二術(shù)解毒湯對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌前病變的抑制作用及機(jī)制研究※

成 揚(yáng) 陳天陽 張銀華 薛建華 傅益飛 陳建杰

(上海市浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院肝病科，上海 201299；上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海 201203)

根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的報(bào)告，肝癌在男性中每年發(fā)生523 000例，占所有癌癥的7.9%，女性中每年發(fā)生226 000例，占所有癌癥的6.5%，是全球男性中第五大、女性中第七大常見癌癥[1]。在肝癌的分類中80%為肝細(xì)胞癌(HCC)，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年有748 300例肝癌新發(fā)病例和695 900例死亡病例，其主要危險(xiǎn)因素包括病毒感染(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、脂肪性肝病(酒精、代謝和飲食誘導(dǎo))、自身免疫性肝病或慢性膽汁淤積性肝病等[2-4]。近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展以及各種治療策略的綜合運(yùn)用，HCC的治療手段不斷更新豐富，如非藥物療法(包括手術(shù)切除、射頻消融、放化療或肝移植等)、藥物療法[包括索拉非尼(多激酶抑制劑)、卡博替尼(酪氨酸激酶抑制劑)、nivolumab(PD-1抑制劑)]，顯著改善了HCC患者的預(yù)后，但總體而言5年生存率仍然不能令人滿意[5-9]，且患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，復(fù)發(fā)率高，顯著降低了患者的生活質(zhì)量。故積極探索治療肝癌的理想藥物和方法對(duì)于肝癌的防治顯得至關(guān)重要。

肝癌前病變是一個(gè)從量變到質(zhì)變的過程，是癌變進(jìn)展中啟動(dòng)、促進(jìn)和演變過程的中間階段，此過程是可逆的，因此進(jìn)一步探究肝癌前病變的基本病理、生理機(jī)制，早期采取干預(yù)措施則可逆轉(zhuǎn)或中斷肝癌前病變的病理進(jìn)程，有效抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，延長患者壽命，從而帶來較大的經(jīng)濟(jì)效益。目前，針對(duì)肝癌前病變?nèi)匀狈硐氲闹委熕幬锖褪侄?，而中醫(yī)藥在該領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究通過觀察二術(shù)解毒湯對(duì)大鼠肝癌前病變肝組織中甲胎蛋白(AFP)、細(xì)胞角蛋白19(CK19)、原癌基因(c-Myc)、Yes相關(guān)蛋白(YAP)及PDZ結(jié)合相關(guān)性轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)表達(dá)的影響，初步探討其分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 62只無特定病原體(SPF)級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量為(180±10)g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物與試劑 二術(shù)解毒湯顆粒(藥物組成：蒼術(shù)12 g，炒白術(shù)9 g，半枝蓮9 g，白花蛇舌草9 g，丹參12 g，炙鱉甲6 g)委托江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：1810332；華蟾素膠囊，陜西東泰制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20050846；二乙基亞硝胺(DEN)，美國sigma公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，美國Cell Signaling Technology公司；蘇木素復(fù)染液，生工生物工程(上海)股份有限公司；CK19、AFP、c-Myc抗體，Proteintech中國公司；免疫組化兔二抗，Cell Signaling Technology公司；Trizol試劑盒，美國Invitrogen公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，美國Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time-PCR)擴(kuò)增試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix，Thermo Fisher Scientific公司；cDNA合成(逆轉(zhuǎn)錄)試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；PCR擴(kuò)增引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)水，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 5%CO2培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司；Excelsior ES全自動(dòng)組織脫水機(jī)，石蠟包埋機(jī)，HM340E型石蠟切片機(jī)，Thermo Fisher Scientific公司；HD-330型烤片機(jī)，天津市惠達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Real time-PCR系統(tǒng)，美國Applied Biosystems公司。

