溪黃草水提物對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究

葉秋瑩 張黎黎 黃自通 許佳鑫 李元棟 吳泰逸 黃 輝 林冰淇 林妙倩

清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500

1 材料

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 溪黃草(Rabdosia serra (Maxim.) Hara)(湖北金貴中藥，批號(hào)：A180301)、聯(lián)苯雙酯滴丸藥品(廣州白云山星群藥業(yè)，批號(hào)：NF40005)購于陽光大藥房；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重18～22 g，均于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購，小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041。實(shí)驗(yàn)條件溫度保持為20～25 ℃，相對(duì)濕度在40%～70%，飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 溪黃草水提液的制備 稱取6 g的溪黃草，加100 mL水，浸泡1 h，加熱煮沸，煮沸開始計(jì)時(shí)1 h，稍冷，用四層紗布過濾得中藥水煎液①。重復(fù)上述過程，用四層紗布過濾得中藥水煎液②。合并濾液，濃縮至20 mL，得質(zhì)量濃度為 0.6 g/mL(以生藥量計(jì))的藥液，置于 4 ℃冰箱中密封保存[8]。

2.2 動(dòng)物分組造模及給藥 將48只SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組(酒精：52°白酒)、陽性組(藥物：聯(lián)苯雙酯滴丸，200 mg/kg)、溪黃草組(6 g生藥/kg)4組，每組12只。每日空白組、模型組小鼠按0.1 mL/10g給予蒸餾水，陽性組、溪黃草組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃給藥，1次/d，共10 d。每次給藥后1 h，除空白組外的其余各組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃給予52°白酒造模，1次/d，共10 d。

2.3 樣本的采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束末(實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水)，小鼠眼球取血，離心分離血清，-20 ℃ 保存?zhèn)溆?，之后頸椎脫臼處死小鼠，立即摘取肝臟，用預(yù)先冰浴滅菌的生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱取肝臟濕重，攤開進(jìn)行拍照。取剩余部位組織若干塊，分別置10 mL EP管中，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 指標(biāo)觀察及測(cè)定方法

2.4.1 動(dòng)物的日常情況 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠的行為活動(dòng)、攝食、毛發(fā)、飲水及精神狀態(tài)等情況，做好觀察記錄。

2.4.2 肝臟形態(tài)及肝臟指數(shù)的計(jì)算 脫臼處死并解剖小鼠后，肉眼觀察并分析小鼠肝臟的病變情況(包括色澤、形態(tài)等)。

中國城市化進(jìn)程即中國農(nóng)村轉(zhuǎn)化成城市的過程。19世紀(jì)下半葉到20世紀(jì)中后期，中國城鎮(zhèn)化基本處于停滯狀態(tài)；改革開放以后，進(jìn)程加快，最顯著的成就是中國城鎮(zhèn)化水平從1978年的17.92%提升到2016年的57.35%。城鎮(zhèn)化進(jìn)程加快，意味著越來越多的農(nóng)村人口轉(zhuǎn)變?yōu)槌鞘腥丝诨蛘甙氤鞘腥丝?，意味著農(nóng)村人口的生活方式、消費(fèi)方式也逐漸趨向城市居民。代表著先進(jìn)、文明、便利、舒適的城市消費(fèi)文化對(duì)當(dāng)代農(nóng)民，尤其是農(nóng)村青年產(chǎn)生了巨大的吸引力。這種無法抗拒的吸引力也逐漸在農(nóng)村青年的婚姻生活打上了深深的烙印。

2.4.3 生化指標(biāo)的檢測(cè) 取出存于-20 ℃的小鼠血清，梯度解凍，用試劑盒測(cè)試。按照試劑盒操作方法測(cè)定血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛 (MDA)的含量。

3 結(jié)果

3.1 溪黃草水提液對(duì)小鼠體重、肝臟重量、肝臟指數(shù)及一般情況的影響 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)小鼠進(jìn)行一般體征觀察，空白組小鼠在攝食與飲水方面正常，毛色光亮，活動(dòng)正常，其余各組均出現(xiàn)攝食與飲水量略有減少的現(xiàn)象，其中模型組小鼠毛色不光澤，行動(dòng)略遲緩。除了空白組，給予其余各組小鼠52°白酒后，均出現(xiàn)不同程度的醉酒現(xiàn)象：反應(yīng)遲鈍、流涎、四肢癱軟、步履不穩(wěn)、嗜睡等，有部分小鼠出現(xiàn)前爪撓嘴的現(xiàn)象，甚至伴隨呼吸急促。在給予藥物后，陽性對(duì)照組和溪黃草組可逐漸恢復(fù)正常。

與空白組小鼠相比，各組小鼠體重顯著下降(P<0.05)，其中溪黃草組下降最為顯著(P<0.01)；模型組的肝臟重量略有增加，通過肝臟系數(shù)計(jì)算公式得出的，其肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)，表明酒精造成的肝損傷會(huì)使得肝細(xì)胞腫大；與模型組相比，陽性對(duì)照和溪黃草組均顯著降低(P<0.05)，說明兩者藥物均可以緩解小鼠肝臟受損情況。結(jié)果見表1。

表1 溪黃草對(duì)小鼠體重、肝臟重量及肝臟指數(shù)的影響

3.2 肝臟形態(tài)的肉眼觀察 空白組的小鼠肝臟形態(tài)正常，肝色鮮紅，包膜光滑，濕潤，有彈性，且邊緣銳利(小框所示)、質(zhì)韌，無病變現(xiàn)象；模型組的肝臟外觀主要表現(xiàn)為灰黃色點(diǎn)狀壞死灶，肝色暗沉，包膜略光滑，邊緣變鈍(小框所示)，質(zhì)地變軟，易碎，切面略帶油膩感，說明酒精所致小鼠急性肝損傷造摸成功；與模型組比較，陽性對(duì)照組和溪黃草組的病變現(xiàn)像有所改善，肝色偏鮮紅，略濕潤，彈性增加，邊緣組織鈍化不明顯(小框所示)，而且兩組間外觀觀察，無明顯的區(qū)別，說明溪黃草對(duì)急性酒精性肝損傷有一定的改善作用。結(jié)果如圖2所示。

