小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定方法比較與分析

王韋崗，項(xiàng)厚生，吳海峰，李 丹，陸 源

(1 江蘇國測檢測技術(shù)有限公司，江蘇 昆山 215300； 2 鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,江蘇 鎮(zhèn)江 212132)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素，是鐮刀菌屬禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等的次級代謝產(chǎn)物，是一種常見的真菌毒素，其廣泛存在于小麥、大麥、玉米等糧食作物中[1-2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對谷物的污染率和污染水平居鐮刀菌毒素之首，是各國重點(diǎn)控制的真菌毒素之一[3]，主要原因是谷物在田間受到禾谷鐮刀菌等真菌侵染，導(dǎo)致小麥發(fā)生赤霉病和玉米穗腐病，在適宜的氣溫和濕度等條件下繁殖并產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對動物和人均有一定毒性，長期大量攝入含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的食品會抑制蛋白質(zhì)的合成，造成嘔吐、腹瀉、厭食、惡心、神經(jīng)紊亂等毒性效應(yīng)[4]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的性質(zhì)十分穩(wěn)定，烘焙、高溫、高壓等食品加工方法對它的影響很小，120 ℃的高溫仍然不能使其降解，加堿或高壓處理才可破壞部分毒素[5-6]。為減少脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對人類的危害，目前很多地區(qū)和國家都制訂了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)來限制糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定谷物及其制品(玉米、玉米面(渣、片)、大麥、小麥、麥片、小麥粉)中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為1000 μg/kg[7]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]等。酶聯(lián)免疫方法通常用于快速篩查，該方法受樣品基質(zhì)干擾較大，容易出現(xiàn)假陽性；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器昂貴，不易于推廣；高效液相色譜法具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，廣泛用于真菌毒素的測定分析。本文以小麥粉為待測樣品，分別采用直接浸提法、固相萃取柱法和免疫親和柱法對小麥粉樣品進(jìn)行前處理，采用高效液相色譜法測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，并對這3種前處理方法進(jìn)行了比較分析。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

甲醇(色譜純)，默克公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、鹽酸均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇(相對分子質(zhì)量8000)，Sigma-Aldrich；乙腈中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱(60 mg/3 mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱(柱容量≥1500 ng)，北京康源泰博生物科技有限公司；小麥粉中嘔吐毒素定量分析質(zhì)控樣品，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價中心；PBS緩沖鹽溶液：稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、 0.2 g氯化鉀，用900 mL水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.0，用水定容至1000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；WH-2微型漩渦混合儀，江蘇省興化市分析儀器廠；TG16臺式低速自動平衡離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；GH-800DTS超生波清洗機(jī)，北京國環(huán)高科自動化技術(shù)研究院；SBEQ-CG1416固相萃取真空裝置，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；PS-DCY氮吹儀，常州普森電子儀器廠。

1.3 儀器分析條件

色譜柱：CNW Athena C18-WP (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇:水=20:80；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣體積：50 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：218 nm。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入1 g聚乙二醇，準(zhǔn)確加水25 mL，旋渦振蕩提取5 min，4000 r/min離心5 min后將上清液過濾至25 mL具塞比色管中，準(zhǔn)確吸取10 mL濾液待凈化或測定。

1.4.2 免疫親和柱凈化

將低溫保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將1.4.1的10 mL濾液全部轉(zhuǎn)移至免疫親和柱中，控制樣液以每秒1～2滴的流速通過免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入免疫親和柱。用3 mL PBS緩沖鹽溶液和3 mL水先后淋洗免疫親和柱，控制淋洗液以每秒1～2滴的流速通過免疫親和柱，棄去全部流出液，抽干小柱。

加入2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，控制洗脫液以每秒1～2滴的流速通過免疫親和柱，收集全部洗脫液至5 mL燒杯中，在60 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑瑴?zhǔn)確加入1.0 mL水，超聲30 s溶解殘留物，0.45 μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.4.3 固相萃取柱凈化

分別用3 mL甲醇和3 mL水活化HLB固相萃取柱，將1.4.1的10 mL濾液全部轉(zhuǎn)移至HLB固相萃取柱中，控制流速為每秒1～2滴。用3 mL水、1 mL 5%甲醇-水溶液依次淋洗HLB固相萃取柱，抽干小柱。用4 mL甲醇洗脫HLB固相萃取柱，收集全部洗脫液至5 mL燒杯中，在60 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，?zhǔn)確加入1.0 mL水，超聲30 s溶解殘留物，0.45 μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定及線性關(guān)系

