肉蓯蓉水提物體外抗氧化及對小鼠腸道菌群紊亂的作用

何夢夢，游林，包曉瑋，*，魏晨業(yè)，肖子軒，李澤霖，曾蘭君，王慧君，趙玉婷

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司，新疆和田848000）

腸道微生態(tài)由腸道菌群菌種、腸道菌群代謝物和黏膜屏障構(gòu)成，可以通過腸道神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)及神經(jīng)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等參與機體生理活動[1-2]。腸道是機體炎癥發(fā)生的最初部位，在人體代謝過程中，自由基損傷是炎癥病理損傷的重要組成部分，機體未能及時清除自由基使其在機體蓄積，最終在腸道組織內(nèi)產(chǎn)生，過量的自由基導致腸道組織結(jié)構(gòu)破壞，病原菌與有害物質(zhì)與腸道上皮細胞充分接觸引發(fā)炎癥，引起腸道菌群紊亂等[3-4]。研究表明，腸道菌群的組成和數(shù)量與機體健康有一定聯(lián)系。抗生素在合理的劑量下，能夠有效抑制并殺滅病原體，在治療疾病中發(fā)揮著重要作用[5]。近年來，抗生素的濫用導致植物源及動物源食品抗生素超標從而導致腸道菌群紊亂引發(fā)腸道黏膜系統(tǒng)受損導致內(nèi)部環(huán)境紊亂，不利于微生物定植，增加腸道疾病的風險[6-7]。天然植物調(diào)節(jié)抗生素引起的腸道微生態(tài)失衡已成為研究熱點[8]。

管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（ Schrenk）Wight]，別名大蕓，主要寄生于檉柳屬植物根部[9]。近年來，肉蓯蓉以廣泛的藥理活性及保健功效在治療疾病、保障健康中發(fā)揮著重要的作用，市場前景樂觀[10]。國內(nèi)外學者對肉蓯蓉的化學成分及藥理活性等進行深入的研究，藥理活性的研究主要集中在激素調(diào)節(jié)、潤腸通便、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及預防老年癡呆、神經(jīng)保護、改善微循環(huán)、影響腸道菌群等藥理作用[11-12]。目前，肉蓯蓉調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂的研究較少，本研究主要以還原力、DPPH自由基、ABTS+自由基、O2-自由基清除能力考察肉蓯蓉水提物體外抗氧化能力。通過計算腸道菌群、腸道定植能力（B/E值），組織染色法觀察結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)腸絨毛長度、隱窩深度、結(jié)腸絨毛高度/隱窩深度（V/C）綜合考察肉蓯蓉水提物對小鼠腸道菌群紊亂的影響，以期為肉蓯蓉調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

管花肉蓯蓉干片：和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）：國藥集團化學試劑有限公司；羥甲基氨基甲烷（Tris）：美國 Amresco公司；MRS培養(yǎng)基：杭州生物試劑有限公司；BBL培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；Pfizer腸球菌選擇性瓊脂、伊紅美藍瓊脂：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；SPF級雄性C57BL/6小鼠：新疆醫(yī)科大學實驗動物中心24只，體質(zhì)量（20±2）g。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204-4C電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；XL-02A粉碎機：燁昌機械有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋、DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計、JQ000453無菌操作臺：蘇凈集團安泰公司；SX-500高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；ECLIPS CI顯微鏡：尼康映像儀器銷售（中國）有限公司

1.3 試驗方法

1.3.1 肉蓯蓉水提物的制備

參照葛繼紅等[13]提取方法，并稍作改動。由于水的張力較大，如用粒徑小于40目的肉蓯蓉顆粒提取，較難過濾，故將肉蓯蓉干片粉碎，取粒徑在20目～40目間的肉蓯蓉顆粒，按料液比1∶10（g/mL），提取時間5 h，沸水浴條件下回流提取兩次，過100目濾網(wǎng)，抽濾，過0.45 μm濾膜，濃縮成浸膏備用。

