西班牙河碳酸鹽巖對茶園土壤狀況和土壤細菌群落的影響

趙 茜，施龍清，黃世勇，丁魯平，Liette Vasseur，楊 廣*

（1. 閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室/福建農(nóng)林大學應用生態(tài)研究所，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實驗室，福建 福州 350002；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部閩臺作物有害生物綜合治理重點實驗室，福建 福州350002；4. 害蟲綠色防控福建省高等學校重點實驗室，福建 福州 350002；5. 福建省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所，福建 福州 350019；6. 武夷山市種子站，福建 武夷山 354300；7. 博萊生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，北京 100000；8. 加拿大布魯克大學生物科學系，安大略 圣凱瑟琳斯 L2S3A1）

0 引言

【研究意義】福建省是中國烏龍茶之鄉(xiāng)，是名茶鐵觀音、武夷巖茶的發(fā)源地，位居中國重點產(chǎn)茶省份之首。土壤作為茶樹生長賴以生存的營養(yǎng)來源，其酸化程度對茶樹的生長及茶葉的品質有重要影響。然而，目前福建省土壤pH 值適宜茶樹生長的茶園比例還不足15%，pH 值在4.5 以下的茶園占比87%[1]，茶園土壤酸化成為影響茶樹生長、茶葉品質的關鍵因素。土壤酸化不僅造成鈣離子、錳離子、鉀離子等大量流失，大大降低土壤磷、鉬和硼的有效性，致使土壤肥力顯著下降[1?2]，而且可導致重金屬元素的活化[3]，重金屬在土壤中的不斷積累，最終可通過茶葉危害人類健康，成為茶葉質量安全的主要限制因素[4?6]。除此之外，土壤酸化還會減少土壤中有益微生物的活性和數(shù)量，進而影響土壤中碳、氮、硫、磷等的循環(huán)[3]，導致茶樹根的發(fā)育受阻，阻止養(yǎng)分的吸收[7]，最終影響茶樹生長和茶葉品質。因此，有效緩解茶園土壤酸化進程，對提高茶葉品質和發(fā)展茶葉質量安全生產(chǎn)等具有重要的意義。【前人研究進展】茶樹屬于喜酸植物，但是由于長期施肥不合理以及茶樹特性[2]，導致我國茶園土壤酸化程度日益嚴重。土壤酸化可帶來一系列問題，首先是土壤重金屬的活化[8]；茶園土壤酸度降低會導致土壤吸附重金屬離子的能力降低，從而活化重金屬，使重金屬溶解性、移動性和有效性增加[9]。目前，我國農(nóng)田重金屬污染主要分為5 種健康風險元素，包括Cd、As、Hg、Pb 和Cr；以及3 種生態(tài)風險元素，包括Ni、Cu 和Zn[10]。鑒于茶園重金屬污染主要暴露途徑是通過茶葉對人體健康造成損害，因此茶園重金屬污染主要檢測上述5 種健康風險元素，其中更以Cd 為主[10]。鐘曉蘭等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，土壤酸性增加能增強土壤活性態(tài)Cd 的含量，且隨著pH 的降低，Cd 活化能力增高，土壤Cd 含量越高。其次，茶園土壤酸化可導致土壤有益微生物的活性降低和菌落組成減少[8,12]。茶園微生物具有固氮、解磷、釋鉀、分解有機物和保持土壤保濕性等作用，可以有效調(diào)節(jié)茶園生態(tài)，促進茶的芽萌發(fā)，影響茶樹次生代謝。除此之外，還可以幫助合成茶葉特殊的芳香物質，對茶樹生長、茶葉品質提高具有積極的影響[12?13]。然而，隨著近年來茶園集約化的高強度生產(chǎn)，福建省茶園土壤酸化呈加重趨勢。因此，為了有效遏制土壤酸化、確保農(nóng)產(chǎn)品的食品安全生產(chǎn)，需要找到快速、有效遏制的防治策略。西班牙河碳酸鹽巖（Spanish river carbonatite, SRC）作為酸性土壤調(diào)理劑、草碳堆肥和礦物肥料，具有堿性強，微量元素高、有害元素低等優(yōu)勢，已在加拿大、俄羅斯等國家應用[14?15]。在我國，SRC 已證明可以顯著改良蔬菜種植土壤的酸性，例如，陳云峰等[15]采用大田和室內(nèi)試驗證明SRC 對種植小白菜的土壤酸性具有明顯的改良效果?！颈狙芯壳腥朦c】然而，SRC 對于茶園土壤酸化的改良效果還未可知，其在茶園的相關應用調(diào)查還未見報道?！緮M解決的關鍵問題】為驗證SRC 在茶園土壤改良方面的應用潛力，采用盆栽和大田試驗分別驗證SRC 對土壤酸性、土壤重金屬及土壤微生物的影響，測定土壤pH 值、重金屬含量、并利用高通量測序技術檢測微生物群落結構，評估SRC 對茶園土壤理化性質改良和修復的情況，以有效減緩茶園土壤酸化進程，保障茶園可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 室內(nèi)試驗設計

