磁光復(fù)合納米藥物載體的制備及表征綜合型教學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)踐

李曉舟，王 林, 帥 琪，龔 寧

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

應(yīng)用型人才培養(yǎng)是高等教育的主要任務(wù)[1]， 而實(shí)踐能力和創(chuàng)新精神是評(píng)價(jià)人才的重要指標(biāo)[2]。實(shí)踐教學(xué)是本科教學(xué)中體現(xiàn)實(shí)踐能力獲取、創(chuàng)新精神培養(yǎng)、綜合素質(zhì)提升的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]，在整個(gè)教學(xué)體系中具有極其重要的地位，其教學(xué)效果直接影響高等教育的人才培養(yǎng)質(zhì)量。設(shè)計(jì)并開(kāi)設(shè)研究型綜合實(shí)驗(yàn)，用以激發(fā)學(xué)生的求知欲望和創(chuàng)新思維，提高學(xué)生分析和解決問(wèn)題的能力，是促進(jìn)實(shí)踐人才培養(yǎng)以及推動(dòng)學(xué)科發(fā)展的有效舉措[4]，既能滿足實(shí)踐教學(xué)的要求，又符合培養(yǎng)應(yīng)用型人才的教學(xué)目的。

納米藥物載體的設(shè)計(jì)是當(dāng)今科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-6]，本文結(jié)合本學(xué)院的專(zhuān)業(yè)特色，設(shè)計(jì)了磁光復(fù)合型納米藥物載體的制備及表征綜合型實(shí)驗(yàn)。通過(guò)具體的實(shí)踐操作及對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的討論分析，使學(xué)生學(xué)習(xí)納米材料的合成技術(shù)和表征手段，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究思維以及運(yùn)用理論知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題的能力。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

當(dāng)前，納米藥物傳輸系統(tǒng)在癌癥治療領(lǐng)域備受關(guān)注[7-8]。磁性納米顆粒，如Fe3O4納米粒與藥物復(fù)合可阻斷腫瘤血管生成、促使腫瘤組織缺血壞死、防止癌細(xì)胞擴(kuò)散，還可以通過(guò)磁共振成像跟蹤藥物輸送過(guò)程及其在生物體內(nèi)的分布。此外，在交變磁場(chǎng)的作用下，超順磁性的納米粒子吸收能量產(chǎn)生熱能，可以具有熱療功能[9-10]。

為防止Fe3O4化學(xué)氧化而對(duì)組織產(chǎn)生不良影響，可以用化學(xué)惰性和生物相容性的 SiO2微球[11]包覆Fe3O4，制備核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@SiO2復(fù)合納米粒。再以異硫氰熒光素標(biāo)記的聚乙烯亞胺聚合物（FITC-PEI）和生物大分子硫酸軟骨素（CS）為制膜單元，利用層狀組裝技術(shù)在Fe3O4@SiO2微球表面沉積FITC-PEI/CS多層膜， 可制備磁光復(fù)合型 Fe3O4@SiO2@(FITCPAHD/CS)4載體微球。熒光分子異硫氰熒光素的修飾，可賦予載體微球熒光性能，便于利用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)載體微球在體內(nèi)的移動(dòng)。另外，利用微球表面聚合物多層膜的溶脹性質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物小分子的裝載及控制釋放。實(shí)驗(yàn)總體方案如圖1 所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

本實(shí)驗(yàn)的目的為：

（1）學(xué)習(xí)Fe3O4和核殼結(jié)構(gòu)Fe3O4@SiO2納米粒子的制備方法；

（2）學(xué)習(xí)用層狀組裝技術(shù)制備超分子薄膜材料；

（3）掌握磁性納米材料的基本表征方法；

（4）學(xué)習(xí)用數(shù)學(xué)模型擬合藥物釋放行為，并從動(dòng)力學(xué)角度分析釋藥機(jī)理。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑包括：FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水、鹽酸、氫氧化鈉、正硅酸乙酯（TEOS）、無(wú)水乙醇、檸檬酸鈉、硫酸軟骨素（chondroitin sulphate，簡(jiǎn)稱(chēng)CS，重均分子量Mw100 000～200 000）、聚乙烯亞胺（poly ethylene imine，簡(jiǎn)稱(chēng)PEI，重均分子量Mw 為25 000）、異硫氰根熒光素（FITC）等，均為分析純，以及布洛芬（純度98.0%）、透析帶（截流分子量為8 000～12 000）、高純氮?dú)夂腿ルx子水。

實(shí)驗(yàn)儀器包括：日本島津公司AUY220 型電子天平，上海精科公司雷磁PHS-3C 型pH 計(jì)，日本島津公司UV-1800 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司RF-5301PC 型熒光分光光度計(jì)，MPMS-XL 超導(dǎo)量子干涉磁力儀，TGL-16 型高速離心機(jī)，三頸瓶，移液器，恒壓漏斗，離心管，石英片（規(guī)格：1 cm×2 cm）。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟與方法