1.4 動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 62只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即正常組8只，模型組14只，華蟾素組10只，二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組各10只。參照文獻(xiàn)[10]造模方法，模型組，華蟾素組，二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組予DEN 50 mg/kg腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周，第5～14周每周1次，14周末結(jié)束。正常組予等容積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，14周末結(jié)束。造模同時(shí)每日9:00華蟾素組予華蟾素0.15 g/kg，二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組分別予0.525、1.05、2.1 g/kg二術(shù)解毒湯灌胃干預(yù)，正常組、模型組根據(jù)體質(zhì)量予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，至16周末結(jié)束。造模過程中模型組，華蟾素組，二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組分別死亡5、3、4、4、4只。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 肝臟、脾臟指數(shù) 各組大鼠16周末灌胃結(jié)束后禁食12 h，稱質(zhì)量后用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血并處死。取各組大鼠肝臟、脾臟，稱取質(zhì)量，計(jì)算各組大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%；脾臟指數(shù)=脾濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.5.2 免疫組化法檢測肝組織AFP、CK19、c-Myc表達(dá) 參照試劑盒使用說明書，進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟：①石蠟切片制備。將各組癌組織部分和正常組織部分切成1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm的組織塊，放入甲醛溶液里固定24 h，固定好的組織分別在不同濃度的乙醇中進(jìn)行梯度脫水，然后制備肝組織蠟塊，蠟塊用切片機(jī)切成6 μm切片。②石蠟切片脫蠟至水。二甲苯Ⅰ 20 min→二甲苯Ⅱ 20 min→100%乙醇Ⅰ 20 min→100%乙醇Ⅱ 20 min→95%乙醇20 min→90%乙醇20 min→80%乙醇10 min→蒸餾水5 min。③封閉內(nèi)源性過氧化物酶。新鮮配制的3%H2O210 min→蒸餾水5 min→0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次×5 min。④抗原修復(fù)。將切片放入盛有M枸櫞酸鈉修復(fù)液中，置微波爐內(nèi)高火加熱使容器內(nèi)液體至起氣泡終止(約7 min)，然后低火加熱15 min，室溫自然冷卻30 min，0.01 M PBS漂洗3次×5 min。⑤加封閉液。保濕盒中切片組織表面以10%牛血清白蛋白(BSA)至室溫封閉10 min。⑥加一抗。吸干封閉液，組織樣本上加入稀釋的一抗，保濕盒中4 ℃孵育過夜。⑦加二抗。將切片從4 ℃冰箱中取出，0.01 M PBS漂洗3次×5 min，滴加與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗，4 ℃保濕盒中孵育30 min，0.01 M PBS漂洗3次×5 min。⑧DAB顯色。1 mL A液中加入30 μL B液，混勻后滴加到組織樣本上，顯色時(shí)間一般為1～5 min，肉眼或者在顯微鏡下控制發(fā)色程度，適時(shí)終止反應(yīng)，使用自來水沖洗10 min。⑨蘇木素輕度復(fù)染。加蘇木素1～2 min，自來水終止反應(yīng)。⑩脫水。75%乙醇15 min→85%乙醇15 min→95%乙醇15 min→100%乙醇Ⅰ 15 min→100%乙醇Ⅱ 15 min→二甲苯Ⅰ 15 min→二甲苯Ⅱ 15 min。封片。用中性樹膠封片，鏡檢。免疫組化結(jié)果的判讀：每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野(×400倍)基于陽性染色細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。參考文獻(xiàn)[11]陽性染色細(xì)胞的百分比：0～5%得0分，6%～35%得1分，36%～70%得2分，>70%得3分；染色強(qiáng)度：未染色0分，弱染色1分，中度染色2分，強(qiáng)染色3分。使用兩者相乘得分計(jì)算最終評(píng)分，評(píng)分等級(jí)如下：0～1分評(píng)為“-”，2～3分評(píng)為“+”，4～6分評(píng)為“++”，> 6分評(píng)為“+++”。評(píng)分≥4分為陽性，判讀過程由2位病理醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行。