室內(nèi)試驗所用土壤為紅壤，取自福建農(nóng)林大學南區(qū)茶園溫室土壤，pH 6.13。本研究在不施化肥條件下進行。新鮮土壤粉碎，去除枯枝落葉等雜質后，過3 cm 篩子備用。取7 份土壤，其中3 份土壤（每份土壤重量不少于200 g）進行微生物多樣性檢測，并測定pH 值及8 種重金屬（Cd、Pb、Cr、Cu 和Zn、Ni、Hg、As）的含量[CK（2017）]。本研究所用的碳酸鹽巖由博萊生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，主要成分 SiO224.6%、CaO 28.3%、N 0.30%、P2O53.13%、K2O 1.07%、pH 8.92，容重 1.52 g·cm?3，為顆粒狀固體。剩余4 份土壤分別按體積比土壤∶SRC=80∶20、90∶10、95∶5 和99∶1 進行混合（即分別對應為處理組20%SRC、10%SRC、5%SRC 和1%SRC），同時留一組土壤不摻入SRC，作為對照。每個處理組或對照土壤分別裝入3 個花盆（45 cm×20 cm×15 cm，長×寬×高），每個花盆種植2 年生毛蟹品種茶樹苗10 株。茶苗在室外恢復半月后移至室內(nèi)條件，LED 燈光照，光周期12 h∶12 h，溫度（28±1）℃，相對濕度（70±5）%，生長至2018 年6 月12 日[CK（2018）]，每個花盆內(nèi)取土約50 g 進行微生物多樣性檢測分析以及pH 值測定，并檢測Cd、Pb、Cr、Cu 和Zn、Ni、Hg、As 等8 種重金屬的含量。

1.2 大田試驗設計

試驗地位于福建省泉州市安溪縣西坪鎮(zhèn)紅星茶場內(nèi)茶園（簡稱紅星茶園，25°0′15.76″N，117°52′0.04″E;海拔700～750 m）。茶園面積約40 000 m2，該茶園試驗地為有機試驗茶園，不施用化肥、農(nóng)藥等。該地區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風氣候，氣溫在16～19 ℃，年降水量在1 700～2 100 mm。茶園種植茶樹品種為毛蟹，種植年限在50 年以上，茶園土壤為紅壤。2018 年7 月14 日，在茶園內(nèi)選擇6 塊茶樹地塊，每塊地面積約300 m2。在6 塊試驗地利用5 點取樣法采取土樣，采樣部位選自茶樹與施肥溝的中央位置，去除表面枯枝落葉層后0～20 cm 的土層。利用工兵鏟和鋤頭挖掘采樣斷面，用竹鏟去除與工具接觸的部分后，在整個斷面層均衡取樣，土壤樣本混合均勻后分為3 份，用于土壤微生物多樣性檢測、pH 值測定，以及Cd、Pb、Cr、Cu、Zn、Ni、Hg 和As 等8 種重金屬的含量檢測。隨后，在6 塊試驗地中隨機選擇3 塊，按1 120 kg·hm?2在茶樹主干土壤附近撒施SRC。2019 年10 月14 日，在6 塊試驗地按上述方法取土壤進行微生物、pH 值及重金屬檢測。

1.3 土壤pH、重金屬含量分析

取土樣10 g 放入50 mL 燒杯中，加入25 mL 水，用玻璃棒劇烈攪動2 min，靜置30 min，用臺式pH計[型號：FF28，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，METTLER TOLEDO]進行檢測。

土樣中Hg 和As 的含量使用原子熒光法進行測定，詳細方法參照國家標準《土壤質量 總汞、總砷、總鉛的測定 原子熒光法GB/T 22105.1—2008》；其他6 種重金屬采用原子吸收分光光度法進行檢測，參考標準為《土壤質量 鉛、鎘的測定 石墨爐原子吸收分光光度法GB/T 17141—1997》、《土壤總鉻的測定火焰原子吸收分光光度法HJ 491—2009》、《土壤質量鋅、銅的測定 火焰原子吸收分光光度法GB/T 17138—1997》、《土壤質量鎳的測定 火焰原子吸收分光光度法GB/T 17139—1997》。

