黃芪甲苷對系膜增生性腎小球腎炎小鼠腎功能及血清IL-1β和IL-17的影響

梁文林，李 軍，金光明，閆晉升，姚 遠(yuǎn)

(河北燕達(dá)醫(yī)院 中醫(yī)科， 河北 三河 065201)

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是最常見的腎臟病理類型，常見于各種原發(fā)和繼發(fā)性腎小球疾病，且發(fā)病率高[1]。因此，尋找一種有效的藥物改善MsPGN對慢性腎臟疾病的防治具有重要意義。目前，臨床上治療MsPGN的主要藥物是免疫抑制劑，通過免疫調(diào)節(jié)改善腎臟損傷[2]。黃芪甲苷(astragaloside IV，ASIV)是中藥黃芪的活性成分，具有抗感染、抗纖維化、抗氧化、平喘和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3-4]。本研究旨在通過觀察ASIV對MsPGN模型小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變、腎功能以及炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-17的影響，探討ASIV對MsPGN模型小鼠腎臟的保護(hù)作用，為ASIV治療MsPGN疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：ICR清潔級雄性小鼠32只，體質(zhì)量20～40 g，年齡8-10周[浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SYXK(浙)2017-0010]。

1.1.2 實驗藥物：雷公藤多甙片10 mg/片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司)，使用蒸餾水配制成濃度為10 mL/kg，灌胃1次/d，連續(xù)灌胃12周；黃芪甲苷(西安林禾生物技術(shù)有限公司)，20 mL/kg灌胃1次/d，連續(xù)灌胃12周。

1.1.3 實驗試劑：尿蛋白測定試劑盒、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)、無水乙醇、二甲苯和中性樹膠(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、HE染液、分化液和返藍(lán)液(Servicebio公司)、血清胱抑素C(Cys C)檢測試劑盒(上海德波生物技術(shù)有限公司)、小鼠IL-1β和小鼠IL-17 ELISA檢測試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：建立MsPGN模型[5]：尾靜脈注射1 mL/100g 抗胸腺細(xì)胞血清(anti-thymocyte serum，ATS)，1次/周，共注射4次。將32只雄性小鼠隨機分為4組：對照組、模型組、雷公藤多甙片組(陽性藥物組)和ASIV組，每組8只。對照組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃12周；根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]，雷公藤多甙片組每天1 mL/100 g，給予灌胃12周；ASIV組80 mg/(kg·d)給予黃芪甲苷灌胃12周。

1.2.2 生物樣本收集及腎功能檢測：分別于治療前1 d、治療4、8和12周后用代謝籠收集各組小鼠24 h尿液，采用常規(guī)生化法檢測24 h尿蛋白(24 hUP)。并采集小鼠外周血，2 500 r/min離心15 min，取上清，ELISA法檢測各組小鼠血清Cys C的表達(dá)；采用比色法檢測血清β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase，NAG)的含量。

1.2.3 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察：于造模并治療12周后將小鼠麻醉處死后立即分離腎臟，平均分成2份，一份用0.9%氯化鈉溶液漂洗、濾紙、吸干，放入10%中性甲醛溶液中固定48 h，然后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片。病理切片厚度為4 μm。切片后蘇木精、酒精-伊紅染色，中性樹脂封片，鏡下觀察組織形態(tài)及病理改變。

1.2.4 腎組織及血清中炎性細(xì)胞因子檢測：將另一份腎組織置于玻璃勻漿器中，按體質(zhì)量1∶9加入0.9%氯化鈉溶液在冰浴中充分研磨，制成10%腎勻漿，然后5 000 r/min離心20 min取上清，ELISA法檢測各組小鼠腎勻漿及血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-17的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況及24 hUP比較

各組小鼠在實驗期間均未死亡。造模后，對照組小鼠毛色光澤、攝食正常、反應(yīng)靈敏；模型組小鼠均出現(xiàn)全身浮腫及腹水，反應(yīng)遲緩、毛色無光澤，攝食量減少。治療后，模型組小鼠全身浮腫及腹水情況加重，其他情況均未改善；雷公藤多甙片組小鼠毛色無光澤，活動稍顯增加，攝食量也明顯增加；ASIV組小鼠表現(xiàn)較模型組和雷公藤多甙片組稍輕，一般情況均好于其他組小鼠。治療前，與對照組相比，各組小鼠24 hUP均顯著升高(P<0.05)；治療4周后，雷公藤多甙片組和ASIV組小鼠24 hUP無明顯下降；治療8周、12周后，雷公藤多甙片組和ASIV組小鼠24 hUP與模型組相比顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠24 hUP比較Table 1 Comparison of 24 hours UP of mice in each mg/d，n=8)

2.2 各組小鼠腎功能比較

模型組血清Cys C和NAG含量均顯著高于對照組(P<0.05)；治療4、8和12周后，雷公藤多甙片組和ASIV組小鼠血清Cys C和NAG含量與模型組相比均明顯降低(P<0.05)，且隨著治療時間的增加顯著降低(表2)。