1.5.3 Real time-PCR法檢測肝臟組織中AFP mRNA、CK19 mRNA、c-Myc mRNA、YAP mRNA及TAZ mRNA的表達(dá) (1)Trizol法提取總RNA。①勻漿處理：取少量肝組織置于離心管中，加入Trizol充分研磨，室溫放置5 min，使其充分裂解;②向每個(gè)離心管中加入相當(dāng)于Trizol容積1/5的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩15 s，然后再室溫靜置5 min；③提前預(yù)冷4 ℃低溫離心機(jī)，然后4 ℃以12 000 r/min離心15 min，離心后將呈現(xiàn)出上層無色水相和下層紅色有機(jī)相，RNA存在于上層水相中；④用移液器將上層水相小心吸到一個(gè)新的滅菌1.5 mL EP管中，然后加入等容積的異丙醇，輕柔顛倒7～8次混勻后，再室溫靜置5 min；⑤4 ℃低溫離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min，離心后RNA以白色沉淀物的形式出現(xiàn)在管底； ⑥RNA沉淀的洗滌：去除上清液，然后加入1 mL的95%乙醇洗滌RNA沉淀,輕柔的上下顛倒數(shù)次后，以12 000 r/min離心5 min，隨后小心吸除乙醇溶液，置于室溫條件下5～10 min，使得RNA沉淀充分干燥；⑦在RNA沉淀中加入50～100 μL的DEPC水，溶解RNA。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照以下反應(yīng)體系加入各成分，5×RT Buffer 4 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，Primer Mix 1 μL，RNA模板4 μL，DEPC水7 μL，加樣后將樣本混勻置于PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件為37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，10 ℃保存。(3)Real time-PCR擴(kuò)增反應(yīng)：總體積為20 μL(SYBR Green Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，DNA溶液1 μL，滅菌水7 μL。循環(huán)反應(yīng)體系：預(yù)變性 95 ℃ 30 min；變性 95 ℃ 15 s；退火60 ℃ 30 s；延伸70 ℃ 30 s，循環(huán)40次。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPHD)為內(nèi)參基因。目的基因的表達(dá)使用2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。引物序列見表1。引物序列設(shè)計(jì)公司生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 見表2。

表2 各組大鼠肝臟、脾臟指數(shù)比較

由表2可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均升高(P<0.05)；與模型組比較，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均降低(P<0.05)。與華蟾素組比較，二術(shù)解毒湯顆粒低、高劑量組肝臟指數(shù)均升高(P<0.05)，二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠肝組織中AFP表達(dá)比較 見表3、后插1圖1。

由表3、圖1可見，與正常組比較，模型組、二術(shù)解毒湯顆粒低劑量組肝組織AFP表達(dá)陽性率升高(P<0.05)，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒中、高劑量組肝組織AFP表達(dá)陽性率升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝組織AFP表達(dá)陽性率降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與華蟾素組比較，二術(shù)解毒湯顆粒低、高劑量組AFP表達(dá)陽性率升高，中劑量組AFP表達(dá)陽性率降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠肝組織AFP表達(dá)比較

2.3 各組大鼠肝組織中CK19表達(dá)比較 見表4、后插1圖2。

表4 各組大鼠肝組織CK19表達(dá)比較

由表4、圖2可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低劑量組CK19表達(dá)陽性率升高(P<0.05)，二術(shù)解毒湯顆粒中、高劑量組CK19表達(dá)陽性率升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，二術(shù)解毒湯顆粒劑中劑量組CK19表達(dá)陽性率降低(P<0.05)，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、高劑量組也降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與華蟾素組比較，二術(shù)解毒湯顆粒中、高劑量組CK19表達(dá)陽性率降低，二術(shù)解毒湯顆粒低劑量組CK19表達(dá)陽性率升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠肝組織中c-Myc表達(dá)比較 見表5、后插2圖3。

表5 各組大鼠肝組織中c-Myc表達(dá)比較

由表5、圖3可見，與正常組比較，模型組及二術(shù)解毒湯顆粒低劑量組c-Myc表達(dá)陽性率升高(P<0.05)；華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒中、高劑量組c-Myc表達(dá)陽性率升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組c-Myc表達(dá)陽性率降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與華蟾素組比較，二術(shù)解毒湯顆粒中劑量組c-Myc表達(dá)陽性率降低，二術(shù)解毒湯顆粒低、高劑量組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠肝組織AFP mRNA、CK19 mRNA和c-Myc mRNA表達(dá)比較 見表6。