1.4.1 Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

利用共水解法制備 Fe3O4納米粒子[12-13]。 向100.0 mL 的三頸瓶中加入50.0 mL 去離子水（使用前通入高純氮?dú)?0 min 以上，去除水中溶解的氧）和3.5 mL 氨水。稱(chēng)取0.010 0 g FeCl2·4H2O 置于離心管中，移取5.0 mL、0.02 mol·L-1的FeCl3·6H2O (用0.1 mol·L-1的鹽酸配制) 溶液加入離心管，輕輕搖晃至FeCl2·4H2O 完全溶解，迅速將混合液倒入三頸瓶中制得Fe3O4納米粒子（以Fe3O4分子為基本單元，物質(zhì)的量為0.05 mmol），反應(yīng)過(guò)程中，始終向溶液通入高純氮?dú)?，防止Fe2+氧化。將Fe3O4@SiO2水溶膠在磁場(chǎng)下分離，將所得到的固體微粒用乙醇洗3 次，再溶于8 mL 乙醇中備用。

將上步制得的Fe3O4納米粒子水洗并磁分離兩次后，用25.0 mL 除氧去離子水溶解，用1 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)其pH 值小于6，得到A 溶液。稱(chēng)取2.250 0 g 檸檬酸鈉（SC），用25.0 mL 除氧去離子水溶解，得到B 溶液。然后將A 溶液和B 溶液混合，加熱至90 ℃左右，氮?dú)怙柡拖路磻?yīng)30 min，可得SC-Fe3O4溶液（以Fe3O4分子為基本單元，濃度為1.0 μmol·mL-1）。

向150.0 mL 三頸瓶中順序加入26.0 mL 除氧去離子水、20.0 mL 無(wú)水乙醇、2.8 mL 氨水、10.0 mL SC-Fe3O4溶液，攪拌使溶液混合均勻。量取0.5 mL正硅酸乙酯、44.5 mL 無(wú)水乙醇加入恒壓漏斗中混合均勻，將混合液逐滴加入三頸瓶中，全部滴完后，將三頸瓶中的混合液在常溫下繼續(xù)反應(yīng)6 h。

1.4.2 FITC 標(biāo)記PEI

移取 20 μL FITC 的二甲基亞礬 DMSO 溶液（ 0.1 mmol·L-1） 加 入 到 10.0 mL PEI 水 溶 液（5.0 mg·mL-1）中，避光攪拌24 h 使之完全反應(yīng)，透析3 次，每次30 min，以除去DMSO 和未反應(yīng)的FITC，將獲得的FITC-PEI 溶液稀釋至50.0 mL（PEI 的濃度為1 mg·mL-1），避光保存。

1.4.3 Fe3O4@SiO2@FITC-PEI/CS 載體微球的制備

分別取制得的 Fe3O4@SiO2的乙醇溶液0.5 mL 于三個(gè)離心管中，水洗并離心分離兩次，分別加入3.0 mL FITC-PEI（1 mg·L-1，pH=10.0）溶液，20 min 后離心分離，水洗并離心分離兩次，再分別加入3.0 mL CS（1 mg·L-1，pH=10.0）溶液，20 min 后離心分離，水洗并離心分離兩次。再重復(fù)上述薄膜沉積程序3 次，即可得Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球。

1.4.4 Fe3O4@SiO2@FITC-PEI/CS 負(fù)載與釋放布洛芬

將Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球水洗并離心后，浸泡在3.0 mL 的布洛芬（約10 mmol·L-1，用1 mmol·L-1的鹽酸和NaOH 調(diào)節(jié)其pH 為7.0）水溶液中，吸附2 h 后離心分離，可獲得載藥微球。

將裝載了布洛芬的微球浸泡在3.0 mL 0.9%的生理鹽水（pH=7.4）中，使微球裝載的藥物分子通過(guò)離子交換和擴(kuò)散作用從載體中釋放出來(lái)，每隔一段時(shí)間更換生理鹽水，以保證釋放條件相同。監(jiān)測(cè)生理鹽水在 220 nm 處的吸光度值，利用布洛芬在0.9%生理鹽水中的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算從載體中釋放的布洛芬的量。1.4.5 布洛芬標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取50.0 mg·L-1的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 于25.00 mL 的容量瓶中，用生理鹽水定容，搖勻。以生理鹽水為參比，用石英比色皿在220 nm 處測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，繪制吸光度與布洛芬濃度的關(guān)系曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 測(cè)試與表征