1.3.2 肉蓯蓉水提物體外抗氧化作用

1.3.2.1 肉蓯蓉水提物DPPH自由基清除率的測定

參照楊冰鑫等[14]方法，稍作改進。配置不同濃度的肉蓯蓉水提物溶液，517 nm處測定吸光度，VC為陽性對照，計算其清除率。

清除率/%＝[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為蒸餾水加DPPH溶液的吸光度；A1為待測樣加DPPH溶液的吸光度；A2為待測樣加蒸餾水的吸光度。

1.3.2.2 肉蓯蓉水提物還原能力的測定

參照Omage[15]方法，稍作改動。配置不同濃度的肉蓯蓉水提物溶液取，700nm處測定吸光度，Vc為陽性對照。

1.3.2.3 肉蓯蓉水提物ABTS+·清除試驗

參照蒲成偉等[16]方法，稍作改動。配置不同濃度的肉蓯蓉水提物溶液取，734 nm處測定吸光度，VC為陽性對照，計算其清除率。

清除率/%＝（1-A1/A0）×100

式中：A1為4 mLABTS+溶液加1 mL樣液的吸光度；A0為4 mL ABTS+溶液加1 mL蒸餾水的吸光度。

1.3.2.4 肉蓯蓉水提物中O2-自由基清除率的測定

參照Luo等[17]方法，稍作改動。配置不同濃度的肉蓯蓉水提物溶液，325 nm處測定吸光度，VC為陽性對照，計算其清除率。

清除率/%＝[1-（A1-A2）/A3]×100

式中：A1為 4 mLTris-HCl加 20 μL 鄰苯三酚和1 mL 樣液的吸光度；A2為 4 mLTris-HCl加 20 μL 蒸餾水和1 mL樣液的吸光度；A3為4 mLTris-HCl加20 μL鄰苯三酚和1 mL蒸餾水的吸光度。

1.3.3 肉蓯蓉水提物對腸道菌群紊亂的作用

1.3.3.1 動物分組與樣品采集處理

參照史瑛等[18]方法，稍有改動。小鼠適應(yīng)1周后隨機分為4組，每組6只，分別為空白對照組、頭孢克肟誘導腸道菌群紊亂模型組、肉蓯蓉水提物低劑量組（1 mg/g）、高劑量組（2 mg/g）。腸道菌群紊亂模型組頭孢克肟給藥劑量為30 mg/kg為成人劑量的10倍每天，第1、3次灌服頭孢克肟，第2次灌服生理鹽水。肉蓯蓉水提物低（高）劑量第1、3次灌服頭孢克肟，第2次灌服低劑量肉蓯蓉水提物。空白組每天灌服3次相同劑量生理鹽水。

每隔 3 d～4 d 測定體重，灌胃第 0、7、14 天，在無菌操作臺下用滅菌管采集老鼠糞便，放入-20℃冰箱保存，最后一天灌胃結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取心臟、胸腺、脾、肝臟、肺、腎、腦稱量臟器質(zhì)量計算臟器系數(shù)。并留取結(jié)腸組織樣本于在10%的福爾馬林中。

臟器系數(shù)＝小鼠臟器（g）/小鼠體重（g）

1.3.3.2 腸道菌群定量檢測

參照王琳等[19]方法，稍作改動。按表1腸道菌群培養(yǎng)條件將糞便稀釋后，在相應(yīng)的濃度下接種于不同的選擇型培養(yǎng)基中，采用活菌計數(shù)公式計數(shù)，結(jié)果以每克糞便濕重中菌落形成的對數(shù)值形式表示以計算菌落總數(shù)（lgCFU/g）。并計算B/E值。

每克糞便菌落數(shù)＝lg（菌落總數(shù)×稀釋倍數(shù)×每次稀釋取樣體積）/（接種體積×樣品質(zhì)量）

B/E值＝雙歧桿菌菌落總數(shù)/大腸桿菌菌落總數(shù)

1.3.3.3 小鼠結(jié)腸組織病理學觀察

小鼠處死后，立即取出新鮮的結(jié)腸，用生理鹽水沖去腸內(nèi)容物，置于10%中性福爾馬林中固定。按常規(guī)方法脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)橫斷切片，切片厚5 μm，HE染色。使用光學顯微鏡拍照觀察并比較結(jié)腸黏膜形態(tài)變化，測量結(jié)腸絨毛長度、隱窩深度、計算絨毛長度/隱窩深度比值（V/C 值）[20]。

