基于分子對接技術(shù)篩選木姜子屬阿樸菲型生物堿的COX-2抑制劑研究(Ⅱ)

薛孟祺，汪欣怡，夏侯真如，夏綾譽，楊 平，楊念琦，張菊玉，汪云松，文政琦，楊靖華

(1.云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，教育部自然資源藥物化學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650091;2.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500； 3.昆明市婦幼保健院 孕產(chǎn)保健部，云南 昆明 650031;4.昆明醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650500)

木姜子(Litsea)是樟科(Lauraceae)植物中的一個大屬，據(jù)統(tǒng)計全球有200余種.我國有該屬植物72種，其中47種為我國特有[1].木姜子屬植物有著極高的藥用價值，在古代，我國民間就有使用木姜子治療炎癥類疾病的記載.如豹皮樟對腰酸腿痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛有較好療效；山雞椒有祛風(fēng)止寒，消腫化瘀的功效[2].

現(xiàn)今，炎癥類疾病的發(fā)病機制已被現(xiàn)代藥理學(xué)所揭示.一個經(jīng)典的炎癥反應(yīng)包含4部分組件：炎癥誘導(dǎo)物；傳感器；炎癥介質(zhì)以及炎癥目標(biāo)組織.由炎癥誘導(dǎo)物激活傳感器釋放炎癥介質(zhì)作用于靶組織從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng).炎癥的介質(zhì)可以有細(xì)胞因子，類花生四烯酸和蛋白水解級聯(lián)產(chǎn)物等[3].其中，通過阻斷類花生四烯酸類炎癥介質(zhì)進(jìn)而切斷炎性反應(yīng)通路的方法已經(jīng)取得了成功，誕生了如塞來昔布以及艾瑞昔布等一系列選擇性環(huán)氧合酶抑制劑.

由炎癥誘導(dǎo)物的刺激，細(xì)胞膜上的磷脂在磷脂酶A2(PLA2)的作用下轉(zhuǎn)化為花生四烯酸(AA).AA在環(huán)氧合酶(COX)的作用下產(chǎn)生前列腺素H2(PGH2).COX具有2種同工酶，COX-1與COX-2，其中COX-1是1種正常的結(jié)構(gòu)酶，在體內(nèi)的所有組織中均有分布，維持機體的正常運轉(zhuǎn).而COX-2只在炎癥組織中特異性表達(dá)[4].COX生成的PGH2又在組織異構(gòu)酶的參與下轉(zhuǎn)化為不同的結(jié)構(gòu)，從而作用于不同的組織與器官[5].塞來昔布以及艾瑞昔布等藥物正是特異性地作用于COX-2，阻止前列腺素(PGS)的形成，從而切斷炎癥通路.但近來報道，這些藥物存在嚴(yán)重的心血管副作用，已經(jīng)導(dǎo)致了羅非昔布與依托昔布的退市[6].目前急需開發(fā)新型的COX-2抑制劑.

阿樸菲生物堿是木姜子屬植物的特征性成分之一[7，11].已有研究報道一些阿樸菲型生物堿對小鼠爪水腫模型具有抗炎與止痛功效[8-9].木姜子屬阿樸菲生物堿與COX-2的對接研究未見報道，文中對來自木姜子屬的34個阿樸菲生物堿采用分子對接技術(shù)展開研究，利用分子對接軟件Molegro Virtual Docker 6.0(MVD)分析其對接得分以及分子與蛋白之間的相互作用關(guān)系，來探究分子與蛋白之間的構(gòu)效關(guān)系，研究木姜子屬抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，為新型藥物的研發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 阿樸菲生物堿的分類

將34個已報道木姜子屬阿樸菲生物堿進(jìn)行分組，依據(jù)N原子上連接取代基的不同，分為7種結(jié)構(gòu)類型，結(jié)構(gòu)如圖1.為了方便研究，實際分組時，分為5類，見圖2～6.

圖1 阿樸菲生物堿結(jié)構(gòu)分類

圖2 N-CH3型阿樸菲生物堿

圖3 N-COOMe型阿樸菲生物堿

圖5 帶電荷雙取代型阿樸菲生物堿

圖6 N-乙?；cN-烯丙基型阿樸菲生物堿

1.2 分子對接

1.2.1 受體蛋白的構(gòu)建

COX-2蛋白從PDB數(shù)據(jù)庫下載，ID為6COX[10].該蛋白由2個相同的二聚體組成，首先將其導(dǎo)入Molegro Virtual Docker 6.0軟件，采用CHARMm力場優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)，除去水分子，只保留蛋白的B鏈，去除多余配體，保存為mol2格式備用.

1.2.2 配體庫的構(gòu)建

將34個阿樸菲生物堿采用ChemDraw 2014軟件繪制其2D結(jié)構(gòu)[11]，導(dǎo)入Chem3D 2014軟件中，采用MMFF94算法計算出化合物的最低能量構(gòu)型，將最大迭代次數(shù)設(shè)置為 5 000，最大RMS梯度設(shè)置為0.5.將設(shè)置好的3D結(jié)構(gòu)保存為mol2格式備用.