準(zhǔn)確吸取一定體積的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋成濃度為0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL和5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照上述色譜條件對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以樣品峰面積Y(mAU)對質(zhì)量濃度X(μg/mL)作圖，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的線性回歸方程為Y=1.1266X-0.0016，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999，結(jié)果表明，采用外標(biāo)峰面積法定量，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖見圖1。當(dāng)信噪比(S/N)為3:1時，該方法的檢出限(limits of detection，LOD)為50 μg/kg。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖

2.2 凈化柱性能測試

在對小麥粉樣品測定之前，先采用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別測試HLB固相萃取柱和免疫親和柱對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的回收率。測試方法如下：準(zhǔn)確吸取一定體積脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋至10 mL，配制成濃度為0.10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待凈化；然后分別按照1.4.2和1.4.3的方法對上述10 mL待凈化液進(jìn)行凈化、濃縮，復(fù)溶并定容至1 mL，過濾膜后進(jìn)樣測定。測試結(jié)果表明，HLB固相萃取柱和免疫親和柱對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均具有較好的回收率，其中HLB固相萃取柱的回收率為92.34%；免疫親和柱的回收率為90.51%。

2.3 溶劑對測定結(jié)果的影響

采用液相色譜法測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時，溶劑是影響測定結(jié)果的重要因素。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在乙酸乙酯中具有較好的穩(wěn)定性，因此有些廠商采用乙酸乙酯配制脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，然而采用液相色譜法測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時，乙酸乙酯在此測定條件下也能出峰，其響應(yīng)值要遠(yuǎn)大于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，從而容易引起誤判和干擾。

除了乙酸乙酯會干擾脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定，溶劑效應(yīng)是干擾測定的另一因素。甲醇、乙腈也是配制脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的常用溶劑，然而采用這兩種溶劑對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋時，溶劑效應(yīng)非常明顯。當(dāng)采用甲醇或者乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液時，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的色譜峰會出現(xiàn)鼓包、雙峰或者響應(yīng)值變低等現(xiàn)象。因此采用液相色譜法測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時，建議用純水為溶劑稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時采用固相萃取柱或者免疫親和柱凈化、濃縮后，用純水進(jìn)行復(fù)溶。

2.4 樣品前處理方法對色譜圖的影響

以市售小麥粉為待測樣品，按照上述色譜條件，分別對1.4.1的樣品浸提液、1.4.2和1.4.3的凈化液進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖2～圖4。從圖2中可以看出，采用樣品浸提液進(jìn)行測定時，色譜圖中雜質(zhì)組分的響應(yīng)值較大，響應(yīng)值高達(dá)400 mAU，而樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的響應(yīng)值小于10 mAU，雜質(zhì)組分與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的保留時間接近，從而雜質(zhì)組分對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定有很大的干擾，不利于定性和定量。小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量值為1000 μg/kg，當(dāng)樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量達(dá)到限量值時，按照1.4.1方法處理后的浸提液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量僅為0.20 μg/mL，此時色譜峰響應(yīng)值較小，在雜質(zhì)組分的干擾下容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。圖3是浸提液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后測定的色譜圖，經(jīng)過HLB固相萃取柱凈化后，雜質(zhì)組分減少，雜質(zhì)組分的響應(yīng)值明顯降低，但是色譜圖的基線噪音較大，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇保留時間附近仍有一些小雜峰，對色譜峰的積分產(chǎn)生影響，增加淋洗液體積后，雜質(zhì)組分干擾現(xiàn)象消失。圖4是浸提液經(jīng)免疫親和柱凈化后測定的色譜圖，免疫親和柱凈化的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)[15]：將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特異性抗體結(jié)合在免疫親和柱內(nèi)的凝膠上，當(dāng)含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的浸提液經(jīng)過免疫親和柱時，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在免疫親和柱內(nèi)與抗體結(jié)合，然后用溶劑洗滌免疫親和柱，除去柱內(nèi)未被結(jié)合的其他雜質(zhì)，最后再用甲醇破壞抗原抗體的結(jié)合，將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇洗脫下來，從而達(dá)到富集和凈化的效果。從圖4中可以看出，經(jīng)過免疫親和柱凈化后，雜質(zhì)組分明顯減少，基線噪音變小，同時，經(jīng)過免疫親和柱的富集和洗脫液的濃縮作用，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的響應(yīng)值變大，方法的檢出限變小。測定結(jié)果表明，本次測定的市售小麥粉中檢出了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，其含量約為430 μg/kg，符合GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定的限量要求。

