優(yōu)化鯽魚多肽提取工藝及其抗氧化能力的研究*

董倍余，張敏娟，黃曉霞，劉潤(rùn)錦，吳功慶,3

(1 廣東藥科大學(xué)，廣東 中山 528458；2 河南地礦職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部 河南 鄭州 450000； 3 廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 中山 528458)

近年來，水產(chǎn)源活性多肽的分離和純化技術(shù)越來越成熟，科研人員發(fā)現(xiàn)大量魚類含有抗氧化活性多肽，如羅非魚魚皮多肽[1]、鰱魚魚肉[2]、沙丁魚[3]等。魚類富含蛋白質(zhì)分子，魚皮中的蛋白質(zhì)含量更是高達(dá)70%，蛋白質(zhì)酶解得到多肽，可見魚類是生物多肽極好的來源。

除了抗氧化功能以外，多肽還具有許多的作用，例如劉思聰研究發(fā)現(xiàn)毛蚶多肽能抗腫瘤[4]；新吉樂發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽能回復(fù)線粒體的正常功能，清除細(xì)胞內(nèi)堆積的過氧化物，抑制細(xì)胞額凋亡途徑，從而預(yù)防帕金森病[5]；內(nèi)皮抑制素能抑制血管增生，從而起到抗腫瘤、抗類風(fēng)濕病的作用，Xu等[6]根據(jù)內(nèi)皮素的功能片段研制出多肽HM-3，可見多肽具有很大的開發(fā)空間。

鯽魚是我國(guó)重要的水產(chǎn)品之一，養(yǎng)殖規(guī)模大、養(yǎng)殖成本低，帶來了很高的經(jīng)濟(jì)效益。雖然我國(guó)是淡水魚養(yǎng)殖大國(guó)，但是淡水魚加工程度不夠，大多都是鮮銷，利潤(rùn)有限[7]。因此促進(jìn)淡水魚深加工，提高淡水魚附加價(jià)值，提高經(jīng)濟(jì)效益，是未來的研究方面。

本文通過酶解法，探究了木瓜蛋白酶在加酶量、溫度、酶解時(shí)間三個(gè)方面對(duì)鯽魚蛋白的酶解影響，同時(shí)對(duì)比了鯽魚多肽與抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除作用來研究鯽魚多肽的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)鯽魚多肽具有很好的抗氧化能力。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與設(shè)備

鯽魚購于中山市市場(chǎng)(鮮活)，去骨取肉，用純水清洗干凈后，吸干水分，將魚肉置于絞肉機(jī)中攪碎成肉糜，置于-4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：木瓜蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；抗壞血酸，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；無水乙醇、過硫酸鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠。

主要設(shè)備：721N分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；GZX-9240MBE恒溫培養(yǎng)箱、JA5003N千分之一天平，上海市佑科儀器儀表有限公司。

1.2 鯽魚酶解液的制備流程

取一定量鯽魚肉糜，按比例加入水和酶，調(diào)節(jié)pH；反應(yīng)一段時(shí)間后滅酶、離心，取上清液，即為粗活性肽。

1.3 優(yōu)化多肽提取工藝

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

鯽魚多肽酶解過程中主要影響因素有加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度等。為了考察各因素對(duì)多肽酶解效果的影響，以加酶量(0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%)、酶解時(shí)間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、酶解溫度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)作為考察因素，以DPPH自由基清除率作為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 響應(yīng)面法確定最佳提取條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取加酶量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)三個(gè)因素，以DPPH自由基半數(shù)消除率IC50值作為指標(biāo)(Y)，對(duì)鯽魚多肽酶解工藝條件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，確定最佳酶解條件。

1.4 分析方法

1.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]有改動(dòng)：將2 mL樣品溶液和2 mL 2 mmol/L DPPH溶液加入具塞試管中，搖勻，放置30 min，以無水乙醇為參比，測(cè)定吸光度為Ai；DPPH溶液和無水乙醇混合液的吸光度為Ac；樣品和無水乙醇混合液的吸光度為Aj。測(cè)定波長(zhǎng)517 nm。

(1)

1.4.2 ABTS自由基的清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]有改動(dòng)：將配好備用的7 mmol/L的ABTS溶液和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液，以ABTS溶液：K2S2O8溶液2:1的比例混合均勻。在使用前，用超純水稀釋，吸取0.70 mL，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，定容。樣品加以上儲(chǔ)備液避光反應(yīng)20 min，在734 nm處測(cè)吸光度。

(2)