表2 各組小鼠血清Cys C、NAG比較Table 2 Comparison of serum Cys C and NAG in each

2.3 各組小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)比較

對照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管壁及系膜區(qū)寬度無異常；模型組小鼠腎小球毛細(xì)血管壁及系膜區(qū)寬度均增厚，且腎小球系膜細(xì)胞增生，并出現(xiàn)不同程度系膜基質(zhì)增多；雷公藤多甙片和ASIV治療后，系膜區(qū)寬度小于模型組，且腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)增多現(xiàn)象明顯減輕(圖1)。

A.control group； B.model group； C.TG group； D.ASIV group圖1 各組MsPGN小鼠腎臟組織病理學(xué)Fig 1 Renal histopathology of MsPGN mice in each group(HE×400)

2.4 各組小鼠炎性細(xì)胞因子比較

模型組血清中IL-1β和IL-17的表達(dá)水平均顯著高于對照組(P<0.05)；雷公藤多甙片組和ASIV治療后，小鼠腎組織勻漿及血清中IL-1β和IL-17的表達(dá)水平較模型組相比顯著降低(P<0.05)。小鼠腎組織勻漿中IL-1β和IL-17的表達(dá)水平與血清中變化趨勢一致(表3,4)。

表3 各組小鼠腎勻漿IL-1β和IL-17比較

Table 3 Comparison of IL-1β and IL-17 in renal homog- enate of mice in each group(±s，n=8)

表3 各組小鼠腎勻漿IL-1β和IL-17比較

indexgroup 12 weeks after treatmentIL-1β/(pg/mL)control78.73±1.99model278.74±9.11?TG107.32±4.17?#ASIV104.77±5.94?#IL-17(pg/mL)control146.29±4.07model319.38±8.52?TG153.57±5.09?#ASIV148.54±6.88?#

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the model group.疾病，占原發(fā)性腎小球疾病的50%。該病是以系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積累為特征[7]，因此系膜細(xì)胞介導(dǎo)的腎小球腎炎是終末期腎病的常見病因。本實驗參考文獻(xiàn)建立MsPGN小鼠模型后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組24 hUP、血清Cys C和NAG含量與對照組相比升高；腎病理形態(tài)學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腎小球毛細(xì)血管壁及系膜區(qū)寬度均增厚，且腎小球系膜細(xì)胞增生，并出現(xiàn)不同程度系膜基質(zhì)增多，提示本實驗復(fù)制MsPGN小鼠模型成功。

表4 各組小鼠血清IL-1β和IL-17比較Table 4 Comparison of serum IL-1β and IL-17 in each

3 討論

系膜增生性腎小球腎炎是中國最常見的腎小球雷公藤多甙由雷公藤提純得到，目前主要被應(yīng)用于治療腎小球腎炎， 其治療機制主要是其能夠抑制腎臟系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生、抑制腎小球毛細(xì)血管壁通透性等，從而減輕腎小球的損傷程度[8]。黃芪甲苷(ASIV)是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，是黃芪發(fā)揮作用的有效成分。本研究發(fā)現(xiàn)，在治療后小鼠24 hUP明顯降低，血清Cys C和NAG含量較模型組相比均降低；腎組織系膜區(qū)寬度減小，且腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)增多現(xiàn)象明顯減輕。提示ASIV能抑制系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增加，對腎臟具有較好的保護(hù)作用。但近年來，由于雷公藤多甙不良反應(yīng)發(fā)生率較高，尤其是對肝膽系統(tǒng)的損害[9]，使得其難以應(yīng)用到臨床治療。目前，黃芪以及臨床藥品黃芪注射液單方和復(fù)方制劑毒理學(xué)研究尚未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性作用[10]。

目前，有研究發(fā)現(xiàn)，MsPGN患者機體存在體液免疫和細(xì)胞免疫的異常[11]。有研究表明，MsPGN模型大鼠的系膜細(xì)胞在激活狀態(tài)下產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子IL-1，刺激腎小球系膜細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腎炎病變的發(fā)展及慢性化過程，最終引起腎小球硬化[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，過量的IL-17可造成腎組織的慢性炎性及免疫反應(yīng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組腎組織勻漿及血清中IL-1β和IL-17的表達(dá)水平顯著升高，提示模型組小鼠體內(nèi)存在炎性反應(yīng)；在治療后腎組織勻漿及血清中IL-1β和IL-17的表達(dá)水平均降低，提示ASIV可能通過抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-17的表達(dá)，減少機體炎性反應(yīng)，從而改善腎臟損傷。

綜上所述，黃芪甲苷能夠調(diào)節(jié)腎功能，抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增加，減輕腎臟損傷，可能與ASIV抑制腎組織炎性反應(yīng)有關(guān)，但具體機制有待進(jìn)一步研究。