圖2 浸提液直接測定樣品色譜圖

圖3 固相萃取柱凈化后樣品色譜圖

圖4 免疫親和柱凈化后樣品色譜圖

2.5 樣品前處理方法對回收率和精密度的影響

稱取一定質(zhì)量的市售小麥粉9份，分3組，分別加入低、中、高濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4.1、1.4.2和1.4.3的方法進(jìn)行前處理和測定，同時，對加標(biāo)樣品重復(fù)測定6次，考察不同前處理方法對回收率和精密度的影響。測定結(jié)果表明，當(dāng)采用浸提液直接進(jìn)行測定時，由于雜質(zhì)組分的干擾，低濃度加標(biāo)樣品的回收率和測定結(jié)果的精密度均較差，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)大于10%，影響樣品定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；HLB固相萃取柱和免疫親和柱凈化后可以去除浸提液中大部分雜質(zhì)組分，消除雜質(zhì)組分對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定的影響，從而提高樣品的回收率和測定結(jié)果的精密度。由于免疫親和柱對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇具有特異性吸附的作用，因此采用該柱凈化后的樣品更為干凈，不同濃度加標(biāo)樣品的測定結(jié)果均具有很好的精密度，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.8%～2.4%之間。然而，采用免疫親和柱對浸提液進(jìn)行凈化時，加標(biāo)樣品的回收率又會受到柱容量的影響。當(dāng)小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的添加量為1000 μg/kg時，加標(biāo)樣品浸提液經(jīng)免疫親和柱凈化后回收率下降至54.9%。免疫親和柱柱容量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該免疫親和柱的柱容量約為2000 ng，加標(biāo)樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量已經(jīng)超過了免疫親和柱的柱容量，從而導(dǎo)致吸附過載，回收率下降。過免疫親和柱時，將該加標(biāo)樣品的上樣量減少至2 mL，重新測定后免疫親和柱的回收率為91.3%。

表1 3種方法處理樣品的回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 樣品前處理方法對測定結(jié)果的影響

采用不同前處理方法對小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇定量分析質(zhì)控樣品進(jìn)行處理和測定，質(zhì)控樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的特征值為1336.9 μg/kg，特征值區(qū)間為943.6～1730.2 μg/kg。為避免免疫親和柱的柱容量出現(xiàn)過載，質(zhì)控樣品的稱樣量為1 g，測定結(jié)果表明，采用浸提液直接測定時，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇保留時間附近出現(xiàn)干擾峰，雜質(zhì)組分干擾了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的定性與定量；固相萃取柱法和免疫親和柱法凈化后干擾組分消失，測定結(jié)果分別為1155.13 μg/kg和1205.39 μg/kg，在特性值區(qū)間范圍內(nèi)。以特性值1336.9 μg/kg為標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算回收率分別為86.40%和90.16%，小麥粉樣品經(jīng)免疫親和柱凈化后脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的回收率略高于HLB固相萃取柱凈化后測定的結(jié)果，同時也進(jìn)一步證明這兩種前處理方法能夠適用于小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定。

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的分析方法，比較了3種前處理方法對測定結(jié)果的影響。3種前處理方法相比較，各有優(yōu)缺點(diǎn)。直接浸提法雖然操作簡便，成本低廉，但是容易受到樣品中雜質(zhì)組分干擾，樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量較低時回收率和精密度均較差；固相萃取柱法能夠去除浸提液中的大部分雜質(zhì)組分，同時具有富集和濃縮的作用，測定結(jié)果穩(wěn)定，精密度高，低、中、高不同濃度加標(biāo)樣品的回收率均在85%以上；免疫親和柱法與固相萃取柱法相比，具有更好的選擇性、專一性和凈化效果，該方法受樣品基體干擾影響最小，但是免疫親和柱價格稍高，且具有專一性，使用時容易受到柱容量的影響。