表1 腸道菌群培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions of intestinal flora

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 肉蓯蓉水提物體外抗氧化作用

ABTS+自由基、DPPH自由基、O2-自由基清除率及還原力是體外抗氧化能力的檢測指標，ABTS+自由基、DPPH自由基清除率的原理是通過提供H原子或質(zhì)子清除自由基[21]。O2-自由基清除率是通過結(jié)合O2-自由基，阻止H2O2、單重態(tài)氧等的形成。還原力則是通過破壞自由基鏈，給出H原子并發(fā)揮抗氧化作用[22]。圖1為肉蓯蓉水提物的體外抗氧化作用。

圖1 肉蓯蓉水提物體外抗氧化作用Fig.1 Antioxidant effect of Cistanche deserticola in vitro

由圖1（1）可知肉蓯蓉水提物DPPH自由基清除率隨濃度的增大而增加，0.3 mg/mL時肉蓯蓉水提物DPPH自由基清除率最接近同濃度VC，0.3 mg/mL后肉蓯蓉水提物DPPH自由基清除率增加速率減小。

圖1（2）可知肉蓯蓉水提物對ABTS+自由基具有一定清除率，且與其濃度呈正相關(guān)，0.5 mg/mL時肉蓯蓉水提物ABTS+自由基清除率最高為95.49%。VC的ABTS+自由基清除率始終維持在97%左右。

圖1（3）可知肉蓯蓉水提物超氧陰離子自由基清除率明顯低于VC，0.3 mg/mL后超氧陰離子自由基清除率增長緩慢，0.5 mg/mL時肉蓯蓉水提物超氧陰離子自由基清除率最高為32.69%。

圖1（4）可知肉蓯蓉水提物及VC的還原力均具有濃度依賴性，同濃度VC還原力與肉蓯蓉水提物相比增加速率較大。結(jié)果表明，肉蓯蓉水提物具有良好的體外抗氧化作用，其DPPH自由基、ABTS+自由基、O2-自由基的 IC50值依次為 0.225、1.819、12.53 mg/mL。肉蓯蓉水提物具有良好的抗氧化能力可能由于其主要活性成分苯乙醇苷類化合物的苯環(huán)上具有多對鄰酚羥基，這是使化合物具有清除自由基活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[23]。

2.2 肉蓯蓉水提物對腸道菌群紊亂小鼠的影響

2.2.1 肉蓯蓉水提物對腸道菌群紊亂小鼠體質(zhì)量的影響

小鼠體質(zhì)量會隨機體生理變化發(fā)生改變，4組小鼠在不同灌胃天數(shù)下的體重變化情況見表2。

由表2可知，灌胃第3天每組小鼠體重出現(xiàn)明顯降低，后緩慢升高，可能由于開始灌胃后引起小鼠應(yīng)激反應(yīng)使得體重下降。第9天前每組小鼠體重變化與空白組無顯著性差異，第9天時與空白組相比其他3組體重有顯著性差異（P<0.05），第12天時模型組與空白組相比體重降低（P<0.01），肉蓯蓉低劑量組與空白組體重降低（P<0.05），肉蓯蓉高劑量組體重變化與空白組相近（P>0.05），第14天時模型組與空白組有顯著性差異，肉蓯蓉水提物低劑量與高劑量組無顯著性差異，結(jié)果表明肉蓯蓉水提物在一定濃度下能夠控制由抗生素導致的體質(zhì)量下降。

表2 小鼠體質(zhì)量變化Table 2 Changes in body weight of mice g

2.2.2 肉蓯蓉水提物對腸道菌群紊亂小鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)能間接反映營養(yǎng)物質(zhì)在機體中的有效沉積、吸收和利用[24]。4組小鼠臟器指數(shù)變化見表3。