（1）利用超導(dǎo)量子干涉磁力儀測(cè)試Fe3O4納米粒子及Fe3O4@SiO2微粒的磁性。利用磁鐵測(cè)試Fe3O4、Fe3O4@SiO2及Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球在水溶液中的磁響應(yīng)性。

（ 2 ） 利用掃描電子顯微鏡， 觀察 Fe3O4和Fe3O4@SiO2微粒的形狀及尺寸。

（3）以石英片為基底，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，監(jiān)測(cè)FITC-PEI/CS 薄膜的沉積過(guò)程。

（4）在200～800 nm 范圍內(nèi)，掃描Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

（5）利用熒光顯微鏡觀察Fe3O4@SiO2@(FITCPEI/CS)4載體微球的熒光現(xiàn)象。

（6）利用透射電子顯微鏡，觀察Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球的形貌及尺寸。

1.6 結(jié)果與討論

（1）根據(jù)表征結(jié)果，比較 Fe3O4納米粒子和Fe3O4@SiO2微粒的磁性大小，討論SiO2殼層對(duì)Fe3O4納米粒子磁性的影響；對(duì)比研究Fe3O4納米粒子、Fe3O4@SiO2微粒及Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球在水溶液中對(duì)磁場(chǎng)的響應(yīng)性及再分散性。

（2）根據(jù)熒光光譜和熒光顯微鏡的表征結(jié)果，討論Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4微球的熒光性能，推測(cè)其能否實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的熒光追蹤。

（3）觀察分析電鏡測(cè)試照片，統(tǒng)計(jì)Fe3O4納米粒子、Fe3O4@SiO2微粒及Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球的尺寸分布，解釋說(shuō)明三種微粒的形狀及形貌。

（4）根據(jù)藥物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制布洛芬釋放動(dòng)力學(xué)曲線，討論其釋放行為，嘗試用模型擬合。

2 實(shí)踐結(jié)果

將所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)以大學(xué)生科創(chuàng)實(shí)驗(yàn)的形式進(jìn)行了初步實(shí)施，旨在檢驗(yàn)其可行性。實(shí)施結(jié)果表明，學(xué)生能夠按照設(shè)計(jì)方案順利完成全部實(shí)驗(yàn)，并取得了如下實(shí)踐成果：

（1）學(xué)生分別利用Fe(II)氧化法、Fe(III)還原法和共水解法制備了Fe3O4粒子。證明了共水解法可制備在水中高度分散、納米尺度的Fe3O4粒子，電鏡結(jié)果表明，此法制得的Fe3O4粒子的平均尺寸在6 nm 左右。

（2）用檸檬酸修飾Fe3O4粒子，再用SiO2包裹，制備出了核殼結(jié)構(gòu)、生物相容性的Fe3O4@ SiO2微粒。電鏡測(cè)試表明，該微粒為球形，尺寸均一，約為360 nm。

（3）將熒光分子FITC 標(biāo)記到PEI 聚合物上，并利用層層組裝技術(shù)，在Fe3O4@ SiO2微球表面沉積了4 個(gè)周期的FITC-PEI/CS 薄膜，制備出了磁光復(fù)合型載體微球Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4。從透射電鏡照片可以清晰看到微球表面的聚合物膜層，聚合物薄膜的修飾使載體微球的尺寸比Fe3O4@SiO2微球有小幅增加。

（4）分光光度分析證明，所制備的載體微球可以裝載布洛芬藥物小分子，并且所裝載的布洛芬小分子可在生理鹽水中長(zhǎng)效釋放。通過(guò)繪制釋放動(dòng)力學(xué)曲線和擬合模型，可推測(cè)藥物從載體中釋放的主要原因是，微球表面聚合物膜的溶脹及離子交換作用，而擴(kuò)散決定了藥物的釋放行為。

（5）利用超導(dǎo)量子干涉磁力儀、熒光分光光度計(jì)、熒光顯微鏡等儀器對(duì)Fe3O4、Fe3O4@ SiO2和Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4微球進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，這些納米微粒均具有超順磁性及優(yōu)異的磁響應(yīng)性，F(xiàn)e3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4載體微球擁有FITC 的特征吸收峰和熒光發(fā)射峰, 可利用熒光顯微鏡方便地進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

“磁光復(fù)合納米藥物載體的制備及表征” 這一科研型實(shí)驗(yàn)，包含了無(wú)機(jī)合成方法、有機(jī)反應(yīng)、超分子層層組裝技術(shù)、動(dòng)力學(xué)研究以及各種分析表征方法的使用，體現(xiàn)了多學(xué)科交叉融合的特征，適用于培養(yǎng)學(xué)生的綜合實(shí)踐能力及創(chuàng)新思維。實(shí)踐結(jié)果驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的合理性、可行性，學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容表現(xiàn)出極高的興趣，因此可將該科研型實(shí)驗(yàn)引入本科綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。