1.2.3 對接方法確定

采用之前確定的對接方法，打分函數(shù)采用Moldock Score，搜索算法為Moldock SE，調(diào)整對接腔半徑為12，每個化合物對接計算15次，輸出得分最高的前3個結(jié)果.在重現(xiàn)蛋白原配體時的RMSD為1.164，小于2，說明對接方法可以使用[12].為了確保對接結(jié)果的可靠性，取3次打分結(jié)果的平均值作為每個化合物的最終得分，并將艾瑞昔布(A)作為陽性對照.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 N-CH3 型阿樸菲生物堿構(gòu)效關(guān)系研究

N-CH3型阿樸菲生物堿打分結(jié)果如下表所示.無甲氧基取代以及單甲氧基取代的阿樸菲生物堿得分接近，將其放在一起對比.根據(jù)打分結(jié)果，可以觀察到1個明顯的趨勢，即無甲氧基取帶的阿樸菲生物堿與一甲氧基取代的阿樸菲生物堿得分最高，隨甲氧基數(shù)量的增加，分子得分逐步降低.

表1 N-CH3型阿樸菲生物堿打分結(jié)果

N-CH3型阿樸菲生物堿分子與COX-2的對接研究，揭示了下述研究結(jié)果：

1) 從圖7的對接結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，1，2與4的雙氧環(huán)結(jié)構(gòu)可以與蛋白形成1～2個氫鍵，分子上的羥基也易于形成氫鍵.并且2上的N原子也可以與氨基酸殘基形成氫鍵.

圖7 無甲氧基與一甲氧基取代N-CH3阿樸菲生物堿與COX-2二維相互作用

2) 當(dāng)二甲氧基取代時，打分較單甲氧基型下降.通過對對接結(jié)果的觀察可以發(fā)現(xiàn)，5與6的得分最低，它們基本不與蛋白產(chǎn)生氫鍵作用.而7與9的得分較5與6顯著增加，分子與蛋白之間也能產(chǎn)生較多的氫鍵作用.它們的區(qū)別在于5與6的4個取代基位置為R3，R4，R6和R7，而7與9的取代位點為R3，R4，R5和R6.由此推測當(dāng)取代基在環(huán)上的位置集中在一起時，有利于蛋白與阿樸菲生物堿之間的氫鍵作用從而使得相互作用增強.

3) 通過觀察8的對接情況發(fā)現(xiàn)雖然其也存在雙氧環(huán)結(jié)構(gòu)，但對接得分較低，從8的相互作用圖中可以發(fā)現(xiàn)該分子為R6，R7雙甲氧基取代，R6位上的甲氧基出現(xiàn)了非常明顯的紅色區(qū)域，這表示處于該區(qū)域的結(jié)構(gòu)對于對接的貢獻(xiàn)為負(fù)，這一結(jié)果說明在R6與R7位上同時出現(xiàn)甲氧基對于分子蛋白相互作用不利.

4)10與5和6具有類似的結(jié)構(gòu)，但其對接得分卻遠(yuǎn)高于5與6.通過觀察發(fā)現(xiàn)10在R9位上存在1個羰基，該羰基可以與Tyr355形成氫鍵作用，推斷該羰基使對接得分提高.

5)11與12的對接情況和14與16的對接結(jié)果對比，驗證了之前的結(jié)論，即當(dāng)取代基在環(huán)上的位置集中(即在R3，R4，R5，R6上取代)時，有利于蛋白與阿樸菲生物堿之間的氫鍵作用從而使得相互作用增強.

6) 分子15上存在5個取代位點，其結(jié)構(gòu)相比于11和12在R7位上多了1個取代基，導(dǎo)致了對接得分的降低，通過與前面對接結(jié)構(gòu)的綜合比較可以得知阿樸菲分子中存在3個或4個取代基相比于5個取代基來說與蛋白結(jié)合更為有利.

7)17的對接結(jié)果驗證了之前R6與R7位同時被甲氧基取代不利于分子與蛋白相互作用的結(jié)論.

2.2 N-COOMe型阿樸菲構(gòu)效關(guān)系研究

表2 N-COOMe型阿樸菲生物堿打分結(jié)果

N-COOMe型阿樸菲分子與COX-2的對接研究，揭示了下述研究結(jié)果：

1) 通過總體觀察，N-COOMe型阿樸菲生物堿得分總體低于N-CH3型.從對接結(jié)果圖中可以觀察到酯基上存在紅色區(qū)域，不利于分子與蛋白相互作用.但也存在與N-CH3型阿樸菲生物堿相同的規(guī)律，即甲氧基的數(shù)量越少，蛋白與分子結(jié)合更為有利.

2) 分子18與23中R5與R8位上的2個羰基有助于氫鍵的形成，并且18中R3與R4位存在雙氧環(huán)結(jié)構(gòu)也有利于對接，因此18的打分最高，23次之.

3) 從21與20,24的對接結(jié)果來看，R6與R7位同時存在甲氧基也對對接不利.

