紅鰭東方鲀卵巢與精巢的蛋白質(zhì)組比較分析

李鑫，胡子文，王盛南，仇雪梅，劉鷹、2，王秀利*

(1.大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023; 2.大連海洋大學 設施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023)

紅鰭東方鲀Takifugurubripes隸屬于硬骨魚綱鲀形目鲀科，是一種具有重要經(jīng)濟和食用價值的魚類，也是硬骨魚中研究較多的模式物種，在中國、朝鮮、日本等亞洲地區(qū)均有分布[1]，且有悠久的食用歷史。中國對禁止食用紅鰭東方鲀的解禁，為其養(yǎng)殖及加工業(yè)帶來了巨大的機遇[2-3]，紅鰭東方鲀精巢因不含毒素且味道鮮美，在戰(zhàn)國時期就有“西施乳”的美譽，是一種名貴的傳統(tǒng)美食。由于紅鰭東方鲀性成熟時間較長，且卵巢與精巢發(fā)育不同步，卵巢先于精巢發(fā)育[4-5]，不利于育種工作的開展及其高價值精巢的產(chǎn)出，此外，研究性發(fā)育在物種的進化中具有深遠的意義。目前，對魚類性發(fā)育的研究雖然已經(jīng)鑒定出許多與性別決定和性腺發(fā)育兩個生物學過程[6]相關的基因,包括sox9、dmrt1、gsdf、dax家族、fox家族、抗苗勒管激素基因及其受體基因，而Kamiya等[7]對在紅鰭東方鲀最新的一項研究中也顯示，紅鰭東方鲀的性別很可能是由amhr2的兩個等位基因組合所決定。但是關于紅鰭東方鲀性發(fā)育的研究依然不是很全面，育種方面的難題仍存在，因此，研究紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的過程，縮短其性成熟的時間，有利于促進育種工作的開展，改善養(yǎng)殖模式，進而提高養(yǎng)殖產(chǎn)量。

非標記定量技術(lable-free)是運用質(zhì)譜進行蛋白分析，無須使用穩(wěn)定的同位素化合物來標記蛋白，即通過基于光譜計數(shù)(spectrum counts)類或前體信號強度方法進行蛋白定量[8-9]。光譜計數(shù)類非標記以MS2的鑒定結果作為定量的基礎，各種方法的差別在于后期算法在大規(guī)模數(shù)據(jù)上的修正。而前體信號強度方法適用于高精度質(zhì)譜，以MS1為基礎，計算每個肽段信號在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)上的積分。本研究中采用此方法，使用最新一代的Orbitrap質(zhì)譜儀(Q-Exacitve HF)采集LC-MS/MS數(shù)據(jù)，結合Proteome Discoverer 2.0軟件[10]并基于Sequest算法[11-12]對肽段的指紋譜圖進行概率匹配[13-15]。

本研究中，通過非標記定量技術比較分析3齡紅鰭東方鲀卵巢與精巢的蛋白質(zhì)組，并從基因表達層面上比較這兩個組織成熟時的蛋白差異。通過對組織間差異倍數(shù)高的蛋白進行分析，并運用GO、KEGG分析等富集方法將差異蛋白聚類，從而發(fā)現(xiàn)影響紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的蛋白及生物過程，旨在為紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程及生產(chǎn)實踐應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚于2017年5月采自大連天正有限公司，為養(yǎng)殖的3齡性成熟紅鰭東方鲀健康成魚，體質(zhì)量約2.0 kg，分別隨機選擇性腺質(zhì)量約為30 g的10 尾雌魚卵巢和10 尾雄魚精巢混合置于液氮中，作為卵巢樣品及精巢樣品[16-17]。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取及質(zhì)檢 稱取適量樣本，研磨成粉末，加入蛋白裂解液并進行超聲破碎，然后進行Bradford蛋白定量，檢測兩種組織的蛋白總量，并計算出其相應蛋白濃度。其后進行SDS-PAGE電泳檢驗，發(fā)現(xiàn)兩組織總蛋白在相對分子量15～220 000范圍內(nèi)得到有效分離且無降解，蛋白質(zhì)量足夠，并且蛋白電泳條帶有一定的差異，能夠進行后續(xù)試驗。

