納米銀顆粒及納米二氧化鈦顆粒的體外遺傳毒性研究

朱海美，黃鵬程，趙田田，周長慧,，李若婉，于春榮,，陳志勇，顧林峰，常艷,,

納米銀顆粒及納米二氧化鈦顆粒的體外遺傳毒性研究

朱海美1，黃鵬程2，趙田田3，周長慧2,3，李若婉3，于春榮2,3，陳志勇2，顧林峰2，常艷1,2,3

1. 上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620 2. 上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203 3. 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201201

納米物質(zhì)以其獨(dú)特的物理性質(zhì)廣泛用于化妝品、醫(yī)藥和食品工業(yè)，但它們的安全性和遺傳毒性仍然存在爭(zhēng)議。本研究擬采用基于人成淋巴TK6細(xì)胞的體外彗星實(shí)驗(yàn)整合體外基因突變實(shí)驗(yàn)對(duì)納米銀顆粒(AgNPs)和納米二氧化鈦顆粒(TiO2NPs)的致DNA斷裂作用和致突變性進(jìn)行初步研究。本研究探究了最高至200 μmol/L濃度時(shí)，TK6細(xì)胞暴露于兩種納米物質(zhì)4 h時(shí)的彗星實(shí)驗(yàn)和經(jīng)過暴露24 h以及10 d基因突變表達(dá)期后的基因突變結(jié)果。同時(shí)，本研究還檢測(cè)了TK6細(xì)胞暴露于納米顆粒4 h及24 h對(duì)納米物質(zhì)的攝取能力。在納米物質(zhì)攝取實(shí)驗(yàn)中，隨著納米物質(zhì)濃度的升高，TK6細(xì)胞在流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖中的側(cè)向散射角(side scatter, SSC)呈現(xiàn)濃度與時(shí)間依賴性升高，表明TK6細(xì)胞可攝取兩種納米顆粒。在4 h彗星實(shí)驗(yàn)中，AgNPs可導(dǎo)致彗星尾DNA熒光%強(qiáng)度呈現(xiàn)濃度依賴性顯著升高，為陽性結(jié)果。而TiO2NPs則不能誘導(dǎo)彗星尾DNA熒光%強(qiáng)度呈現(xiàn)濃度依賴性顯著升高，但最高濃度組尾DNA熒光%超過本實(shí)驗(yàn)室陰性歷史對(duì)照數(shù)據(jù)，為可疑結(jié)果。而在體外基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，AgNPs和TiO2NPs均不能誘導(dǎo)TK6細(xì)胞的基因突變率出現(xiàn)陽性升高。AgNPs可導(dǎo)致TK6細(xì)胞出現(xiàn)DNA損傷，但不能誘導(dǎo)基因突變率升高。TiO2NPs既不能誘導(dǎo)TK6細(xì)胞出現(xiàn)DNA損傷，也不能誘導(dǎo)基因突變率升高，TiO2NPs的遺傳毒性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

納米銀顆粒；納米二氧化鈦顆粒；彗星實(shí)驗(yàn)；基因突變實(shí)驗(yàn)；遺傳毒性

納米物質(zhì)獨(dú)特的粒子直徑可使得納米物質(zhì)的物理性質(zhì)，包括表面效應(yīng)、光效應(yīng)、體積效應(yīng)等發(fā)生改變。納米物質(zhì)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和材料等科學(xué)領(lǐng)域。納米粒子(nanoparticle, NP)的國際標(biāo)準(zhǔn)定義為尺寸在納米級(jí)別(粒徑范圍1~100 nm)，長軸和短軸無顯著差異的微小粒子。近幾十年來，納米銀粒子(AgNPs)因其與實(shí)體納米粒子不同的特性而被認(rèn)為是一種極具前景的材料。其主要特點(diǎn)是高表面積體積比，這使得這種納米結(jié)構(gòu)在生物、電子、醫(yī)藥、環(huán)境修復(fù)、生物傳感器、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]。AgNPs在電氣、醫(yī)療保健、食品和紡織產(chǎn)品方面的全球消費(fèi)量以及AgNPs供應(yīng)商數(shù)量激增[2]。納米二氧化鈦顆粒(TiO2NPs)也被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、表面涂層材料、食品、飼料、殺菌劑和獸藥等。研究報(bào)道TiO2NPs可在腎、肝、肺、脾、腦和生殖器官中積累[3]。由于納米物質(zhì)的廣泛應(yīng)用，使其遺傳毒性研究越來越受重視。目前對(duì)納米物質(zhì)的遺傳毒性研究常采用化合物遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合實(shí)驗(yàn)，如Ames實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)/外微核、染色體畸變實(shí)驗(yàn)等[4]。但在Ames實(shí)驗(yàn)中因納米物質(zhì)不易穿透細(xì)菌細(xì)胞壁，Ames實(shí)驗(yàn)可能不適用于納米物質(zhì)遺傳毒性的檢測(cè)；體外雙核微核試驗(yàn)中添加的細(xì)胞松弛素B，可能影響細(xì)胞對(duì)納米物質(zhì)的胞吞作用。因此，需開發(fā)或改進(jìn)體外遺傳毒性評(píng)價(jià)系統(tǒng)[5]。