圖2 肉眼觀察小鼠肝臟組織的大體情況

3.3 溪黃草水提取物對(duì)肝臟、血清中肝功能指標(biāo)的影響 與空白對(duì)照組比較，急性酒精性肝損傷小鼠肝臟、血清ALT、AST含量均顯著增加，提示造模成功；與模型組比較，陽性組和溪黃草組的ALT、AST含量顯著降低(P<0.01)，提示溪黃草水提物能改善急性肝損傷的肝功能指標(biāo)水平。結(jié)果見表 2、3。

表2 溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠肝臟組織的ALT、AST水平的影響

表3 溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠血清的ALT、AST水平的影響

3.4 溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠的抗氧化水平的影響 酒精會(huì)在人體的新陳代謝中產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，影響機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致酒精性肝損傷，而體內(nèi)的抗氧化劑會(huì)保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的影響，但這些抗氧化劑的活性很容易被過量的脂質(zhì)過氧化物清除，導(dǎo)致肝臟損傷[9]。與空白組相比，模型組小鼠肝臟、血清中的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均顯著下降，而自由基作用于脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量顯著上升(P<0.01)，這表明酒精引起小鼠肝臟中過氧化物水平的顯著增加，并且抗氧化能力下降，提示造模成功。陽性對(duì)照組、溪黃草組能夠顯著提高ALD小鼠肝臟、血清中GSH-px、SOD的活性(P<0.05)，不同程度地降低MDA的含量(P<0.05)，提示溪黃草水提物能促進(jìn)GSH-px、SOD的活性，有效防止酒精攝入引起的小鼠肝細(xì)胞過度氧化，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，且能不同程度的降低MDA的含量。結(jié)果見表4、5。

表4 溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠肝臟組織的SOD、GSH-px、MDA水平的影響

表5 溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠血清的SOD、GSH-px、MDA水平的影響

4 討論

經(jīng)胃腸道吸收的酒精90%～98%在肝臟中通過乙醇脫氫酶途徑、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)、過氧化氫酶系統(tǒng)這3個(gè)途徑進(jìn)行代謝。在這氧化代謝過程中，產(chǎn)生的大量自由基介導(dǎo)了肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加了體內(nèi)的氧化水平，當(dāng)肝細(xì)胞中的氧化水平超過抗氧化水平時(shí)，就會(huì)破壞肝臟的細(xì)胞膜脂質(zhì)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[10]。ALT、AST是肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志，肝細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞通透性增加，使肝細(xì)胞中的 ALT 與AST進(jìn)入血液進(jìn)而引起血清中ALT 與AST的升高[11]。機(jī)體內(nèi)存在包括 SOD 等酶類及包括還原型谷胱甘肽(GSH-px)等非酶類兩大抗氧化防御體系，以清除氧自由基，阻斷組織過氧化損傷；MDA 是活性氧自由基氧化生物膜過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平的高低與氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損害程度相關(guān)[12-13]。溪黃草唇含有二萜類、黃酮類等重要的有效成分，而二萜類化合物經(jīng)過藥理篩選證實(shí)其具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗炎等多種生物活性，其作用機(jī)制與肝臟線粒體的保護(hù)、肝臟內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控相關(guān)；黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物等藥理活性，對(duì)肝臟損傷有較好的保護(hù)作用[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)溪黃草水提物進(jìn)行了保肝作用及機(jī)制的研究，結(jié)果初步顯示，與空白組比較，模型小鼠體肝臟明顯腫大，血清ALT、AST 水平增加，肝指數(shù)增大，肝組織MDA含量顯著增加，SOD、GSH-px 活性顯著降低，提示模型小鼠肝功能受損且可能存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)也說明造模成功。給予溪黃草水提物進(jìn)行干預(yù)，能有效拮抗模型小鼠肝臟質(zhì)量增加，降低肝組織 MDA 水平，提高 SOD、GSH-px 活性，改善肝腫大；肝組織外觀觀察顯示，溪黃草水提物組小鼠肝臟受損情況改善明顯，可減輕肝臟病變狀態(tài)，逐漸恢復(fù)接近陽性對(duì)照組的肝臟情況。而且溪黃草組小鼠體重顯著減少，由此可以推測(cè)溪黃草通過調(diào)節(jié)機(jī)體氧化酶系統(tǒng)影響了脂肪代謝途徑，這可能是預(yù)防急性肝損誘發(fā)脂肪肝的保護(hù)機(jī)制。因此認(rèn)為溪黃草能抑制肝功能指標(biāo)水平的上升、保護(hù)肝細(xì)胞以及有效改善肝功能，為防治急性酒精性肝損傷的作用機(jī)制之一[16-18]。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)溪黃草水提物可增強(qiáng)GSH-px、SOD活性并阻止酒精引起的MDA升高，從而降低氧化應(yīng)激所引起的肝細(xì)胞損傷，結(jié)果提示，抗氧化作用可能是溪黃草水提物對(duì)ALD小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一。

綜上，溪黃草水提物護(hù)肝機(jī)制主要是通過降低機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制肝功能指標(biāo)水平的增加，改善肝臟病變情況，也將為深入研究其保肝通路機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。