1.2.2 質(zhì)譜分析及蛋白注釋 對蛋白還原烷基化，使用Trypsin酶將蛋白酶切成肽段，然后經(jīng)毛細管高效液相色譜分離，根據(jù)肽段的疏水性、離子強度、等電點差異進行分離洗脫后用Q-Exactive HF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。用Sequest HT和Proteome Discoverer 2.0軟件在數(shù)據(jù)庫Uniprot-takifugu rubripes.fasta(去除了uncharacteried protein)進行搜庫定性及定量分析，并獲得蛋白對應的UniProt ID。

1.2.3 差異表達蛋白富集

1)差異倍數(shù)分析。對映射到注釋蛋白的肽段進行計數(shù)，在1.5差異倍數(shù)(FC=fold change)閾值條件下，進行卵巢與精巢組織的差異蛋白篩選。FC≥1.5為上調(diào)(up)，F(xiàn)C≤0.667為下調(diào)(down)，0.667

2)GO注釋。為了確定和比較這些差異蛋白的功能，使用基因本體(Gene Ontology，GO)術語(term)對其進行注釋，這些術語描述涵蓋了3個主要領域，即發(fā)揮的分子功能(Molecular function)、所屬的細胞組分(Cellular component)和參與的生物過程(Biological process)[18]。對差異表達蛋白進行GO富集分析(http://www. geneontology.org)，對基因產(chǎn)物進行富集，可避免單個蛋白注釋的不同造成的冗余等問題，其能夠概括差異蛋白在活細胞中的特殊作用[19]。

3)KEGG注釋。在生物體內(nèi)，不同蛋白相互協(xié)調(diào)使得生物體正常運轉(zhuǎn)，基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路(Pathway)可進行蛋白通路網(wǎng)絡的分析，有助于更進一步了解其生物學功能[20]，以確定蛋白參與的最主要生化代謝通路和信號轉(zhuǎn)導通路。使用KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)確定差異表達蛋白的生物學通路。

4)富集分析及COG分析。通過對應蛋白UniProt ID檢索GO及KEGG數(shù)據(jù)庫獲得對應蛋白的GO注釋及KEGG注釋。GO富集分析及KEGG富集分析則使用R語言軟件基于超幾何分布計算出各數(shù)據(jù)庫對應功能分類中差異蛋白與全部表達蛋白的顯著性(P值)。用UniProt數(shù)據(jù)庫對所鑒定出的差異表達蛋白進行蛋白聚類(Cluster of orthologous groups of proteins，COG)，預測差異蛋白可能的功能并對其做功能分類統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 蛋白鑒定及肽段質(zhì)量

利用非標記定量質(zhì)譜分析，在卵巢與精巢兩個組織共獲得了5 463個肽段，其中，鑒定出855個蛋白，搜庫時將RAW文件通過Proteome Discoverer提交至 Sequest HT服務器，蛋白鑒定結果過濾參數(shù)為Peptide FDR≤0.01[14,21-22]。由于組織中獲取的肽段過長或過短都無法在質(zhì)譜儀中被檢測到，因此，鑒定結果中如果肽段普遍過低或過高，則可能是蛋白酶選用不恰當，獲得的結果不佳。本次鑒定的肽段長度集中于8～21 個氨基酸，長度適合。圖1是不同蛋白鑒定所用的肽段數(shù)，一個肽段鑒定出的蛋白低于總鑒定蛋白數(shù)的三分之一，所以鑒定結果較好。

2.2 差異表達蛋白

在卵巢和精巢兩種組織之間發(fā)現(xiàn)共有的蛋白561 個，并且有150 個蛋白為卵巢組織所特有，132個蛋白為精巢組織所特有，并篩選出了172 個在卵巢中上調(diào)表達的差異蛋白及161 個在精巢中上調(diào)表達的蛋白。差異蛋白包括組織特異性蛋白及差異表達蛋白共615 個。篩選出卵巢與精巢蛋白表達量差異倍數(shù)超過10倍的蛋白如表1所示，其中卵巢有15個蛋白表達較高，推測均為堿性蛋白；而精巢有9 個蛋白表達較高，其大多為酸性蛋白。

表1 卵巢與精巢間表達量差異倍數(shù)超過10倍的蛋白

1)差異倍數(shù)分析。在卵巢組織中較精巢差異倍數(shù)最高的蛋白為ELAVL2(HUR)，其次為FRUYP1。在精巢中差異倍數(shù)最大的為β-微管蛋白(Uniprot ID：H2RTP9)，并且在精巢中還有3個微管蛋白較卵巢差異倍數(shù)大。這些在組織間差異倍數(shù)較大的蛋白，可能是引起兩組織分化或維持組織特異功能的功能蛋白，也可能是伴隨這些組織間的功能蛋白使其發(fā)揮功能的蛋白。而同組織差異蛋白之間的關聯(lián)可能顯示出性發(fā)育的某個生物過程。這表明ELAVL2、FRUYP1蛋白可能與卵巢發(fā)育相關。而精巢上高表達蛋白為微管蛋白，由于α、β-微管蛋白是組成鞭毛的基本單位[23]，故此高表達的微管蛋白可能與精子鞭毛的形成相關。

