豬血凝性腦脊髓炎實驗室診斷方法綜述

張文通，李金祥，魏 鳳，李 峰，沈志強，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.河北孟村回族自治縣農業(yè)農村局，河北 孟村 061400；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬血凝性腦脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE）是由冠狀病毒屬的血凝性腦脊髓炎病毒（Hemagglutinatingenc ephalomyelitis virus, HEV）引起的一種急性、接觸性傳染病[1-2]。主要感染幼豬，以嘔吐、食欲廢絕、便秘、進行性消瘦、腹瀉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征，臨床上也稱之為仔豬嘔吐-消瘦病，病死率高達20%～100%。1958年該病在加拿大的安大略省首次暴發(fā)，此后在世界各主要養(yǎng)豬國家都相繼發(fā)生。我國于1985年在北京郊區(qū)某種豬場首次報道發(fā)生HEV感染。趙傳博等應用血凝抑制試驗（HI）檢測遼寧省部分地區(qū)豬血清中HEV抗體陽性率高達44.0%[3]；劉立卓等應用HI方法對從山東省部分地區(qū)采集的178份豬血清樣品進行了HEV抗體檢測，HI抗體總體陽性率高達61.24%[4]。由此可見該病在養(yǎng)豬場感染很普遍，對養(yǎng)豬業(yè)威脅嚴重，但很多養(yǎng)豬場乃至基層從事養(yǎng)豬科研工作者對該病都很陌生。因此對該病相關實驗室檢測研究進展進行綜述，很有必要。

防治該病的關鍵措施之一是對該病病原的確診。該病在癥狀上與豬偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等相類似，僅憑流行病學調查、臨床及剖檢診斷無法鑒別，確診必須依靠實驗室診斷。自20 世紀50 年代末期首先發(fā)現(xiàn)該病以來，科研工作者對該病實驗室診斷方法進行了大量的研究，取得了顯著成績。文章就該病實驗室診斷方法研究進展進行了如下綜述。

1 病毒分離鑒定

首先采集疑似HEV 感染病豬的腦、脊髓、呼吸道分泌物等組織；將病料組織研磨，反復凍融，過濾除菌處理；接種于長滿單層的易感細胞如豬腎原代細胞單層或甲狀腺單層細胞中進行培養(yǎng)72 h，觀察有無融合細胞出現(xiàn)。如果有HEV 存在，即可在接種后24 h 至48 h 出現(xiàn)融合細胞。最后將分離后的細胞病毒液收集后，反復凍融，透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)應呈典型的 冠狀病毒”。

2 血清學診斷

2.1 血清中和試驗

首先將待檢血清56 ℃ 30 min進行滅活；將PHEV 病毒液與不同稀釋濃度的待測血清按照1:9 均勻混合，37 ℃溫箱孵育1 h；將每個滴度混合后的懸液加入到長滿單層的胎豬腎細胞的試管中；培養(yǎng)72 h后，檢測培養(yǎng)液的雞紅細胞的凝集活性。以此來檢測病毒是否在細胞上增殖。通常把中和抗體的效價1:8或更高，可判為陽性，否則判為陰性。

2.2 血凝抑制試驗

血凝抑制試驗主要用于檢測待檢血清對紅細胞凝集的抑制情況。在此試驗中，通常要設定已知的陰性血清、陽性血清、紅細胞、抗原以及不加抗原的待檢血清作為對照，同時，要在保證各對照孔沒有錯誤的情況下，對結果進行評價和分析；最后以結果中出現(xiàn)完全抑制的血清稀釋倍數(shù)為HI 效價。應用本法檢查被檢血清的紅細胞凝集抑制價在1:40 以上判為陽性。周鐵忠等用HI 檢測遼寧各地區(qū)HEV 感染情況，結果顯示陽性率為49.6%[5]。賀文琦等應用HI 檢測了從吉林省部分地區(qū)采集的豬血清中HEV 抗體，陽性率高達44.3%[6]。HI 方法的建立，對PHEV 的診斷和防治是一種非常實用的技術手段。

2.3 瓊脂擴散試驗

首先制作瓊脂糖平皿，然后分別在中間和周圍打孔（中央孔與周圍孔的間距一般以3 mm 為宜）。在中間的孔中加入抗原，待檢血清、陰性和陽性血清分別加入到周圍孔中；將瓊脂糖平板放置濕盒內，然后將濕盒置于37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察特異性沉淀線。如果抗原與待測血清產生的沉淀曲線與抗原與陽性對照的血清作用產生的沉淀線相融合，則可判斷該待測血清為陽性，不出現(xiàn)線則為陰性。該方法操作簡單，可以用于PHEV 血清抗體的流行病學調查。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）原理是采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定性或定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。其方法簡單，方便訊速，特異性強，敏感度高，已在多個領域得到廣泛應用。

趙傳博等用HEV 的單克隆抗體作為檢測抗體、HEV 的多抗作為捕獲抗體，建立了檢測HEV 的抗原捕獲ELISA 方法，抗原捕獲ELISA 陽性檢出結果與PCR 方法相一致[7]。單長見等以HEV 純化的N 重組蛋白作為包被抗原，建立檢測HEV 血清抗體的間接ELISA 方法，用該法對天津市地區(qū)采集到的200 份豬血清樣品進行檢測，陽性檢出率為83.5%[8]；劉立卓等以純化HEV 為包被原建立檢測HEV 血清抗體的間接ELISA 方法，應用該ELISA 方法對從山東地區(qū)豬血清中隨機抽取的44 份樣品檢測HEV 抗體陽性率為72.73%[4]。

3 分子生物學檢測技術

目前運用于檢測HEV 的分子生物學檢測技術主要是RT-PCR 技術和熒光定量PCR 檢測技術。

RT-PCR 即逆轉錄PCR，是將RNA 的逆轉錄（RT）和cDNA 的聚合酶鏈式擴增反應相結合的技術。RT-PCR 技術優(yōu)點是靈敏，缺點是易被污染。該方法已經(jīng)得到了比較廣泛的應用。常靈竹等根據(jù)GenBank中登錄HEV 的HE 基因和S 基因設計了1 對引物，建立快速檢測HEV的RT-PCR 方法，檢測與HEV 親緣性較高的牛冠狀病毒及豬的偽狂犬病毒均為陰性，最低可以檢測到10個TCID50/100 μL 的病毒，說明該方法的有較好的特異性和敏感性[9]。

熒 光 定 量PCR 是1996 年 由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR 產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。臧德躍等根據(jù)GenBank 中的HEV 的S 蛋白基因保守序列設計合成1 對特異性引物，建立了檢測HEV 的SYBRGreen Ⅰreal-time PCR 方 法；應用該方法對采集的20 份疑似HEV感染病料進行檢測，其中16 份為陽性，而用常規(guī)PCR 檢測同樣的樣品，僅8 份為陽性，由此可見該方法較常規(guī)PCR 方法敏感得多[10]。

HEV 主要侵害1 ～3 周齡乳豬，被感染仔豬發(fā)病率和死亡率都達100%。成豬一般為隱性感染，但可排毒。對發(fā)病仔豬進行HEV 診斷及對成豬隱性帶毒HEV 篩查均依靠HEV 實驗室診斷。文章對HEV實驗室診斷方法研究進展進行了綜述，對開展HEV 綜合防控研究提供了詳實的資料。