2.3 碳氮雙鍵型阿樸菲構(gòu)效關(guān)系研究

表3 碳氮雙鍵型阿樸菲打分

碳氮雙鍵型阿樸菲分子與COX-2的對接研究，揭示了下述研究結(jié)果：

圖9 三甲氧基與四甲氧基N-CH3阿樸菲生物堿與COX-2二維相互作用

2.4 帶電荷雙取代型阿樸菲構(gòu)效關(guān)系研究

表4 帶電荷雙取代型阿樸菲打分

帶電荷雙取代型阿樸菲分子與COX-2的對接研究，揭示了下述研究結(jié)果：

1) 從圖12中可以看出相互作用中不存在離子鍵，N離子對于對接的影響可以忽略不記.從打分結(jié)果來看4個離子型阿樸菲對接結(jié)果均不理想，N上連接雙取代基不利于對接.

2)29與甲基取代型7在結(jié)構(gòu)上具有相似性，它們的R4與R5位上均是雙羥基取代，再次證明該結(jié)構(gòu)有利于形成氫鍵作用，對成鍵有利.

2.5 N-乙酰基與N-烯丙基型阿樸菲構(gòu)效關(guān)系研究

圖10 N-COOMe型阿樸菲與COX-2二維相互作用

圖11 碳氮雙鍵型阿樸菲與COX-2二維相互作用

圖12 帶電荷雙取代型阿樸菲與COX-2二維相互作用

圖13 33，34與COX-2二維相互作用

3 結(jié)語

通過分組對34個阿樸菲型生物堿與COX-2蛋白的對接研究中，揭示了一系列規(guī)律.

1) 分子對接的得分高低與甲氧基數(shù)量之間存在關(guān)系，隨著甲氧基取代數(shù)量的增多，對接的得分會逐步降低.當(dāng)阿樸菲中不含甲氧基或者只含有1個甲氧基時，對接得分最高.含4個甲氧基時得分最低.

2) 當(dāng)在阿樸菲母核的R3，R4位或R6，R7位形成雙氧五元環(huán)結(jié)構(gòu)時，環(huán)上的2個氧原子易于和蛋白之間形成氫鍵，從而增加對接得分.

3) 甲氧基結(jié)構(gòu)相比于雙氧環(huán)結(jié)構(gòu)以及羥基來說，較難與蛋白之間產(chǎn)生氫鍵作用，這也是為什么甲氧基的取代增加會導(dǎo)致對接得分降低的直接原因.并且，從以上相互作用圖中可以得知，當(dāng)R6與R7位同時被甲氧基占據(jù)時，阿樸菲與蛋白之間的匹配度會急劇降低，產(chǎn)生極低的得分.

4) 當(dāng)在分子中引入羰基后，可以增加氫鍵作用的概率，提高得分，如在R3與R8以及R9位引入羰基.

5) 除羰基和N上的取代外，分子中3～4個位點的取代有較好的對接結(jié)果，如果增加取代基數(shù)量，則不利于與蛋白相互作用.并且當(dāng)4個取代基的位置集中，即同時取代R3，R4，R5，R6 4個位點時，有利于分子與蛋白間的相互作用.最后，R3與R4位同時被羥基取代，有利于氫鍵的形成.

6) N上取代基的不同對對接得分有很大的影響，從結(jié)果統(tǒng)計來看，N上連接甲基，或者形成碳氮雙鍵的結(jié)構(gòu)得分最高，且打分?jǐn)?shù)值相近.當(dāng)連接乙酰基，烯丙基，酯基后得分變得很低.并且N上連接雙取代基的分子打分也不理想，由此推斷減小N上的位阻有利于分子與蛋白之間的相互作用，增大位阻則不利于相互作用.

此外，研究過程中我們還引入了陽性對照藥物艾瑞昔布，通過對打分結(jié)果的統(tǒng)計，N-CH3型阿樸菲生物堿2的得分大于陽性對照，1與艾瑞昔布近似相同.含碳氮雙鍵的阿樸菲生物堿25與26得分大于艾瑞昔布.這4個分子值得開展進(jìn)一步的研究.

近年來研究表明COX-2除與炎癥類疾病相關(guān)外,在血小板活化綜合征、不穩(wěn)定的心絞痛、嚴(yán)重的動脈粥樣硬化疾病中，患者的PGI-M排泄增加[13-15]，而主要合成PGI-M的酶正是COX-2,除此之外，2型糖尿病、肥胖、神經(jīng)退行性疾病，這些疾病能與慢性炎癥起到相互協(xié)同的作用.比如肥胖可以誘發(fā)慢性炎癥，而慢性炎癥又可以反過來通過使胰島素分泌減少從而促進(jìn)肥胖型糖尿病的發(fā)生[16].在癌癥與動脈粥樣硬化等疾病中也有相似的作用.因此，抑制COX-2可以間接性的治療這些與炎癥相互協(xié)同的疾病.研究結(jié)果表明阿樸菲類生物堿具有較強的藥用潛力，值得開展進(jìn)一步的深入研究.