2)蛋白互作分析。通過蛋白互作網(wǎng)絡預測分析網(wǎng)站(https://string-db.org/)，使用STRING 11.0對卵巢及精巢組織中特有的蛋白分別進行網(wǎng)絡預測，設置最低蛋白互作置信值為 0.7，使用k-means聚類方法分別聚成5類。將組織特異蛋白的Uniprot ID輸入STRING，卵巢特異蛋白有132個，其中有124個可被識別，而在精巢中的150個蛋白中，則有136個能夠被STRING注釋。

在卵巢中蛋白有效聚集為4類(見電子版附錄A圖A1)：第一類與翻譯相關，包括核糖體蛋白L36A(RPL36A)、核糖體蛋白L19(ENSTRUG-00000011841)、核糖體蛋白L27(RPL27)、核糖體蛋白L36(RPL36)、核糖體蛋白L15(RPL15)、核糖體蛋白L7A(RPL7A)、核糖體蛋白S24(RPS24)、過量位點蛋白1(SURF1)、延伸因子-1α(ENSTRUG00000009006)和核糖體蛋白S26(RPS26)；第二類與rRNA和tRNA加工相關，包括核糖體合成蛋白BOP1(BOP1)、tRNA(鳥嘌呤-N(7))-甲基轉(zhuǎn)移酶非催化亞基WDR4(WDR4)、核仁蛋白(PES1)、N-乙?；D(zhuǎn)移酶(NAT10)、類tRNA-二氫尿苷合酶3(DUS3L)和聚合酶(RNA)Ⅲ(DNA引導)肽A(POLR3A)；第三類與氧化磷酸化相關，包括NADH脫氫酶5(ND5)、細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ(COX3)、NADH脫氫酶[泛醌] 1亞基C2(NDUFC2)和泛醌-細胞色素C還原酶鐵硫蛋白亞基1(ENSTRUG00000015996)；第四類與DNA復制相關，包括微小染色體維持蛋白4(MCM4)、核糖核酸酶H2亞基A(RNASEH2A)、DNA聚合酶δ亞基1(POLD1)和DNA修復蛋白REV1(REV1)。

在精巢中蛋白也有效聚集為4類(見電子版附錄A圖A2)：第一類與嘌呤代謝相關，包括腺苷酸激酶同工酶6(AK6)、GMP還原酶(ENSTRUG00000001414)、腺苷單磷酸脫氨酶3a(AMPD3)、腺苷琥珀酸合成酶(ENSTRUG- 00000003001)和胞質(zhì)5’-核苷酸酶3A(NT5C3A)；第二類與甘油磷脂代謝相關，包括溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶β(ENSTRUG00000018530)、二酰甘油激酶α(ENSTRUG00000015424)、二?；视图っ?(DGKE)和磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(ENSTRUG00000014429)；第三類與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關降解蛋白1(DERL1)、NADPH細胞色素P450氧化還原酶(POR)和網(wǎng)狀蛋白4(RTN4)；第四類與氧化磷酸化相關，包括ATP合酶偶聯(lián)因子6(ATP5J)、細胞色素C氧化酶蛋白6A2(ENSTRUG00000007689)和泛醌-細胞色素C還原酶鐵硫蛋白亞基1(ENSTRUG00000006531)。此外，在精巢中還發(fā)現(xiàn)，與性發(fā)育相關的特異性表達蛋白GSDF(Uniprot ID：A0A0H4LUC3)及POR(Uniprot ID：H2T154 )。

2.3 差異表達蛋白的富集

2.3.1 GO分析

1)生物過程(Biological process)。對差異蛋白進行GO分析，其中有591 個差異蛋白具有GO注釋。在生物過程中，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(GO:0035556)所富集的差異蛋白在兩組織中均較多，翻譯(GO:0006412)、細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(GO:0006886)和翻譯預啟動復合體的形成(GO:0001731)等在卵巢組織中的差異蛋白較多，而蛋白水解參與細胞蛋白分解代謝過程(GO:0051603)、ATP合成耦合質(zhì)子運輸(GO:0015986)及ATP水解耦合質(zhì)子運輸(GO:0015991)等在精巢組織中富集的差異蛋白較多，因此,卵巢組織主要發(fā)生蛋白合成過程，而精巢組織則發(fā)生水解過程，這與卵細胞及精子的形成過程相符，并伴隨著不同的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(圖2)。

