基于COI基因?qū)υ颇鲜≯潞？h叮咬人的蚋進(jìn)行種類鑒定

孟錦昕，吉明勝，何于雯，李楠，王靜林*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.勐臘縣勐捧鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 勐臘 666309)

蚋屬于昆蟲綱，雙翅目(Diptera)，蚋科(Simuliidae)，是醫(yī)學(xué)昆蟲中的重要類群[1]。蚋對(duì)人類、畜禽、嚙齒類動(dòng)物、野生動(dòng)物等進(jìn)行騷擾性吸血，并傳播多種疾病。人被叮咬后出現(xiàn)紅斑、水泡等，嚴(yán)重的可引發(fā)皮疹和過(guò)敏反應(yīng)，并發(fā)過(guò)敏性哮喘和“蚋熱病”，可傳播多種人獸共患病，如盤尾絲蟲病(河盲癥)、歐氏曼森線蟲病和禽鳥住白蟲病等[2]。

我國(guó)常有蚋類昆蟲叮咬人的事件報(bào)道，2004年，某海訓(xùn)部隊(duì)遭到蚋的大量侵襲，引起戰(zhàn)士皮炎，出疹率高達(dá)96.9%，發(fā)燒占3.0%[3]；2011年，登封市東華鎮(zhèn)劉莊村70%～90%的村民遭受蚋蟲叮咬，部分出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，大部分村民在2周左右痊愈，個(gè)別村民癥狀持續(xù)數(shù)月[4]；2019年，云南省中老越三國(guó)交界處蚋叮咬人并引發(fā)皮炎[5]。2019年8月，在云南省勐?？h采集吸血昆蟲時(shí)，采集人員被黑色昆蟲叮咬引起皮炎，為了明確該地區(qū)叮咬人吸血昆蟲種類，在當(dāng)?shù)夭杉ハx，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

2019年8月21日8:30—8:45，在云南省勐海縣勐宋鄉(xiāng)曼烈村(北緯22°31′，東經(jīng)100°29′，海拔1262m)，采用人誘法捕捉吸血昆蟲。將采集到的昆蟲放入75%的乙醇中，4℃保存，帶到實(shí)驗(yàn)室。

1.2 標(biāo)本處理及形態(tài)學(xué)鑒定

在體視顯微鏡(OLYMPUS，SZ2-ILST)下切下昆蟲翅膀，蟲體放入含1%蛋白酶K的組織消化液中，56℃消化過(guò)夜[6]，消化液用于昆蟲基因組DNA提??；蟲體分別經(jīng)過(guò)10% KOH透明，50%～100%乙醇脫水處理，壓片，在光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，CX31)下觀察昆蟲形態(tài)特征，參照《中國(guó)蚋科昆蟲》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3 蚋的分子生物學(xué)鑒定

上述消化液用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天隆科技有限公司，西安)按照試劑盒說(shuō)明書提取昆蟲基因組DNA，取2μL DNA為模板用COI基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]，電泳，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司(昆明測(cè)序部)測(cè)序。

1.4 序列分析

獲得核苷酸序列首先在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)。在GenBank中下載16條蚋的COI基因核苷酸序列，使用DNAStar軟件中MegAlign進(jìn)行核苷酸同源性分析，用MEGA 6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(采用NJ法，bootstrap值為1000)和遺傳距離分析。

2 結(jié)果

2.1 蚋形態(tài)學(xué)鑒定

15min內(nèi)共采集到叮咬人的昆蟲9只，編號(hào)為MH-1至MH-9，昆蟲體形似蠅，蟲體長(zhǎng)約3～4mm，呈黑色(圖1A)；額寬，復(fù)眼，口器厚而短，兩條觸須(圖1B)；觸角10節(jié)，成對(duì)排列(圖1C)；翅透明，前緣脈具毛和刺，徑分脈(Rs)末段不分叉(圖1D、E)；中胸盾片棕黑色，呈拱形，蓋以黃色柔毛，無(wú)黑縱條(圖1F)；爪較長(zhǎng)，無(wú)基齒(圖1G、H)；腹部生殖板較寬，呈長(zhǎng)方形，有受精囊，近似球形(圖1I)；具有三叉頭狀的生殖叉突，兩臂短、末端膨大(圖1J)。

A B C

D E

F G H

I J

2.2 COI基因序列分析

測(cè)序拼接獲得編號(hào)為MH-1至MH-9的9只蚋的COI基因序列462bp，在COI形成的數(shù)據(jù)矩陣中，所有樣本之間的平均遺傳距離為0.120。MH-1至MH-9的遺傳距離在0.000～0.010，與參考序列S.nodosum的遺傳距離在0.000～0.027；與參考序列S.undecimum(MH557844)相比距離均最遠(yuǎn)，在0.228～0.241(表1)。蚋COI基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示9只蚋與S.nodosum處于同一進(jìn)化分支，且與S.nodosum(KP661445)遺傳距離最近(圖2)。

圖2 云南省勐?？h采集蚋COI基因核苷酸序列(462 bp)系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

云南省勐海縣位于云南省西南部，屬熱帶、亞熱帶西南季風(fēng)氣候，年平均氣溫18.7℃，降雨量充足，動(dòng)植物種類豐富，吸血昆蟲種類多、密度大，經(jīng)常有昆蟲叮咬人引起皮炎的事件發(fā)生，且夏秋兩季人或動(dòng)物存在不明原因的多種疾病，因此，需要加強(qiáng)吸血昆蟲種類調(diào)查及攜帶病原的研究。

本研究2019年8月21日在云南省勐?？h勐宋鄉(xiāng)曼烈村采集的9只昆蟲與在云南省江城縣采集的S.nodosum形態(tài)學(xué)特征相似[5]，蟲體黑色，爪無(wú)基齒，徑分脈不分叉，觸角10節(jié)，生殖叉突為三叉頭狀，這些形態(tài)學(xué)特征提示，本次采集的蚋可能是S.nodosum。

《世界蚋類名錄》記載全世界已知的蚋有2300余種[8]，陳漢彬報(bào)道我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的蚋有333種[9]，之后仍不斷有蚋類新種類被報(bào)道[6,10]。巨大的種類數(shù)量及高度的形態(tài)學(xué)相似性[11]，使得從形態(tài)學(xué)上鑒定蚋的種類變得極為困難。Hebert在2003年提出了DNA Bar-codes技術(shù)，即DNA條形碼技術(shù)[12]，該技術(shù)以功能結(jié)構(gòu)最為保守的線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因(COI)作為“條形碼”，已廣泛應(yīng)用于雙翅目昆蟲的分類研究。何艷霞等已證實(shí)COI基因鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果具有一致性，且COI基因鑒定法能較好的反映蚋亞屬的種間關(guān)系[13]。本研究采用COI作為分子靶標(biāo)對(duì)勐?？h采集的9只吸血昆蟲進(jìn)行了分子鑒定，9只蚋與S.nodosum處于同一進(jìn)化分支，與S.nodosum的遺傳距離最小(0.000～0.027)，核苷酸同源性最高(>97%)，從分子生物學(xué)水平明確了本次采集的9只蚋均為S.nodosum。