Singh等[6]最早創(chuàng)建了最原始的堿性彗星試驗(yàn)，稱為單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)。1990年Olive等[7]以彗星形狀來形容DNA在凝膠中的形狀因此將此試驗(yàn)方法命名為彗星試驗(yàn)，他們也介紹了評(píng)價(jià)DNA遷移的指標(biāo)DNA的尾密度。尾DNA密度指標(biāo)的應(yīng)用進(jìn)一步發(fā)展了彗星細(xì)胞的檢測(cè)方法，即用軟件檢測(cè)彗星細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度現(xiàn)已成為彗星試驗(yàn)中評(píng)價(jià)DNA損傷的主要指標(biāo)[8]。目前彗星實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成為應(yīng)用最廣泛的評(píng)價(jià)DNA在細(xì)胞及組織內(nèi)損傷和修復(fù)的方法。

過去10年中，用于評(píng)估內(nèi)源性磷脂酰肌醇聚糖A類基因(基因)突變方法的開發(fā)、驗(yàn)證和應(yīng)用已取得較為快速的發(fā)展。研究人員已經(jīng)探索了少數(shù)幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞株用于體外基因突變?cè)囼?yàn)的可能性。Kruger等[9]率先使用了人成淋巴母細(xì)胞系TK6細(xì)胞，建立了通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TK6細(xì)胞中GPI(?)頻率(基因突變率)的方法。Rees等[10]對(duì)比了TK6細(xì)胞和MCL-5細(xì)胞應(yīng)用于基因突變?cè)囼?yàn)的利弊，同時(shí)對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化。

本研究主要通過本實(shí)驗(yàn)室前期建立的體外彗星試驗(yàn)和體外基因突變?cè)囼?yàn)方法對(duì)兩種常用納米物質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以初步預(yù)測(cè)納米銀顆粒(AgNPs)和納米二氧化鈦顆粒(TiO2NPs)的體外遺傳毒性。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

人成淋巴TK6細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection, ATCC)；AgNPs和TiO2NPs均購自南京先豐納米物質(zhì)科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、熱滅活馬血清、磷酸緩沖液溶液(PBS)和L-谷氨酰胺購自美國Gibco公司；牛白蛋白(BSA)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；APC鼠抗人CD19抗體、PE鼠抗人CD55抗體、PE鼠抗人CD59抗體和核酸染料7-氨基放線菌素D (7-Ami-noactinomycin D, 7-AAD)均購自美國BD Bioscience公司；氫氧化鈉、二甲亞砜、濃鹽酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SYBR Gold 染液購自Invitrogen (貨號(hào)：S11494)；流式細(xì)胞儀為BD公司Accuri? C6 PLUS；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自丹麥Chemo-metec公司(型號(hào)NucleoCounter?NC-100)，彗星試劑盒及電泳儀購自美國Trevigen 公司；Comet Assay IV彗星分析軟件為Perceptive Instruments (英國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室建立的已清除突變陽性的TK6細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%馬血清和4 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的加濕條件下懸浮培養(yǎng)。每周傳代2~3次，保證細(xì)胞密度在1~10×105/mL之間。準(zhǔn)備足夠量的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞供試驗(yàn)使用。

1.3 受試物配制

納米物質(zhì)AgNPs和TiO2NPs均為不溶性納米物質(zhì)，其在H2O或DMSO等溶劑中均不可溶解。因此，本研究中在進(jìn)行納米物質(zhì)受試物配制時(shí)，均使用滅菌注射用水(本研究陰性對(duì)照)配制，超聲波振蕩15 min以上制成納米物質(zhì)混懸液。在進(jìn)行加樣時(shí)，使用移液器反復(fù)吹打，盡可能保證混懸液的均勻分散狀態(tài)，且加樣體積為10% (v/v)。納米物質(zhì)的表征及受試濃度見表1，納米銀與納米二氧化鈦的透射電鏡圖見圖1。