2)細胞組分(Cellular component)。在細胞組分中，卵巢組織中較多的差異蛋白發(fā)生在細胞質(zhì)(GO:0005737)、細胞核(GO:0005634)、細胞溶質(zhì)大核糖體亞基(GO:0022625)、細胞溶質(zhì)小核糖體亞基(GO:0022627)及外被蛋白I(COP I)囊泡層(GO:0030126)上，COP I囊泡層主要介導蛋白從高爾基體運回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，包括從反面高爾基體運向順面高爾基體，以及將蛋白從反面高爾基體運回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而在精巢組織中差異蛋白較多發(fā)生在膜組成部分(GO:0016021)，卵巢組織差異蛋白富集較多的細胞組分與蛋白合成有關，精巢組織可能與精子形成有關(圖3)。

3)分子功能(Molecular function)。在分子功能中，ATP結合(GO:0005524)及金屬離子結合(GO:0046872)所富集的差異蛋白在兩組織中均較多，卵巢組織中富集較多的差異蛋白發(fā)揮RNA結合(GO:0003723)、核糖體的結構成分(GO:0003735)等功能，而在精巢組織中差異蛋白具有蘇氨酸型內(nèi)肽酶活性(GO:0004298)(圖4)。這表明，兩種性腺組織中發(fā)生了非?；钴S且不同的能量代謝，并伴隨著不同的酶促反應，其中卵巢組織中RNA結合不僅與蛋白的合成相關，還可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關。

對GO術語中顯著富集的差異蛋白與該術語中所有鑒定到的全部蛋白相比較，進行GO功能顯著性富集分析，以P≤0.05為閾值，滿足此條件的GO 術語定義為在差異蛋白中顯著富集，結果如圖5所示，其中轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0016740)在兩組織之間差異最顯著(P=0.00072)，其次為磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0016773)及蛋白激酶活性(GO:0004672)。

2.3.2 KEGG通路分析 對差異蛋白進行KEGG通路分析顯示，僅有126 個差異蛋白富集到KEGG通路上。確定差異蛋白參與的最主要生化代謝通路和信號轉(zhuǎn)導通路為核糖體(Ribosome)、吞噬體(Phagosome)、亨廷頓氏病(Huntington’s disease)等，其中,核糖體通路中差異蛋白最多(見電子版附錄A圖A3)。核糖體通路中注釋到的蛋白如圖6所示，該通路在兩組之間的差異可從GO富集分析中反映出來，其大部分差異蛋白發(fā)生在卵巢。而吞噬體通路有10個差異蛋白，其中7個差異蛋白在精巢中高表達或特有，這些富集大量差異蛋白的通路有可能是引起組織差異的某些生物過程。

同樣對通路進行顯著性富集分析，并與該通路所鑒定到的全部蛋白相比較，篩選在差異蛋白中顯著性富集的通路。通過通路顯著性富集能確定兩組織之間差異最顯著的生化代謝通路和信號轉(zhuǎn)導通路，差異蛋白KEGG富集結果如圖7所示，其中溶酶體(Lysosome)在兩組織之間差異最大，其次為霍亂弧菌感染(Vibriocholeraeinfection)、鞘脂信號通路(Sphingolipid signaling pathway)，但這些通路在組織中均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3.3 COG分析 對所鑒定出的雌雄性腺差異表達蛋白進行COG分析，通過搜索與UniProt關聯(lián)的KOG數(shù)據(jù)庫預測功能并分類，其中，搜索到291 個差異蛋白，并相應地獲得了25 個類別(圖8)。其中出現(xiàn)頻數(shù)最高的差異蛋白類型為[O]翻譯后修飾、蛋白周轉(zhuǎn)、伴侶蛋白(38 個，占13.06%)，其次是[C]能量釋放和轉(zhuǎn)換(27 個，占9.28%)、[U]細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸(27 個，占9.28%)，這表明，COG分析結果與GO、KEGG分析結果相吻合。

