土壤源孔雀石綠脫色菌的篩選及脫色條件分析

廖華媛，熊夢霞，李潤成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128）

孔雀石綠（Malachite green；MG）是一種三苯甲烷染料，被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，同時(shí)還被作為抗菌劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，直到1993 年被美國食品和藥物管理局（FDA）列為致癌性化學(xué)物［1，2］。但由于MG 的低成本和高效性［3］，其仍被非法使用，并在魚組織和養(yǎng)殖用水中檢測到有MG 殘留［4，5］。此外，MG 擁有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的孔雀石綠，其在環(huán)境中降解周期長，難以根除［6］。因此，如何安全有效地降解環(huán)境中的孔雀石綠成為亟待解決的難題。

一些物理化學(xué)技術(shù)，如吸附、氧化（過氧化氫、臭氧）、電化學(xué)處理已用于去除廢水中的孔雀石綠并取得一定的效果，但存在成本高、效率較低或產(chǎn)生二次污染等問題［7］。而微生物法是目前最安全、有效及普遍的使用方法［8］。目前已報(bào)道的能降解孔雀石綠的細(xì)菌主要有氣單胞菌屬［9］、假單胞菌屬［10］、腸桿菌屬［11，12］及芽孢桿菌屬［13］等。本研究以孔雀石綠為目標(biāo)染料，對11 株不同種的土壤分離菌進(jìn)行篩選，結(jié)果得到了1 株能有效降解高濃度孔雀石綠的菌株，并對其脫色性能及孔雀石綠經(jīng)其降解后對細(xì)菌的毒性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 11 株土壤分離菌均源自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病分子與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。菌株編號及各菌株的16S 測序鑒定情況見表1。

表1 11 株不同種土壤分離菌信息

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L；LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L。

1.1.3 主要試劑及儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海經(jīng)鴻實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；全溫度光照振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司生產(chǎn)；連續(xù)酶標(biāo)波長儀SpectraMax M5，美國Molecular Devices 公司生產(chǎn)；孔雀石綠［（C23H25N2）2·2H2C2O4，相對分子質(zhì)量926.98］為化學(xué)純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 將11 株菌株按1% 接種到3 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，將各菌培養(yǎng)液按OD600nm調(diào)至相同濃度后，各取3 μL 滴在含300 mg/L 孔雀石綠的LB 平板中央，放入37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h。能使含MG 的LB 瓊脂顏色消失或變淡的菌株被認(rèn)為其對孔雀石綠有脫色降解作用［14，15］，并作為下一步研究的目標(biāo)菌株。

1.2.2 目標(biāo)菌株對孔雀石綠脫色降解效能的測定用500 mL 的錐形瓶配制100 mL 分別含300、400、500、600、700、800、900、1 100、1 300 mg/L 孔雀石綠的LB 培養(yǎng)基（pH 7），在染料培養(yǎng)基中按1%（V/V）接種量接入菌株S1-2，于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)，每隔12 h 取500 μL 離心，取上清200 μL 測定OD622nm。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長是否被抑制。

1.2.3 脫色降解處理后MG 溶液對細(xì)菌毒性的檢測 降解處理后MG 溶液對細(xì)菌毒性檢測采用牛津杯法［16］。以在含MG 的LB 平板中不生長的菌株S2-4（解淀粉芽孢桿菌）、A15（壁芽孢桿菌）作為受試菌種。所用細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)12 h，復(fù)蘇后，每個(gè)菌株取100 μL 分別涂布至牛津杯中含100 μL 300 mg/L MG 的LB 平板，及牛津杯中含100 μL 降解處理后MG（試驗(yàn)“1.2.2”中300 mg/L MG 經(jīng)處理后的產(chǎn)物，離心取上清液并過濾除菌）的LB 平板，每個(gè)處理1 次重復(fù)。各接種物37 ℃培養(yǎng)10 h 后測定抑菌圈的直徑（抑菌圈直徑-牛津杯直徑），脫色降解前后孔雀石綠對細(xì)菌的毒性通過抑菌圈的直徑大小反映。