1.4 供試品加樣及彗星、納米物質(zhì)攝取和體外PIG-A基因突變實(shí)驗(yàn)方法

傳代至對(duì)數(shù)生長期的TK6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105/mL。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并加入不同濃度的受試物AgNPs或TiO2NPs溶液或陰性對(duì)照/陽性對(duì)照(彗星實(shí)驗(yàn)以50 μmol/L的過氧化氫(H2O2)處理TK6細(xì)胞10 min為陽性對(duì)照；體外基因突變實(shí)驗(yàn)以 200 μmol/L的甲磺酸乙酯(EMS)為陽性對(duì)照)，每個(gè)濃度重復(fù)3瓶。輕輕振蕩混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

表1 納米顆粒表征及受試濃度

以上信息由南京先豐納米物質(zhì)科技有限公司提供。?：未獲得相關(guān)信息。受試濃度參考文獻(xiàn)[11]選擇。

圖1 兩種納米物質(zhì)材料的透射電鏡圖

A：AgNPs；B：TiO2NPs。

4 h后融化低熔點(diǎn)瓊脂糖，37℃保存待用。每瓶吸取30 μL細(xì)胞懸液(將剩余細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng))與300 μL低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻后取30 μL涂布于彗星玻片孔中。2~8℃、避光冷卻10 min后浸入裂解液中裂解過夜(16 h)。第2 d，將玻片使用2~8℃預(yù)冷的去離子水清洗后浸入解旋液中解旋20 min，然后進(jìn)行堿性(pH>13)彗星電泳，電泳條件設(shè)置為電壓0.7 v/cm，電流300 mA。電泳20 min。電泳后的玻片經(jīng)中和、無水乙醇脫水、干燥和熒光染色后采用Comet assay IV彗星分析軟件分析各濃度彗星尾DNA% (標(biāo)準(zhǔn)步驟參考彗星試劑盒附帶說明書)。

用于體外基因突變實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，每瓶取100 μL細(xì)胞懸液，使用PBS稀釋10×后使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞群的SSC值和濃度關(guān)系。SSC值反應(yīng)細(xì)胞的內(nèi)部復(fù)雜程度，細(xì)胞攝取納米顆粒后的其內(nèi)部復(fù)雜程度增加，SSC值的增加可反映細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取量。

剩余細(xì)胞用于體外基因突變實(shí)驗(yàn)。首先采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，計(jì)數(shù)相對(duì)細(xì)胞增值數(shù)(RICC)。再每瓶取200萬細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌后調(diào)整細(xì)胞密度至0.8×105/mL，進(jìn)入基因基因突變表達(dá)期傳代。細(xì)胞分別在第4、6、8、10 d分別使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)處理組在表達(dá)期內(nèi)的RICC變化并且每次傳代調(diào)整細(xì)胞密度至0.8×105/mL(不足0.8×105/mL時(shí)，按照原密度接種)，第10 d調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL傳代。

RICC計(jì)算公式如下：

*：接種細(xì)胞密度為每次調(diào)整接種時(shí)的細(xì)胞密度。

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

各濃度組彗尾DNA%含量的中位數(shù)和基因突變率均以x?±s表示。彗尾DNA %含量的中位數(shù)均數(shù)相對(duì)于陰性對(duì)照組呈現(xiàn)顯著增加(具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，<0.05或<0.01)則判定為彗星實(shí)驗(yàn)陽性；體外基因突變實(shí)驗(yàn)中至少一個(gè)濃度的基因突變率與陰性對(duì)照相比有2倍以上增加且呈現(xiàn)濃度–效應(yīng)關(guān)系，判定為基因突變陽性。

1.6 彗星結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算每孔75個(gè)彗星細(xì)胞的彗尾DNA%含量的中位數(shù)，以各組織兩孔或多孔彗尾DNA%中位數(shù)的均值作為該組織彗尾DNA%含量的個(gè)體數(shù)據(jù)；計(jì)算各組肝臟彗尾DNA%個(gè)體數(shù)據(jù)的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