2.4 與轉(zhuǎn)錄組的比較

在與同為3齡的紅鰭東方鲀卵巢與精巢轉(zhuǎn)錄組[24]相比，在轉(zhuǎn)錄組中顯著差異表達的wnt、fgf、dmrt、gdf家族基因，在蛋白質(zhì)組中只發(fā)現(xiàn)fgf3基因有表達，但在組織間無顯著性差異。這可能是由于轉(zhuǎn)錄和翻譯不同步或被轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)造成的。

其他被認為與性發(fā)育有關的基因包括sry、sox、amh、dmy、dax、fox、amhr、cyp450、piwi、jnk，在紅鰭東方鲀成熟卵巢及精巢蛋白質(zhì)組中均未發(fā)現(xiàn)它們的表達產(chǎn)物。造成這種情況的原因可能是由于本研究中使用的組織為3齡魚的成熟性腺，不屬于早期發(fā)育，也可能是其蛋白在組織間豐度低于Q-Exactive HF-質(zhì)譜儀檢測方法的靈敏度。

3 討論

3.1 卵巢、精巢組織中的關鍵差異蛋白

3.1.1 卵巢組織中的關鍵蛋白 本研究中紅鰭東方鲀在卵巢組織中差異表達最高的蛋白為ELAVL2，ELAVL2是一種RNA結合蛋白[24-25]，其與人類[26]、小鼠Musmusculus[25]等多個物種性發(fā)育相關，其家族基因已被應用于尼羅羅非魚Oreochromisniloticus[27]、斑馬魚Daniorerio[28]的性腺發(fā)育研究中。Kato等[25]最新研究表明，RNA結合蛋白ELAVL2和DDX6對小鼠卵巢原始卵泡的形成至關重要，敲除ELAVL2的雌性小鼠不育。 ELAVL2與編碼P顆粒(參與RNA衰變和存儲的胞質(zhì)RNP顆粒)成分的mRNA關聯(lián)，并通過在原始卵泡形成之前促進DDX6在卵母細胞中的翻譯來指導P顆粒的組裝。本研究中卵巢高表達的RNA helicase(O57652)與DDX6(表1)同為RNA解旋酶，在紅鰭東方鲀中ELAVL2與RNA helicase可能發(fā)揮著與小鼠中類似的作用。

Vindry等[29]使用人源HEK293細胞，用免疫共沉淀、免疫熒光與RNAi耦合的方法，證明DDX6、LSM蛋白與Pat1b基因的mRNA有效且特異性地相互作用，并且這種結合不受RNase處理的影響，PAT1 RNA結合蛋白是細胞質(zhì)5′mRNA至3′mRNA衰變的關鍵參與者，在P顆粒中所富含，敲除Pat1b基因的小鼠，卵母細胞會發(fā)育缺陷[30]。由此推測，本研究中紅鰭東方鲀卵巢高表達的LSM4蛋白(表1)可能參與卵巢成熟的過程。

FRUYP1(Q90WH2)有Y盒結合的功能，與小鼠中MSY2蛋白功能類似，Medvedev等[31]對小鼠卵母細胞的研究表明，MSY2是一種生殖細胞特異的RNA結合蛋白，與調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性有關，MSY2蛋白對發(fā)育至關重要，Msy2基因缺失的雌性小鼠不育。本研究中，將高表達的FRUYP1與MSY2(NP_058571.2)蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，兩蛋白都包含69 個氨基酸的CSP(Cold shock protein，冷休克蛋白)保守結構域，兩蛋白該結構域有97.10%的一致性，由此推測，F(xiàn)RUYP1蛋白可能影響著紅鰭東方鲀卵巢的發(fā)育。

3.1.2 精巢組織中的關鍵蛋白 本研究中，在精巢組織中微管蛋白(TUBB4A、TUBA3C、TUBB5、TUBB6)表達量較大(表1)，而由α-和β-微管蛋白的異二聚體排列成的微管是組成鞭毛的基本單位[23]，對精子的運動由鞭毛驅(qū)動。Cao等[32]對人類運動能力弱的精子和正常精子尾部的蛋白表達譜比較顯示，微管蛋白-2B(TUBB2B)是差異表達的蛋白之一，且在正常精子中含量較多，影響其運動性。因此,這種組織間的差異與精巢中大量精子的形成有關。

紅鰭東方鲀精巢中特異性表達的蛋白GSDF(性腺體細胞衍生因子，Gonadal soma derived factor)，其基因則被認為是魚類性別決定及分化密切相關的重要基因[33]，Shibata等[34]在青鳉Oryziaslatipes上通過實時定量PCR及原位雜交證實了gsdf基因在精巢初期表達而在卵巢中表達非常低，本研究中從蛋白層面證實了這點，在精巢中具有而在卵巢中不具有。