式中，Db為孔雀石綠降解前抑菌圈的直徑；Da為孔雀石綠降解后抑菌圈的直徑。

1.2.4 目標(biāo)菌株發(fā)揮脫色降解MG 作用的條件分析

1）種子菌液的培養(yǎng)。將對MG 具有脫色降解作用的菌株接種于含10 mL LB 液體培養(yǎng)基（pH 7）的50 mL 離心管中，于37 ℃、180 r/min 條件下，培養(yǎng)至OD600nm為0.80～0.90 作為種子菌液。

2）不同接菌量對菌株脫色降解MG 作用的影響。 在10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培養(yǎng)基（pH 7.0）中按0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0% 接菌，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)9 h 后，每隔2 h 取500 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心（8 000 r/min、5 min），取200 μL 上清液，測定OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測定。

3）初始培養(yǎng)液pH 對菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響。用HCl 和NaOH 將10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培養(yǎng)基的初始pH 分別調(diào)為3、4、5、6、7，按1%（V/V）接入目標(biāo)菌株，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)9 h后，每隔2 h 取500 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心，再每孔取200 μL 上清液，測定OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測定。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長是否被抑制。

4）培養(yǎng)溫度對菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響。在10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培養(yǎng)基（pH 7）中按1%（V/V）接種量接入目標(biāo)菌株，分別放置在20、25、30、35、40 ℃，180 r/min 培養(yǎng)9 h 后，每隔2 h取500 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心，取200 μL 上清液測OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測定。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長是否被抑制。

5）鹽濃度對菌株產(chǎn)生脫色降解MG 作用的影響。在10 mL 分別含NaCl 濃度為6、8、10、12、14、16、18 g/L MG（300 mg/L）的LB 培養(yǎng)基中，按1%（V/V）接種目標(biāo)菌株，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)9 h 后，每隔2 h取200 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心，測定OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測定。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長是否被抑制。

6）孔雀石綠脫色降解率的計(jì)算。參照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行孔雀石綠脫色降解率的計(jì)算，取培養(yǎng)液以8 000 r/min 離心5 min，在孔雀石綠最大吸收波長622 nm處測定上清液的吸光度，以相同MG 濃度不接菌的溶液作為對照，取2 個(gè)平行處理的平均值計(jì)算脫色率。以脫色率來表示菌株對孔雀石綠的脫色能力。

式中，A0表示不接菌溶液的吸光度；At表示接菌培養(yǎng)t 時(shí)間后溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 和GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

11 株土壤分離菌在含MG（300 mg/L）的LB 平板中37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h 后觀察，結(jié)果（圖1）表明，陰溝腸桿菌（S1-2）、銅綠假單胞菌（6-1）菌苔周圍MG 脫色明顯，但菌株S1-2 脫色面積更大，因此，確定S1-2 為下一步研究的目標(biāo)菌株。此外，菌株S2-4、A15 在平板中不生長，因此將這2 株菌作為脫色降解處理后MG 溶液對細(xì)菌毒性檢測的受試微生物。

圖1 菌株S1-2、6-1 在孔雀石綠LB 平板中的脫色分解情況

2.2 目標(biāo)菌株對孔雀石綠脫色降解效能的測定

配制MG 初始質(zhì)量濃度300～1 300 mg/L LB 培養(yǎng)基以測定目標(biāo)菌株對MG 的降解效能，各濃度MG 降解結(jié)果見表2、圖2。由表2 可見，菌株S1-2在12 h 內(nèi)對300 mg/L MG 的脫色率為94.19%；在24 h 內(nèi)對400～900 mg/L MG 的脫色率為95.95%～96.80%；36 h 內(nèi) 對1 100 mg/L MG 的 脫 色 率 為96.72%；菌株S1-2 培養(yǎng)至48 h 對1 300 mg/L MG仍無脫色，結(jié)果取10 μL 該組培養(yǎng)液涂布在普通LB平板中，只有少量細(xì)菌生長，說明菌株生長受到明顯抑制。