將受試物各劑量組的彗尾DNA%含量分別與陰性對(duì)照組的彗尾DNA%含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較，采用如下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：(1)用Levene's檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的方差齊性，當(dāng)方差齊(>0.05)，則進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)；當(dāng)方差不齊(≤0.05)，則Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較(0.05和0.01水平)。(2)當(dāng)方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(≤0.05)，則進(jìn)一步用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較(0.05和0.01水平)；當(dāng)方差分析結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)，則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。分析統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 21.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 h彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

彗星實(shí)驗(yàn)中各濃度計(jì)數(shù)150個(gè)細(xì)胞(每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，每孔計(jì)數(shù)75個(gè)細(xì)胞)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析其各濃度的尾DNA%中位數(shù)的均值。陽性對(duì)照組尾DNA%含量中位數(shù)的均值相對(duì)于陰性對(duì)照組顯著增加(<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)成立。

AgNPs各濃度組尾DNA%含量中位數(shù)的均數(shù)相對(duì)于陰性對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加(0.05或<0.01)，且呈現(xiàn)濃度依賴性增加，AgNPs的4 h體外彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為陽性(圖2A)。TiO2NPs各濃度組尾DNA%含量中位數(shù)均數(shù)相對(duì)于陰性對(duì)照組均無顯著性差異(>0.05)。TiO2NPs的4 h體外彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定為陰性(圖2B)。

2.2 4 h及24 h納米物質(zhì)攝取實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)中AgNPs處理后TK6細(xì)胞的SSC值呈現(xiàn)濃度相關(guān)性升高；相比于陰性對(duì)照組，SSC值分別升高1.02、1.05和1.29倍(4 h)及1.14、1.25和1.67倍(24 h) (圖3, A和C)。TK6細(xì)胞暴露于TiO2NPs后，在4 h及24 h檢測(cè)20、60和200 μmol/L的TiO2NPs處理后細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)SSC值同樣呈現(xiàn)濃度相關(guān)性升高；相對(duì)于陰性對(duì)照組，SSC值分別升高1.12、1.15、和1.23倍(4 h)及1.12、1.23和1.34倍(24 h) (圖3, B和D)。上述結(jié)果表明，TK6細(xì)胞能夠攝取兩種納米物質(zhì)AgNPs和TiO2NPs，且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間相關(guān)性升高。

2.3 體外PIG-A基因突變實(shí)驗(yàn)RICC結(jié)果

在體外基因突變實(shí)驗(yàn)中，受試物組RICC呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，最后逐漸恢復(fù)正常水平(圖4)。AgNPs和TiO2NPs高濃度在24 h (第2 d)均具有較高的細(xì)胞毒性，但是在受試物去除后其RICC能快速恢復(fù)，其RICC在第2 d達(dá)到最低，隨后逐漸回升至與陰性對(duì)照組同等水平。

2.4 體外PIG-A基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)流式細(xì)胞儀SSC結(jié)果表明TK6細(xì)胞在24 h時(shí)可攝取AgNPs或TiO2NPs，且隨著暴露濃度的提高，兩者的RICC均呈現(xiàn)劑量依賴性降低，表明納米顆粒暴露充分，且可被細(xì)胞攝取?；虮磉_(dá)期末(第10 d)，在最高至200 μmol/L時(shí)，AgNPs和TiO2NPs仍不能誘導(dǎo)TK6細(xì)胞的基因突變率呈現(xiàn)濃度相關(guān)性升高，體外基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

3 討論

本研究選擇兩種納米物質(zhì)TiO2NPs和AgNPs作為受試物，使用體外彗星實(shí)驗(yàn)聯(lián)合體外基因突變實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)其致DNA斷裂性和誘變性，初步探討兩種納米物質(zhì)的遺傳毒性。

流式細(xì)胞術(shù)中細(xì)胞的側(cè)向散射角(SSC)反映了細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)雜程度[12]。體外培養(yǎng)的細(xì)胞系為單一種類細(xì)胞群體，其SSC熒光強(qiáng)度不隨培養(yǎng)時(shí)間等變化。細(xì)胞接觸納米物質(zhì)后，細(xì)胞通過胞吞的方式將納米物質(zhì)攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并以囊泡的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞通過胞吞左右吞噬攝取納米顆粒后，細(xì)胞質(zhì)中大量的納米顆粒可增加細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜程度，進(jìn)而導(dǎo)致流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)SSC值的增大。因此通過細(xì)胞暴露于納米物質(zhì)后檢測(cè)細(xì)胞的SSC值可反應(yīng)細(xì)胞對(duì)納米物質(zhì)的攝取量，以反映納米物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的暴露水平[13]。研究結(jié)果提示TK6細(xì)胞在暴露24 h時(shí)其SSC值相對(duì)于陰性對(duì)照組顯著升高，表明本實(shí)驗(yàn)中TK6細(xì)胞暴露充分，可被TK6細(xì)胞攝取，且有濃度–效應(yīng)關(guān)系。