1.4 土壤細菌DNA 的提取和純化

用 DNeasy Power Soil Kit （QIAGEN, Inc.,Netherlands）試劑盒進行微生物總DNA 的提取，并將提取的DNA 保存于?20 ℃冰箱內(nèi)。分別用NanoDrop ND-1000 核酸檢測儀（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和0.8%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行品質檢測；同時采用紫外分光光度計對提取的DNA 進行定量。

以細菌核糖體RNA 等能夠反映菌群組成和多樣性的目標序列為靶點，以稀釋后的DNA 作為模板，應用帶Barcode 的特異引物515F（5′-GTGCCAGCM GCCGCGGTAA-3′）和907R （5′-CCGTCAATTCMT TTRAGTTT-3′）對細菌16S V4 區(qū)進行PCR 擴增，PCR采用25 μL 反應體系：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，上 下 游 引 物 各1 μL，DNA 模 板1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL, ddH2O 8.5 μL，使用PCR 儀 器是Bio-rad T100 梯度PCR 儀。程序設定為：98 ℃預變性2 min；25 個循環(huán)（98 ℃變性15 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s）；然后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR 擴增產(chǎn)物用磁珠純化回收。將純化回收的PCR 產(chǎn)物進行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）。根據(jù)熒光定量結果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合。

1.5 土壤細菌DNA 多樣性分析

依照Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫流程進行文庫制備；通過2%瓊脂糖凝膠電泳，對文庫做最終的片段選擇與純化。上機測序前，需要先對文庫在Agilent Bioanalyzer上進行質檢，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit。合格的文庫有且只有單一的峰，且無接頭，之后，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在Promega QuantiFluor 熒光定量系統(tǒng)上對文庫進行定量，合格的文庫濃度應在2 nmol·L?1以上；將合格的各上機測序文庫（Index 序列不可重復）梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應比例混合，并經(jīng)NaOH 變性為單鏈進行上機測序；使用MiSeq 測序儀進行雙端測序。

通過質量初篩的原始序列按照index 和barcode信息，進行文庫和樣本劃分，并去除barcode 序列。利用FLASH（v 1.2.7）對每個樣本的reads 進行拼接。本研究主要利用QIIME 和R（v3.2.0）包對數(shù)據(jù)進行分析。利用QIIME 對細菌進行OUT 聚類，并計算細菌的多樣性指數(shù)，包括豐富度指數(shù)（CHAO1、ACE）、辛普森多樣性指數(shù)（Simpson index）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）。利用R 包進行細菌群落間差異性 分析（ttest 以及Monte Carlo permutation test）。同時，為了降低噪音，利用R 包（v3.2.0），選取了豐度前5%的菌落進行屬水平的主成分分析（PCA）。并對所選取的豐度前5%的菌落，利用聚類分析（Hierarchical clustering）的方法，基于非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）評價不同土壤樣本之間的相似度。

2 結果與分析

2.1 SRC 對室內(nèi)盆栽茶樹土壤pH 及重金屬的改良

與2017 年處理前土樣相比，2018 年對照組土樣pH 值有降低，但是降低的并不顯著（表1），說明較短時間（如一年內(nèi)）種植茶樹不能顯著改變土壤pH。然而，種植茶樹可顯著影響土壤重金屬的含量。如室內(nèi)盆栽種植茶苗一年后，土壤中的重金屬Cr、Pb、Ni、As、Zn 的含量發(fā)生顯著富集（表1）。為了探索SRC 對土壤酸堿度、重金屬的調(diào)節(jié)作用，分析了4 種SRC 濃度對土壤的改良效果，結果顯示：與2018 年對照組相比（5.93 ± 0.09），4 組SRC處理對土壤的酸化均有調(diào)節(jié)作用，其中施入10%SRC 對土壤酸堿度改良效果最為顯著（6.60 ± 0.54）。從重金屬上看，SRC 效果顯著，1% SRC 的施入量就可顯著降低土壤中Cd 的含量。低濃度的SRC（1%～5%）施入對一些重金屬含量的降低效果并不理想，甚至使有些重金屬含量升高；說明必須要較高濃度的SRC 施入量才可改良土壤的重金屬含量，然而，高濃度的SRC 施入（20%SRC）并不能有效降低Hg含量。同時，發(fā)現(xiàn)土壤的pH 值并不能隨著SRC 濃度的升高而升高，例如，20% SRC 施入量的土壤pH值低于10% SRC 施入量的土壤pH 值。這一結果與前人的研究相似，陳云峰等[15]在研究SRC 對蔬菜種植土壤酸性改良中，發(fā)現(xiàn)土壤pH 值提升效果與施用量并不存在正相關關系。因此，認為高濃度的SRC施入（＞10%）對茶園土壤有一定的改良作用。