表6 各組大鼠肝組織AFP mRNA、CK19 mRNA和c-Myc mRNA表達(dá)比較

由表6可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP mRNA、CK19 mRNA及c-Myc mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP mRNA、CK19 mRNA及c-Myc mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)。與二術(shù)解毒湯顆粒低劑量組比較，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒中、高劑量組AFP mRNA、c-Myc mRNA表達(dá)水平均降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒中劑量組CK19 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)。

2.6 各組大鼠肝組織中YAP mRNA、TAZ mRNA表達(dá)比較 見表7。

表7 各組大鼠肝組織中YAP mRNA、TAZ mRNA表達(dá)比較

由表7可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組YAP mRNA、TAZ mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組YAP mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)；華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒中、高劑量組TAZ mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)。與二術(shù)解毒湯顆粒低劑量組比較，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒劑中、高劑量組TAZ mRNA、YAP mRNA水平均降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

肝癌前病變是肝癌發(fā)生發(fā)展的中間階段，雖其在古代醫(yī)學(xué)中無相對(duì)應(yīng)的病名，但根據(jù)病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學(xué)“肝著”“肝積”“積聚”等范疇[12]。病名雖然不同，但卻有著共同的病因病機(jī)。正氣虧虛不能抵御外邪，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)是本病發(fā)生的根本。外感濕熱疫毒，留滯機(jī)體不去，導(dǎo)致熱毒凝結(jié)；內(nèi)傷飲食勞倦，而致脾胃損傷，運(yùn)化功能失調(diào)，導(dǎo)致痰濕停滯；情志不遂，肝氣不疏，氣機(jī)失調(diào)，導(dǎo)致脈絡(luò)受阻，血行不暢而成瘀血。熱毒、痰濁、瘀血是本病發(fā)生的必要條件。發(fā)病之初，邪氣壅實(shí)，正氣未虛，病機(jī)性質(zhì)多屬實(shí)；隨著邪氣入侵，損傷人體正氣，表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜之證；久之，氣血耗損嚴(yán)重，則轉(zhuǎn)為正虛為主[13]。故熱毒、痰濁、瘀血互結(jié)于脅肋，損傷正氣，久之導(dǎo)致肝癌前病變的形成。二術(shù)解毒湯方中蒼術(shù)燥濕以運(yùn)脾，白術(shù)健脾以燥濕，二術(shù)同用補(bǔ)運(yùn)兼施，則痰濕之邪除，無形之邪亦消；半枝蓮、白花蛇舌草清熱解毒，兩藥相須為用謹(jǐn)防肝內(nèi)熱毒蘊(yùn)蒸；丹參活血化瘀，鱉甲軟肝散結(jié)，二者合用可達(dá)活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之效。諸藥合用，共奏扶正祛邪、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之功，則有形之邪除，無形之邪消。本方用藥精簡，在顧護(hù)中州、調(diào)養(yǎng)后天的基礎(chǔ)上，輔以清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之品，可防止病情進(jìn)一步惡化?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒼術(shù)具有干擾內(nèi)皮細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)的能力，下調(diào)Runx2活化而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分泌，從而抑制腫瘤的形成[14]；白術(shù)可下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，而上調(diào)P21基因表達(dá)，通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能而實(shí)現(xiàn)抑制H22肝癌小鼠腫瘤的作用[15]；半枝蓮具有抗癌、抗突變、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗動(dòng)脈粥樣硬化、護(hù)肝等藥理作用[16-17]，對(duì)DEN誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝癌的形成具有一定的抑制作用,并能改善肝功能的各項(xiàng)指標(biāo)[18]；白花蛇舌草在體外具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、提高免疫力等作用[19]；丹參具有抗肝損傷、抗肝脂肪變性、抗肝纖維化、抗肝硬化和抗HCC等作用[20-22]；鱉甲可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖，降低膠原蛋白Ⅰ、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Jun D和P65蛋白水平，抑制金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)、TIMP-2和TGF-β1/Smad通路，具有抗肝纖維化、抗癌作用[23-24]。