由表3可知，4組小鼠心臟、脾、肝臟、肺、腎、腦指數(shù)差異不顯著（P>0.05），而與空白組相比，模型組、肉蓯蓉低劑量組和高劑量組胸腺指數(shù)存在顯著性差異（P<0.05），其中肉蓯蓉水提物低劑量組胸腺臟器指數(shù)與空白組存在極顯著差異（P<0.01），模型組與空白組相比胸腺指數(shù)顯著降低，表明長期灌服頭孢克肟對小鼠胸腺的生長發(fā)育可能具有抑制作用，引起免疫抑制。與模型組相比肉蓯蓉水提物高劑量胸腺指數(shù)顯著提高（P<0.05），肉蓯蓉水提物低劑量組小鼠胸腺指數(shù)降低（P<0.05）。胸腺作為中樞免疫器官一定程度上反應(yīng)了機體的免疫功能，可能由于肉蓯蓉水提物中的肉蓯蓉多糖促進機體中免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的IL-2，促進免疫細胞增殖，促進胸腺成熟細胞的釋放，緩解應(yīng)激功能，使免疫功能趨于穩(wěn)定，減輕抗生素引起對小鼠免疫器官的生長抑制[25]。

表3 肉蓯蓉水提物對腸道菌群紊亂小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of Cistanche deserticola water extract on organ index of mice with intestinal flora disorder mg/g

2.2.3 肉蓯蓉水提物對腸道紊亂小鼠腸道菌群的影響

按對機體健康的影響，腸道菌群可分為：益生菌、有害菌和調(diào)節(jié)致病菌，共同調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡。雙歧桿菌、乳酸菌作為腸道中典型的益生菌，能夠改善腸道功能，刺激機體免疫功能，促進抗炎因子的分泌，緩解炎癥反應(yīng)等。條件致病菌在菌群平衡時不致病，但一旦處于生態(tài)失調(diào)的狀態(tài)下，這類細菌可成為致病菌，如大腸桿菌、腸球菌[26]。腸道菌群特定微生物比例失調(diào)會影響腸道菌群平衡，B/E值（雙歧桿菌/大腸桿菌）可反映腸道內(nèi)正常菌群對致病菌群定植的抵抗力，腸道環(huán)境良好時B/E值≥1[27]。圖2為肉蓯蓉水提物對腸道紊亂小鼠腸道菌群數(shù)量變化情況。

圖2 肉蓯蓉水提物對腸道紊亂小鼠腸道菌群的影響Fig.2 Effect of Cistanche deserticola water extract on intestinal flora in mice with intestinal disorders

圖2（1）可看出灌胃7 d時，與空白組相比模型組小鼠糞便中雙岐桿菌含量降低（P<0.01），肉蓯蓉水提物低劑量組及高劑量組與空白及模型組相比雙岐桿菌數(shù)量升高（P<0.01），14 d時模型組及低劑量組與空白組相比雙岐桿菌顯著降低（P<0.01），高劑量組與模型組相比升高（P<0.01）。圖 2（2）可知，灌胃 7 d 時，模型組及低劑量與空白組相比組小鼠乳酸菌數(shù)量降低（P<0.01），高劑量組乳酸菌含量升高（P<0.01）。14 d時低劑量組及高劑量組與模型組相比乳酸菌含量升高（P<0.01）。圖2（3）可知，灌胃7 d時模型組、低劑量組、高劑量組腸球菌與對照組比顯著升高（P<0.01）14 d后低劑量組、高劑量組腸球菌與模型組比顯著降低（P<0.01）。圖 2（4）可知，灌胃 7 d 時模型組、低劑量組、高劑量組大腸桿菌菌與對照組比顯著升高（P<0.01）14 d后低劑量組、高劑量組大腸菌與模型組比顯著降低（P<0.01）。圖2（5）可知，灌胃7 d時模型組、低劑量組、高劑量組B/E值與對照組比顯著降低（P<0.01），且模型組B/E值<1，低劑量組、高劑量組B/E值>1，表明低劑量組、高劑量組腸道環(huán)境比模型組好。14 d后組模型組B/E值顯著低于對照組（P<0.01），高濃度組與對照組B/E值差異不顯著（P>0.05）。試驗表明肉蓯蓉能顯著提高腸道菌群紊亂小鼠糞便中雙岐桿菌、乳酸菌含量B/E值，對腸球菌及大腸桿菌生長有一定抑制作用。肉蓯蓉對腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用，可能由于其在機體內(nèi)參與糖代謝從而維持機體內(nèi)代謝穩(wěn)態(tài)，改善機體內(nèi)環(huán)境，從而降低抗生素對腸道菌群紊亂的影響[28]。