表 1 室內(nèi)SRC 處理對土壤pH 值及重金屬含量的影響Table 1 Effects of SRC on pH and heavy metals in pot soil

2.2 SRC 對室內(nèi)盆栽茶樹土壤細菌多樣性的影響

通過高通量測序數(shù)據(jù)，共得到802 020 條有效序列，其中2017 年室內(nèi)種植茶樹的土壤的平均有效數(shù)據(jù)為42 289，2018 年室內(nèi)種植茶樹土壤的平均有效 數(shù) 據(jù) 為44 959，4 個 處 理 組20%SRC、10%SRC、5%SRC 和1%SRC 的土壤樣本平均有效數(shù)據(jù)分別是41 032、46 179、49 355 以及43 525。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫比對分析及注釋后，基于QIIME 軟件，對物種進行了OUT 聚類。結果顯示，20%SRC 處理組OTU 數(shù)最大

（1033.7），CK2017 對照組最?。?11.7），且兩組OTU數(shù)目差異顯著，表明SRC 對于土壤細菌的物種數(shù)目具有顯著影響。進一步對土壤細菌群落豐度指數(shù)（Chao1、ACE）以及多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）進行調(diào)查，結果顯示，施用SRC 可一定程度上增加土壤細菌的種群豐度，但差異不顯著（表2）。

表 2 室內(nèi)SRC 處理對土壤細菌多樣性的影響Table 2 Effects of SRC on microbial diversity in pot soil

2.3 SRC 對室內(nèi)茶樹種植土壤細菌群落組成與結構的影響

在門水平上，對照組與SRC 處理組中的優(yōu)勢菌群 均 為 變 形 菌 門（Proteobacteria）、 綠 彎 菌 門（Choroflexi）以及放線菌門（Actinobacteria）。然而，結果顯示，茶樹的種植可影響土壤細菌群落組成和結構。相較于2017 年，種植一年茶樹后，其土壤變形菌門和綠彎菌門的比例升高，但是放線菌門的比例卻明顯降低（圖1-A）。SRC 處理后，這些優(yōu)勢菌群的結構也發(fā)生了明顯的改變。土壤中的變形菌門比例降低，綠彎菌門的比例升高，且放線菌門的比例也發(fā)生了波動（圖1-A）；此外，各SRC 處理組土壤中藍藻菌（Cyanobacteria）比例下降明顯，5%SRC、10%SRC 和20%SRC 處理組尤為顯著，比例均在1%以下（對照為3.3%）。對豐度前5%的細菌群落，在屬水平對群落組成結構進行PCA 分析（圖1-B），結果表明，SRC 處理組土壤細菌的群落組成與對照組的差異較大。

圖 1 室內(nèi)SRC 處理土壤細菌群落種類分布及主成分分析Fig. 1 PCA on species distribution of microbial community in pot soils

基于非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）評價不同土壤樣本之間的相似度。發(fā)現(xiàn)10%SRC 處理組土壤細菌群落組成聚為一類（圖2）。同時，聚類分析也發(fā)現(xiàn)了1%SRC 處理的土壤重復之間差異較大，這一結果與上述PCA 結果相同，說明1%SRC 處理所取土壤樣本細菌不均一，后續(xù)研究可通過增加重復數(shù)目來進行改良。

圖 2 基于UPGMA 算法的土壤細菌聚類分析Fig. 2 UPGMA-based cluster analysis on soil microbes

2.4 SRC 對茶園土壤pH 及重金屬的改良

結果顯示，一年內(nèi)茶樹種植對茶園土壤的影響并不顯著，土壤酸化或者重金屬的含量變化不明顯（表3）。然而，SRC 卻可以在短時間內(nèi)影響茶園土壤，例如，SRC 可以在一年內(nèi)明顯改良土壤酸化，使土壤pH 值顯著上升（表3）；對重金屬的改良也作用明顯，結果顯示，施用SRC 后，8 種土壤重金屬含量均顯著下降（表3），顯示了SRC 對茶園土壤改良的潛力。