圖2 AgNPs和TiO2NPs 4 h彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A：AgNPs彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B：TiO2NPs 彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果。*：<0.05；***：<0.01 (與陰性對(duì)照組相比)。H2O2為陽性對(duì)照。

圖3 AgNPs和TiO2NPs細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A：4 h AgNPs SSC濃度-反應(yīng)關(guān)系；B：4 h TiO2NPs SSC濃度-反應(yīng)關(guān)系；C: 24 h AgNPs SSC濃度-反應(yīng)關(guān)系；D：24 h TiO2NPs SSC濃度-反應(yīng)關(guān)系。

圖4 受試物在+/–S9條件下，第2 d至第10 d各濃度組RICC變化曲線

A：4種濃度下AgNPs RICC變化曲線；B：4種濃度下TiO2NPs RICC變化曲線。PC (陽性對(duì)照)：200 μmol/L的EMS。+S9：添加肝微粒體代謝酶的體外活化系統(tǒng)；–S9：無肝微粒體代謝酶體外代謝活化系統(tǒng)。

圖5 受試物在–S9條件下體外PIG-A基因突變檢測(cè)結(jié)果

A: 不同濃度下AgNPs 24 h-S9突變率；B：不同濃度下TiO2NPs 24 h-S9突變率。PC (陽性對(duì)照)：200 μmol/L的EMS；*：基因突變率超過陰性對(duì)照組至少2倍為陽性。

AgNPs具有高效的抗菌活性，且不易產(chǎn)生抗藥性，因此AgNPs常被用于材料、電器、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[13]。根據(jù)多項(xiàng)體外遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AgNPs可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)微核率升高或者彗星尾DNA含量增高，但不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并非完全一致[12]。目前研究者們對(duì)于AgNPs的毒性是由納米顆粒引起的還是銀離子引起，或兩者共同引起還存在爭(zhēng)議[14]。有體外研究報(bào)道稱AgNPs在分散液中可以釋放出Ag+，且是納米銀產(chǎn)生細(xì)胞毒性的重要原因[15]。也有報(bào)道稱AgNPs所釋放的銀離子含量微乎其微，用電感耦合等離子體–質(zhì)譜儀(inductively cou-pled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)并未檢測(cè)到Ag+的釋放[16]。一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也提示，納米銀的毒性不僅僅只取決于釋放出的Ag+。如Kawata等[17]發(fā)現(xiàn)AgNPs處理的肝臟腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)微核，這些微核不能完全被銀離子配體半胱氨酸所清除。究其原因與納米銀顆粒大小、形狀、團(tuán)聚狀態(tài)及表面功能化等有關(guān)，有研究報(bào)道稱20~80 nm的AgNPs的毒性主要來源于Ag+的釋放，而10 nm的AgNPs由于尺寸較小更易穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜，毒性主要?dú)w于自身的尺寸效應(yīng)[18]。Liu等[19]也發(fā)現(xiàn)5 nm納米銀比20 nm和50 nm納米銀更加容易進(jìn)入人肝癌細(xì)胞，誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞膜損傷、活性氧產(chǎn)生、細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡。因此對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中對(duì)AgNPs中銀離子的含量測(cè)定及同濃度下的Ag+引起的遺傳毒性需進(jìn)行進(jìn)一步探究。

本研究中AgNPs的4 h彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，而體外基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。文獻(xiàn)報(bào)道AgNPs的遺傳毒性可能由Ag納米顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷，但是該損傷多發(fā)生在納米顆粒暴露于細(xì)胞后短時(shí)間內(nèi)，且該損傷能夠被細(xì)胞修復(fù)[20]。因此，推測(cè)本研究中AgNPs體外基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性的原因是由于納米物質(zhì)導(dǎo)致的DNA損傷被修復(fù)(彗星陽性)，無法誘導(dǎo)TK6細(xì)胞產(chǎn)生可穩(wěn)定遺傳的基因突變(體外基因突變陰性)。

