng)過程必須保證菌種不受污染，保證試管培養(yǎng)的質(zhì)量，才能讓后面的擴大培養(yǎng)不受影響，否則將嚴重影響酒質(zhì)、出酒率。試管培養(yǎng)的基本步驟是將制備好的培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌處理，一般為121 ℃，30 min。滅菌結(jié)束后傾斜放置，冷卻后即可接種，然后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，最后進行檢測鑒定，確認質(zhì)量合格后即可置于4～8℃冰箱中進行保藏（不宜超過3 個月），準備三角瓶擴大培養(yǎng)。

3.2.2 三角瓶培養(yǎng)

霉菌流程：麩皮、水潤料→裝瓶→滅菌→冷卻→試管菌種的接種→恒溫培養(yǎng)→扣瓶→出瓶→干燥→粉碎保藏。

稱取麩皮倒入容器中，加水70%～80%，充分拌勻。用大口徑漏斗將其裝入滅菌干燥冷卻后的500 mL 三角瓶中，每瓶裝料40～50 g，密封包扎后滅菌30 min[12]。滅菌結(jié)束后趁熱將麩皮搖散，冷卻至30～35 ℃后在無菌環(huán)境中進行接種，接種完充分搖勻。再將其置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌絲密布、麩皮結(jié)塊時進行扣瓶，即將瓶子輕輕倒扣，以增加底部菌種與空氣的接觸面積，促進菌種生長繁殖，繼續(xù)培養(yǎng)1 d。再將三角瓶置于35～40 ℃培養(yǎng)箱中進行干燥，使菌種停止生長，利于保存。最后在無菌環(huán)境中將麩皮研磨粉碎，裝入無菌干燥的紙袋于無菌干燥器中保存。

酵母流程：溶液糖度為11～12°Bx 培養(yǎng)液→裝瓶→滅菌→冷卻→試管菌種的接種→恒溫培養(yǎng)→保藏

取適量麥芽浸粉，加水溶解，控制溶液糖度至11～12 °Bx，分裝入500 mL 三角瓶中，每瓶加入250 mL。密封后滅菌30 min，待冷卻后接種試管菌種，置于30℃恒溫搖床中，140 r/min，培養(yǎng)20～36 h。準備進一步的擴大培養(yǎng)。

3.3 真菌擴大培養(yǎng)

3.3.1 霉菌的淺盤曲種的培養(yǎng)

流程：麩皮、水潤料→滅菌→冷卻→三角瓶種子接種→裝盤→培養(yǎng)→烘干→淺盤種曲

淺盤曲種培養(yǎng)的物料配比與三角瓶培養(yǎng)相同，麩皮加水充分拌勻后即可滅菌，無菌室中冷卻至30 ℃左右接入三角瓶菌種0.3 %，拌勻后進行裝盤，放入保溫室中28～30 ℃培養(yǎng)。18 h 左右后品溫達到35～37 ℃，將曲盤擺成“X”或“品”字狀使品溫稍下降。24 h 后菌絲飽滿，麩皮結(jié)塊，即可扣盤，繼續(xù)培養(yǎng)至品溫30 ℃左右時進行無菌烘干處理。溫度設(shè)施為35～40 ℃，待將水分漸漸減少后，再將溫度升至40～45 ℃。最后無菌條件下將麩皮粉碎保藏。

3.3.2 酵母的種子罐培養(yǎng)

流程：營養(yǎng)液配制→入種子罐→滅菌→冷卻→三角瓶接種→培養(yǎng)→放罐→進一步擴大培養(yǎng)

營養(yǎng)液的培養(yǎng)基與之前的配料相同，不過在加入種子罐之前需要添加消泡劑，防止培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量的泡沫，影響生產(chǎn)。入種子罐后按照滅菌流程設(shè)定滅菌溫度為121 ℃，保壓30 min 滅菌。待冷卻至30 ℃后可進行三角瓶接種，接種結(jié)束后設(shè)置種子罐培養(yǎng)溫度為30 ℃，并設(shè)置低轉(zhuǎn)速，pH 值控制在4.5～6.0，待酵母生長趨于停止時可結(jié)束培養(yǎng)，進入下一階段。

3.4 菌種的生產(chǎn)

一般酒企采用通風制曲進行大規(guī)模的菌種生產(chǎn)，它有著節(jié)省勞動力和廠房面積的優(yōu)點。霉菌與酵母在此階段除接種方式不同之外，其他操作基本相同。

工藝流程：麩皮、水→拌料→蒸料→揚冷→淺盤接種→入池→通風培養(yǎng)→烘干→保藏

將粉碎后的麩皮與水按之前的配比拌勻后在蒸鍋中蒸料，蒸鍋設(shè)定滅菌壓力為1.2～1.3 Bar，時間為1.3～2.0 h。蒸料結(jié)束后將物料倒出進行揚冷或攤晾，待冷卻至35 ℃左右時可加入淺盤曲種進行接種，接種量為0.3%～0.5%。充分拌勻后迅速裝入通風培養(yǎng)池內(nèi)，厚度25～30 cm，靜置培養(yǎng)至品溫為36 ℃左右時可進行間斷性的通風降溫。待培養(yǎng)約15 h 后，霉菌由于呼吸作用會導致品溫急劇上升，此時應(yīng)持續(xù)通風，使品溫保持在35 ℃左右。24 h 左右菌絲密布時，養(yǎng)分已大量消耗，此后菌絲生長緩慢，此時可進行干燥，操作原理同淺盤制曲。待干燥結(jié)束后即可入庫保藏。

4 總結(jié)與展望

真菌在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用方面，主要包括優(yōu)良菌種的篩選分離、制作功能強化曲、酯化液與生香酵母混合、制作粗酶制劑等。對在高溫、高酸等惡劣環(huán)境下仍能產(chǎn)生較高的活化酶的優(yōu)良菌種進行篩選分離、純化培養(yǎng)等手段制成功能曲，將功能曲添加至白酒生產(chǎn)中，提高白酒中酯類的含量，使酯類物質(zhì)比例適當，增加風味物質(zhì)或風味前體物質(zhì)來增加名優(yōu)白酒的產(chǎn)量。由于白酒行業(yè)對傳統(tǒng)工藝要求較高，對微生物的新技術(shù)領(lǐng)域探索仍有許多不足之處。例如現(xiàn)在篩選優(yōu)良菌種操作繁瑣、難度較大，多個地區(qū)也僅能篩選出屈指可數(shù)的優(yōu)良菌株，且一些菌株區(qū)域性強，效果不明顯、不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響等。隨著科學的不斷進步，基因工程、DNA提取技術(shù)等快速發(fā)展，人們對真菌研究也將不斷深入，真菌的一系列的潛力將被人們挖掘出來，白酒的質(zhì)量和產(chǎn)量也將有著質(zhì)的飛躍。