式中：A1為樣品溶液和ABTS儲(chǔ)備液的吸光度值，A2為僅加樣品溶液不加ABTS儲(chǔ)備液的吸光度值，A0為僅加ABTS儲(chǔ)備液不加樣品溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱取4 g鯽魚肉糜，置于燒杯中，加入12 mL蒸餾水，再加入0.9%木瓜蛋白酶，攪勻，在起初的水平面做標(biāo)記，然后分別置于45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃中酶解1 h。然后將酶解液置于100 ℃水浴15 min，將殘留的酶滅活后，補(bǔ)水至起初做好標(biāo)記的水平面，置于離心管中，4500 rpm離心15 min，取上清液，為粗活性肽。按1.4.1方法測(cè)定DPPH自由基清除效果重復(fù)3次，取平均值。溫度的影響如圖1所示，隨著溫度的升高，粗活性肽的抗氧化能力逐步上升，溫度55 ℃，抗氧化能力最佳，然后開始緩慢下滑。溫度太高，酶活性降低，不利于鯽魚多肽的酶解。

圖1 酶解溫度對(duì)消除率的影響

同理，分別加入0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%的木瓜蛋白酶，攪勻，然后置于55 ℃中酶解1 h，研究加酶量對(duì)粗活性肽抗氧化能力的影響(見圖2)。加酶量從0.3%到0.9%，清除率增加，加酶量大于0.9%，清除率反而降低。

圖2 加酶量對(duì)消除率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)消除率的影

固定加入0.9%木瓜蛋白酶，置于55 ℃中分別酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，研究酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響。結(jié)果如圖3所示，酶解時(shí)間越久，粗活性肽的抗氧化能力越高，3 h以后，抗氧化能力下降，酶解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使水分蒸發(fā)，還會(huì)降低多肽活性。

2.2 響應(yīng)面法確定最佳提取條件

結(jié)合上述單因素分析結(jié)果，以上面3個(gè)因素為自變量，以DPPH半數(shù)清除率(Y)為響應(yīng)值， 具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用 Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，多元回歸擬合分析得到IC50與各因素變量的二次方程模型為：

IC50=4.00-0.25A-0.06B+0.28C-0.75AB+0.37AC-0.24BC-0.49A2-0.46B2-1.17C2

對(duì)表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差分析結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面二次模型方差分析

由表2可知，Prob>F的值小于0.05，說明該二次方程高度顯著，從回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還可以看出方程的失擬項(xiàng)較小，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好、誤差小。根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，最佳的提取條件是：加酶量0.77%、酶解時(shí)間3.32 h、溫度為55.95 ℃，IC50預(yù)測(cè)值為4.05 mg/mL，修正為加酶量0.80%、酶解時(shí)間3.5 h、溫度為56 ℃，IC50實(shí)測(cè)值為4.06 mg/mL，說明數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化多肽提取工藝結(jié)果可靠。

圖4、圖5、圖6直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖4～圖6可知，溫度對(duì)多肽消除DPPH自由基的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線相對(duì)較陡；其次為加酶量，表現(xiàn)為曲線相對(duì)平滑；最后是酶解時(shí)間，曲線更平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

圖4 時(shí)間與加酶量的交互作用

圖5 溫度與加酶量的交互作用

圖6 溫度與時(shí)間的交互作用

2.3 酶解液抗氧化能力測(cè)定

2.3.1 DPPH自由基消除能力

由圖7可知，抗壞血酸對(duì)DPPH清除能力極強(qiáng)，基本維持在95%左右，說明抗壞血酸的抗氧化能力極強(qiáng)。而鯽魚多肽的抗氧化能力隨著濃度的升高而升高，鯽魚多肽濃度為0.2 mg/mL時(shí)，DPPH清除只有35.3%；當(dāng)鯽魚多肽濃度為1.0 mg/mL時(shí)，清除率高達(dá)83.5%，鯽魚多肽的抗氧化能力在一定范圍內(nèi)與濃度成正比，且高濃度條件下抗氧化能力較強(qiáng)。

圖7 鯽魚多肽與VC消除DPPH自由基能力對(duì)比

2.3.2 ABTS自由基清除能力

由圖8可知，兩者抗氧化能力能隨著濃度增大而增強(qiáng)，且存在在比較穩(wěn)定的差距。當(dāng)酶解液濃度為0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS的清除率也達(dá)到了56.8%，說明對(duì)鯽魚多肽ABTS也有一定清除能力，但是相比DPPH，清除率相對(duì)低一些。

圖8 鯽魚多肽與VC消除ABTS自由基能力對(duì)比

3 結(jié) 論

采用木瓜蛋白酶酶解鯽魚的提取工藝最適條件為加酶量0.8%、酶解時(shí)間3.5 h、溫度為56 ℃，在此條件下得到的IC50為4.06 mg/mL。提取工藝簡(jiǎn)單、快捷，具有可推廣性。在一定條件下，鯽魚多肽隨著濃度的增大，對(duì)DPPH和ATBS的清除效率越大。通過與抗壞血酸對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鯽魚多肽對(duì)DPPH有較好的清除率，但是對(duì)ABTS清除率稍差，整體來看，鯽魚多肽抗氧化能力較強(qiáng)。鯽魚多肽可以用作食品添加劑、抗氧化劑等，為提高鯽魚經(jīng)濟(jì)效益提供了科學(xué)依據(jù)。