同樣在紅鰭東方鲀精巢中特異表達的POR蛋白(又稱CYP或CYPOR)亦與性腺發(fā)育相關。POR在人類研究中可為將雄激素代謝為雌激素的CYP19A1提供能量[16]。Fenske等[35]對斑馬魚的研究發(fā)現(xiàn)，在性腺分化期抑制CYP19A蛋白表達會使其雄性化，雖然CYP19蛋白在其他魚類性腺有表達[36]，然而本試驗中并未發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物，可能是在性成熟階段表達較低造成的。

綜上所述，本研究差異蛋白中ELAVL2、RNA helicase、LSM4、FRUYP1與卵巢發(fā)育相關，其中ELAVL2、RNA helicase、LSM4可能共同發(fā)揮作用，而這些蛋白都是通過作用于mRNA在轉(zhuǎn)錄后層面影響卵巢發(fā)育，為后續(xù)紅鰭東方鲀卵巢發(fā)育研究做出鋪墊。而在精巢中則找出了幾種可能組成精子鞭毛的微管蛋白，并且發(fā)現(xiàn)與精巢發(fā)育相關的GSDF蛋白。

3.2 關鍵蛋白的生物學聚類

3.2.1 GO分析 本研究中GO富集分析表明，卵巢中差異表達蛋白與精巢相比主要分布在細胞膜、細胞核部分，分子功能除了發(fā)揮能量代謝及酶促反應，還有RNA結合(包含ELAVL2蛋白、FRUYP1蛋白)及組成核糖體的結構成分的功能，卵巢組織主要進行有關蛋白合成的生物過程，這些過程與卵細胞發(fā)育及生殖質(zhì)調(diào)節(jié)相關。而在精巢中差異表達蛋白與卵巢相比主要分布于膜組成部分，差異蛋白發(fā)揮不同于卵巢的能量代謝及酶促反應，其中蘇氨酸型內(nèi)肽酶活性較活躍，進行有關細胞蛋白分解代謝及ATP合成及運輸?shù)纳镞^程，與精子成熟相關。

3.2.2 KEGG通路 本研究中KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白最多的是核糖體通路，核糖體的不同大小亞基被認為與控制mRNA的機制相關[37]。其中，精巢中上調(diào)表達的核糖體蛋白L10A被證實與性別發(fā)育有關，蝦和果蠅中發(fā)現(xiàn)的該核糖體蛋白在卵子發(fā)生中起作用，果蠅缺失l10a基因可引起卵腔周圍的卵泡細胞丟失[38]。因此，卵巢和精巢兩組織核糖體通路的差異可能是引起組織差異的原因之一。而在一項人工合成的孕激素(DDG)對斑馬魚的慢性影響研究中，使用微陣列分析確定了精巢中與精子發(fā)生有關的基因同樣富集到吞噬體、溶酶體和鞘脂代謝通路，這些通路可能與精子成熟相關[32]。

綜上所述，本研究中利用GO和KEGG富集分析法能夠概括差異蛋白在細胞中的作用，卵巢中發(fā)生有利于卵細胞發(fā)育的核糖體通路，而精巢中發(fā)生則有利于精子成熟的吞噬體、溶酶體和鞘脂代謝通路，這些結果可為性腺發(fā)育的研究提供一定參考。

4 結論

1)本研究中，對紅鰭東方鲀卵巢與精巢組織利用Lable-free蛋白質(zhì)組學技術進行分析發(fā)現(xiàn)，有172個卵巢高表達蛋白和161個精巢高表達蛋白，其中卵巢高表達蛋白ELAVL2、RNA helicase、LSM4、FRUYP1與卵巢發(fā)育相關，而精巢高表達蛋白微管蛋白與精子鞭毛的形成相關，精巢特異性蛋白GSDF與精巢發(fā)育相關。

2)GO富集分析表明，卵巢中差異表達蛋白與卵細胞發(fā)育及生殖質(zhì)調(diào)節(jié)相關，而精巢差異蛋白參與精子的分化過程。

3)KEGG通路分析表明，核糖體通路可能與性腺發(fā)育相關，其中核糖體蛋白L10A被證實與性別發(fā)育相關，而吞噬體、溶酶體和鞘脂代謝通路可能與精子成熟有關。