2.2.4 肉蓯蓉水提物對小鼠腸道菌群紊亂結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變對機體生長發(fā)育、消化吸收、免疫調(diào)節(jié)、腸道損傷修復具有一定影響。腸絨毛能夠增大腸道黏膜表面積以及與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，增強腸道的消化吸收功能。隱窩細胞向絨毛頂端遷移分化后形成絨毛細胞，補充絨毛上皮細胞脫落。絨腺比（V/C值）能綜合反映腸道消化狀況，與腸道消化吸收能力成正比。腸絨毛、隱窩、V/C值代表腸道黏膜完整性的重要指標[29]。肉蓯蓉水提物對小鼠腸道菌群紊亂結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見圖3和表4。

圖3 肉蓯蓉水提物對腸道菌群紊亂結(jié)腸結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 The effect of Cistanche deserticola water extract on the colonic structure of intestinal flora disorder

表4 肉蓯蓉水提物對腸道菌群紊亂結(jié)腸結(jié)構(gòu)的影響Table 4 The effect of Cistanche deserticola water extract on the colonic structure of intestinal flora disorder

由圖3和表4可知，不同試驗組結(jié)腸絨毛形態(tài)有一定的差異。對照組及肉蓯蓉水提物高劑量組結(jié)腸絨毛較長，呈指狀，腸道菌群紊亂模型組及肉蓯蓉水提物低劑量組腸絨毛較短，模型組腸絨毛頂端斷裂。肉蓯蓉水提物高劑量組能夠極顯著提高腸道菌群紊亂小鼠結(jié)腸絨毛高度及V/C值（P<0.01）。與對照組相比其他3組腸絨毛及V/C值減小存在極顯著性差異（P<0.01），模型組與低劑量組與對照組相比隱窩變深存在極顯著差異（P<0.01），高劑量組與空白組隱窩深度無顯著性差異（P>0.05），隱窩深度增加會降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收。絨毛長度大小順序為：對照組>高劑量組>低劑量組>模型組；隱窩深度大小依次為：模型組>低劑量組>高劑量組>對照組；V/C值大小為：對照組>高劑量組>低劑量組>模型組，故肉蓯蓉水提物可調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂小鼠誘發(fā)的腸絨毛變短、隱窩深度增加的現(xiàn)象。這可能由于抗生素誘導腸道菌群紊亂，而使腸黏膜屏障促炎癥信號上調(diào)，誘發(fā)炎癥細胞傳導，引發(fā)腸道炎癥疾病，影響機體代謝。肉蓯蓉水提物通過提高抗炎因子的釋放，降低促炎因子的分泌減緩腸道粘膜的炎性損傷，進而調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂引發(fā)的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變[28]。

3 結(jié)論

肉蓯蓉水提物具有良好的抗氧化作用，DPPH自由基、ABTS+自由基、O2-自由基的IC50值依次為0.225、1.819、12.53 mg/mL。肉蓯蓉水提物在一定濃度下能夠緩解抗生素對小鼠體質(zhì)量下降及對胸腺的生長抑制，能顯著提高腸道菌群紊亂小鼠糞便中雙岐桿菌、乳酸菌的數(shù)量，對腸球菌及大腸桿菌生長有一定抑制作用，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)正常菌群對致病菌群定植的抵抗力。改善腸道菌群紊亂小鼠誘發(fā)的腸絨毛變短、隱窩深度增加現(xiàn)象。由此看出，肉蓯蓉水提物具有一定的抗氧化能力及調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂的作用，為肉蓯蓉開發(fā)產(chǎn)品及其應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。