表2 菌株S1-2 對MG 的脫色率 （單位：%）

圖2 菌株S1-2 降解MG 的顏色變化過程

2.3 孔雀石綠經(jīng)S1-2 菌株脫色后對細(xì)菌毒性的檢測

以在含MG 的LB 平板中不生長的菌株S2-4（解淀粉芽孢桿菌）、A15（壁芽孢桿菌）為受試微生物，抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表3 和圖3。由表3 可知，在牛津杯中加入100 μL MG（300 mg/L），對菌株S2-4、A15 的抑菌圈直徑分別為（22.40±5.00）mm、（21.60±2.20）mm；在牛津杯中加入100 μL 處理后，MG（降解前濃度為300 mg/L）的抑菌圈分別為（10.80±1.90） mm、（9.50±2.00） mm；毒 性 分 別 降 低 了48.21%、43.98%。結(jié)果表明，孔雀石綠經(jīng)菌株S1-2脫色降解處理后，毒性有一定程度的降低。

表3 孔雀石綠脫色后對細(xì)菌生長的抑制作用

圖3 孔雀石綠脫色前后對細(xì)菌的毒性測試結(jié)果

2.4 目標(biāo)菌株發(fā)揮脫色降解MG 作用的條件分析

2.4.1 不同接菌量對菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響 接菌量（0.5%～7.0%）對MG 脫色降解的影響見圖4。由圖4 可知，培養(yǎng)9～15 h，接種量對孔雀石綠脫色的影響較明顯，即接種量與降解率呈負(fù)相關(guān)。9～15 h 內(nèi)，同等培養(yǎng)時(shí)間下，0.5% 接種量的降解體系脫色率最高，達(dá)59.9%～83.89%；培養(yǎng)23 h 后，各接種量的脫色率接近一致，為91.67%～93.91%。

圖4 不同接種量對菌株S1-2 脫色的影響

2.4.2 培養(yǎng)基初始pH 對菌株產(chǎn)生MG 脫色降解作用的影響 將菌株在pH 3～7、含MG 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，pH 對菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響見圖5。培養(yǎng)基初始pH 為3～5 時(shí)，菌株未能產(chǎn)生脫色作用，取10 μL 培養(yǎng)液涂布在普通LB 平板中，結(jié)果僅少量細(xì)菌生長，說明菌株生長受到明顯抑制；當(dāng)pH為6、7 時(shí)，培養(yǎng)23 h 后，菌株對孔雀石綠的脫色率分別為90.02%、94.54%。綜上所述，菌株S1-2 不耐酸，僅在pH 為6、7 時(shí)才能發(fā)揮MG 脫色降解作用。

圖5 培養(yǎng)基初始pH 對菌株S1-2 脫色的影響

2.4.3 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)生脫色降解MG 作用的影響 溫度能影響細(xì)菌的生長代謝，從而影響菌株脫色降解MG 的效率。溫度（20～40 ℃）對菌株S1-2脫色的影響見圖6。 由圖6 可知，當(dāng)溫度為20～35 ℃，培養(yǎng)9～17 h，脫色率隨著溫度的升高而增大，同等培養(yǎng)時(shí)間下，35 ℃時(shí)脫色率達(dá)到最高，為71.26%～92.01%；當(dāng)溫度為40 ℃，培養(yǎng)9～13 h 時(shí)，脫色率在同等培養(yǎng)時(shí)間下較20～35 ℃低，為35.41%～40.05%。脫色體系在20～40 ℃培養(yǎng)23 h 后脫色率為84.61%～94.56%，說明該菌能在較大溫度范圍內(nèi)脫色降解MG。

圖6 培養(yǎng)溫度對菌株S1-2 脫色的影響

2.4.4 鹽濃度對菌株脫色降解MG 的影響 鹽濃度（6～18 g/L）對菌株脫色的影響見圖7。由圖7 可知，MG 降解體系培養(yǎng)19 h，鹽濃度對孔雀石綠降解有明顯影響，鹽濃度與脫色率呈負(fù)相關(guān)，鹽濃度為6～8 g/L 時(shí)，脫色效果最明顯；培養(yǎng)至23 h 時(shí)，各鹽濃度的脫色率接近一致，為91.85%～93.77%，說明該菌具有一定的耐鹽能力。