肝癌的發(fā)展是遺傳改變的多步驟過程，涉及原癌基因的激活，這導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖持續(xù)增加。c-Myc是一種非常強(qiáng)的原癌基因，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡，其過表達(dá)導(dǎo)致自主細(xì)胞增殖，是肝癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要刺激因子[25-26]。AFP為診斷HCC生物標(biāo)志物，其升高對(duì)于HCC診斷的敏感性較差，但在預(yù)測HCC、生殖細(xì)胞腫瘤、轉(zhuǎn)移性癌癥的發(fā)生方面具有重要意義[27-28]。相關(guān)研究表明，在HCC患者中AFP陽性與HCC更高的病理分級(jí)、更高級(jí)的TNM-7分期、更大的腫瘤和更低的存活相關(guān)[29]。CK是主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)的中間絲蛋白，由Ⅰ型(CK9-20)和Ⅱ型(CK1-8)細(xì)胞角蛋白組成，其在維持上皮屏障、調(diào)節(jié)先天免疫、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、上皮細(xì)胞增殖和分化中起關(guān)鍵作用[30]。CK19在正常的肝細(xì)胞中不表達(dá)，而在多種惡性肝癌組織中過度表達(dá)，如在早期肝癌、進(jìn)展期肝癌中的陽性率分別為16.67%、18.75%，明顯高于非腫瘤性肝組織[31-32]。Cui DJ等[33]研究發(fā)現(xiàn)，CK19陽性表達(dá)在肝癌惡性進(jìn)展中起重要作用。

YAP、TAZ是Hippo途徑下游效應(yīng)分子，兩者是密切相關(guān)的旁系同源物，主要通過反饋機(jī)制介導(dǎo)Hippo途徑的下游效應(yīng)[34]。YAP基因位于人類染色體11q22上，具有65kDa的分子量，在整個(gè)發(fā)育過程中普遍存在于人體組織中；TAZ基因位于人類染色體3q23-q24上，編碼43kDa的蛋白質(zhì)，除了胸腺和外周血白細(xì)胞外，在各種組織中都有豐富的表達(dá)[34]。當(dāng)Hippo途徑失活時(shí)，YAP和TAZ將轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并通過與轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物促進(jìn)下游生長，促進(jìn)或凋亡抑制基因的轉(zhuǎn)錄，例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子(TEF，也稱為TEAD)、runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Runx)[35]。Hippo通路成分的異常表達(dá)還涉及多種疾病的發(fā)病機(jī)制，如心律失常性心肌病、特發(fā)性肺纖維化、多囊腎病、癌癥等[36]。作為Hippo途徑的主要下游效應(yīng)物，在多種類型的人類癌癥中觀察到升高的YAP和(或)TAZ表達(dá)和核定位，包括肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌和乳腺癌[37-39]。研究表明，YAP在肝癌組織中較癌旁組織高表達(dá)，且與肝硬化、AFP水平、腫瘤大小、分化程度及分期有密切關(guān)系，上調(diào)TAZ的表達(dá)可促進(jìn)HCC的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明，華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于模型組(P<0.05)；華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP、CK19、c-Myc表達(dá)均低于模型組；華蟾素組及二術(shù)解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP mRNA、CK19 mRNA、c-Myc mRNA、YAP mRNA、TAZ mRNA表達(dá)均低于模型組(P<0.05)。說明二術(shù)解毒湯可顯著抑制肝組織中AFP、CK19、c-Myc陽性表達(dá)及肝組織中AFP mRNA、CK19 mRNA、c-Myc mRNA、YAP mRNA、TAZ mRNA的表達(dá)，對(duì)于DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌前病變有顯著的抑制作用，但是這種抑制作用是否與Hippo通路的激活有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。