TiO2NPs常用于白色無機(jī)染料或者化妝品中。TiO2NPs遺傳毒性檢測(cè)多采用體外微核實(shí)驗(yàn)或體外彗星實(shí)驗(yàn)，結(jié)果也存在陰性/陽性兩種結(jié)果[21,22]。本研究中TiO2NPs的彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，而體外基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。文獻(xiàn)報(bào)道TiO2NPs可能的遺傳毒性與AgNPs相似，均可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷[23]，該損傷為可修復(fù)的DNA損傷[24]；也有文獻(xiàn)報(bào)道其遺傳毒性可能由光催化或表面毒性吸附導(dǎo)致[25]。TiO2NPs的遺傳毒性作用機(jī)制仍有待闡明。

綜上所述，本研究采用具有基因功能的TK6細(xì)胞，使用體外彗星實(shí)驗(yàn)和體外基因突變實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)兩個(gè)常用納米物質(zhì)TiO2NPs和AgNPs的致DNA斷裂性和誘變性，初步證實(shí)彗星實(shí)驗(yàn)適用于納米物質(zhì)的遺傳毒性，而對(duì)于基因突變實(shí)驗(yàn)是否適用于納米物質(zhì)的遺傳毒性評(píng)價(jià)有待進(jìn)一步研究。本研究采用的方法簡(jiǎn)便、快速，在納米物質(zhì)的遺傳毒性體外檢測(cè)方面有較大的開發(fā)前景。

致謝

感謝上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司遺傳毒理實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)費(fèi)等支持！

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genotoxicity study of silver nanoparticles and titanium dioxide nanoparticles

Haimei Zhu1, Pengcheng Huang2, Tiantian Zhao3, Changhui Zhou2,3, Ruowan Li3, Chunrong Yu2,3, Zhiyong Chen2, Linfeng Gu2, Yan Chang1,2,3

Nanoparticles are widely used in cosmetic, pharmaceutical, and food industries, but their safety and genetic toxicity are still unclear. In this study, the genotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) and titanium dioxide nanoparticles (titanium dioxide nanoparticles) were evaluated byo comet assay andassay in TK6 cells. We exposed TK6 cells to two types of nanoparticles at the highest concentration of 200 μmol/L for 4 h and conducted thecomet assay. We examined the mutation results ofgeneafter 4 h, 24 ho and 10 days of exposure, respectively. We also examined the endocytosis of nanoparticles in TK6 cells exposed to nanoparticles for 24 h. In the endocytosis assay, with the increase of nano-material concentration, the side scatter (SSC) of TK6 cells in flow cytometry showed a concentration-dependent and time-dependent increase, indicating that TK6 cells could uptake both types of nanoparticles. In the comet assay, AgNPs could induce a concentration-dependent increase in DNA tail intensity. However, titanium dioxide NPs could not induce the concentration-dependent increase of DNA fluorescence intensity of comet tail.Intheassay, both AgNPs and TiO2NPs did not inducegene mutation frequency in TK6 cells. The results showed that AgNPs could induce DNA damage in TK6 cells, but could not induce increase ofgene mutation frequency. TiO2NPs neither induce DNA damage in TK6 cells nor increasemutation frequency. Further tests are needed to determine whether TiO2NPs are genotoxic.

silver nanoparticles; titanium dioxide nanoparticles; comet assay;assay; genotoxicity

2020-07-18;

2020-10-08

“十三五”重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：2018ZX09201017-008)和上海市科委研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)專項(xiàng)(編號(hào)：18DZ2290100)資助[Supported by “the13th Five-Year plan” Major New Drug Innovation and Technology Major Project (No. 2018ZX09201017-008), and the Shanghai Municipal Science and Technology Commission R&d Public Service Platform Project (No. 18DZ2290100)]

朱海美，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：毒理學(xué)方向，E-mail: 1695051900@qq.com

黃鵬程，碩士，專業(yè)方向：毒理學(xué)方向，E-mail: 774121501@qq.com

朱海美和黃鵬程為并列第一作者。

常艷，博士，研究員，研究方向：遺傳及生殖毒理學(xué)方向。E-mail: ychang@ncdser.com

10.16288/j.yczz.20-161

2020/11/13 9:13:04

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201112.1343.001.html

(責(zé)任編委: 周鋼橋)