圖7 鹽濃度對菌株S1-2 脫色的影響

3 小結(jié)與討論

孔雀石綠作為三苯甲烷染料之一，具有高毒、高殘留、致癌和致突變等毒性作用［19］。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)技術(shù)是處理環(huán)境中孔雀石綠的有效方法之一。本研究中篩選得到的陰溝腸桿菌對高濃度孔雀石綠有較強(qiáng)的脫色分解能力，36 h 內(nèi)完全降解1 100 mg/L MG。Du 等［8］在活性污泥中分離到一株假單胞菌屬YB2，在最適pH 及溫度下，24 h 內(nèi)對1 500 mg/L 孔雀石綠的分解率為90.40%，12 h 內(nèi)能完全分解1 000 mg/L 孔雀石綠；Lv 等［17］研究表明，耐輻射球菌R1 能在30 min 中降解97.2% 的200 mg/L MG，但菌株的接種量較大（濕重菌接種量為8.0 g/L），通過比較說明本次篩選得到的菌株S1-2 能降解較高濃度的孔雀石綠。當(dāng)MG 濃度達(dá)1 300 mg/L 時(shí)細(xì)菌被抑制生長，可能是由于MG 本身作為一種抗菌劑，對菌株具有毒性，濃度越高對細(xì)菌的毒害越大。

MG 脫色降解前后對菌株解淀粉芽孢桿菌、壁芽孢桿菌的毒性測試結(jié)果表明，經(jīng)降解后的MG 對敏感菌抑制率降低了43.98%～48.21%。說明菌株陰溝腸桿菌降解孔雀石綠后，脫色降解產(chǎn)物的毒性在一定程度上有所降低［20，21］。

目標(biāo)菌株產(chǎn)生脫色降解MG 的作用條件分析發(fā)現(xiàn)，菌株陰溝腸桿菌接菌量在0.5%～7.0%，接種量與MG 降解率呈負(fù)相關(guān)，推測當(dāng)接種量為0.5%～7.0%時(shí)，接種量越小，單個(gè)細(xì)菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)越多，細(xì)菌繁殖、代謝相對更旺盛，繁殖的代數(shù)也更多，因此低接種量的降解體系在短時(shí)間內(nèi)的MG 降解率較高。

pH 可以通過改變微生物表面的電荷影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也可通過改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響蛋白功能的發(fā)揮［22］，且文獻(xiàn)［23，24］報(bào)道MG 在堿性環(huán)境中易發(fā)生沉淀而退色，本研究預(yù)試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，pH 為10、11 時(shí)，MG 可自動(dòng)出現(xiàn)明顯脫色，因此在研究培養(yǎng)基初始pH 對菌株脫色降解MG 影響時(shí)只設(shè)置了pH 3～7。結(jié)果證明菌株陰溝腸桿菌在pH 3～5 生長受到抑制，在pH 6、7 條件下，培養(yǎng)23 h能脫色降解90.02%～94.54% 的300 mg/L MG，說明該菌不耐酸。

菌株陰溝腸桿菌在20～40 ℃培養(yǎng)23 h，對MG脫色率在84.61% 以上。 文獻(xiàn)［12］中Enterobacter sp. B-20 在25～40 ℃對MG 降解率在75% 以上，而菌株陰溝腸桿菌同為腸桿菌屬，MG 降解體系在20～40 ℃的降解率達(dá)84.61% 以上，相比之下菌株陰溝腸桿菌發(fā)揮作用的溫度范圍更大，說明該菌在溫度跨度較大范圍內(nèi)同樣具有對孔雀石綠脫色降解的能力。

氯化鈉在染織過程中提供的離子作用力能將染料印在待染色的織物上，同時(shí)也能將未與織物結(jié)合的染料釋放到廢水中。菌株陰溝腸桿菌在6～18 g/L NaCl 環(huán)境中，培養(yǎng)23 h 后脫色降解率達(dá)91.85%～93.77%。說明該菌具有一定的耐鹽能力，而對鹽具有一定耐受的菌株在處理染料廢水過程中具有重要作用。

綜上所述，陰溝腸桿菌能脫色降解較高濃度MG，對鹽濃度有一定的耐受性且作用溫度范圍較廣，具有修復(fù)染料廢水的應(yīng)用前景。