2.5 SRC 對茶園土壤細菌群落組成與結構的影響

SRC 處理后的茶園土壤細菌豐富度上升顯著（表4）。從土壤細菌種類在門水平的分布上看（圖3），土壤細菌分布比例最高為變形菌（Proteobacteria），兩組對照（2018 和2019）土壤中變形菌比例均高于55%，分別為57.8%和55.5%，但在SRC 處理組中，這一比例降為45.1%（圖3-A）。相比兩個不同時間段的對照土樣CK2018 和CK2019，SRC 處理組中酸桿菌（Acidobacteria）和厚壁菌（Firmicutes）比例同樣下降明顯。相反，擬桿菌（Bacteroidetes）和綠彎菌（Chloroflexi）比例上升顯著，分別達到9.6%和11.3%。屬水平的PCA 主成分分析結果表明，SRC處理組土壤細菌群落結果與對照組差異顯著（圖3-B）。

圖 3 茶園SRC 處理土壤細菌群落種類分布及主成分分析（PCA）Fig. 3 PCA on species distribution of microbial community in soils at tea plantations

表 3 SRC 處理對茶園土壤pH 值和重金屬含量的影響Table 3 Effects of SRC on pH and heavy metals in soils at tea plantations

表 4 SRC 處理對茶園土壤細菌多樣性的影響Table 4 Effects of SRC on microbial diversity in soils at tea plantations

3 討論與結論

在不施肥的前提下，大田和盆栽試驗均表明SRC 能明顯提升土壤pH，說明SRC 對于提升茶樹種植土壤pH 的效果較穩(wěn)定，對土壤pH 的提升效果不隨施用方式不同而波動。SRC 是一種火成巖，有害元素較低、堿性較強，磷、硅、鈣、鉀及微量元素較高，能對土壤酸度起到一定的中和作用[14?16]。盆栽試驗中的SRC 與土壤混合均勻，而大田試驗中，本研究采取的是常用的條施方法，施用深度在20 cm左右。此外，盆栽試驗說明，SRC 對土壤pH 的提升效果不與SRC 施用濃度呈正比，10%SRC 對土壤pH 提升效果最好，這與陳云峰等[15]、James 等[17]的研究結果一致。且SRC 對于土壤酸化的改良效果已在其他多種經(jīng)濟作物上被驗證，如在蘆筍、大麥等[15]。綜上所述，對于茶園土壤逐年酸化嚴重的問題，可以通過補施SRC 來快速緩解土壤酸化問題。

本研究結果表明，茶園土壤中富集最多的重金屬為鋅和銅。根據(jù)顏明娟等[18]的調(diào)查顯示，福建地區(qū)鋅含量有超標現(xiàn)象。此外，葉琛等[19]發(fā)現(xiàn)，土壤中的銅、鉻、鎘含量與茶葉重金屬含量具有較強的相關性。盆栽與大田試驗發(fā)現(xiàn)，添加SRC 對重金屬污染的改良有一定的效果，盆栽試驗表明低濃度SRC 的施入量就可顯著降低土壤中Cd 含量，然而，低濃度的SRC（＜10%）對于其他重金屬含量的降低效果并不顯著。因此，可通過增加碳酸鹽巖施用量來解決這一問題。因此，本研究用大劑量的SRC 施用量來進行大田試驗（1 120 kg·hm?2左右），結果表明大劑量SRC 的施用可顯著降低8 大重金屬的含量。

微生物生物群落數(shù)量和活性是影響土壤肥力的重要因素[20]，而土壤酸化可嚴重影響土壤微生物群落、結構，導致有益微生物種群大量減少，不利于茶園土壤中養(yǎng)分的轉化[21]。部分研究學者提出細菌可分為富營養(yǎng)菌和寡營養(yǎng)菌[22?23]，例如，酸桿菌門多生長于營養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境中，因此屬于寡營養(yǎng)細菌[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于未施用SRC 的茶園，施用SRC 的處理土壤中的酸桿菌門的相對豐度顯著下降，這也說明施用SRC 可提高土壤養(yǎng)分。

綜上所述，在茶園內(nèi)施用碳酸鹽巖（SRC）可以降低土壤酸性、改良土壤重金屬污染，提高茶園土壤養(yǎng)分。