黃芪丹參配伍提取物在大鼠缺血性心肌中的調(diào)控作用及機(jī)制

李夢(mèng)華， 張瓅方

(1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校， 南陽(yáng) 473061； 2.南陽(yáng)理工學(xué)院， 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南陽(yáng) 473004)

因冠狀動(dòng)脈梗阻誘發(fā)心肌梗死(myocardial infarction,MI)，是導(dǎo)致心律失常甚至心力衰竭的重要原因之一，MI已成為心血管死亡的主要原因[1]。有研究證實(shí)心肌纖維化、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可明顯促進(jìn)MI的發(fā)生，因缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡是MI的主要特征[2-3]。近些年，關(guān)于血管新生在MI中的積極作用已被肯定。據(jù)報(bào)道，基于血管新生在MI模型中的新療法，如給予外源性血管生成因子、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、移植間質(zhì)干細(xì)胞等，可有效促進(jìn)MI中血管新生改善心肌重塑[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是當(dāng)前已知的促血管再生中活性最高的特異性生長(zhǎng)因子，VEGF及其受體在整個(gè)血管生成、遷移等血管新生過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[5]。

課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)中藥經(jīng)典配伍藥對(duì)黃芪和丹參提取物可顯著提升MI大鼠骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞的促血管再生作用[6]?；谥嗅t(yī)“益氣化瘀生新”理論與現(xiàn)代血管新生療法的相似之處，在本研究中，將復(fù)制MI大鼠模型，假設(shè)通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1a)和下游重要靶基因VEGF有關(guān)通路調(diào)節(jié)血管再生功能，研究黃芪丹參配伍提取物在缺血性心肌中的潛在修復(fù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

10周齡清潔級(jí)雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，體重(220±30) g，購(gòu)自上海義森生物科技有限公司[合格證號(hào)SCXK(滬)2018-003]。飼養(yǎng)于12 h明暗交替、室溫23～26 ℃、空氣濕度55%～65%的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及過(guò)程符合人道主義原則并經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：NYISTEEC-2017026)。

1.2 主要藥物、試劑和儀器

中藥黃芪和丹參提取物已在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“黃芪丹參提取物配伍調(diào)控PKD1-HDAC5/HDAC7-VEGF軸促血管新生的作用機(jī)制研究”(No.81473438)基礎(chǔ)上完成提取，其中測(cè)得黃芪總苷含量71.3%，丹參總酚酸含量66.4%。HIF-1a抗體(貨號(hào)：PB0245，上海啟明生物科技有限公司)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)抗體、磷酸化血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(phosphorylated vascular endothelial growth factor receptor 2，p-VEGFR2)抗體(貨號(hào)：Y1169、Y1175，巴傲得生物科技有限公司上海分公司)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog,AKT)抗體、磷酸化蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphorylated v-akt murine thymoma viral oncogene homolog,p-AKT)抗體(貨號(hào)：ybP004、ybP001,上海鈺博生物科技有限公司)、Isolactin B4抗體(貨號(hào)：fl-1201，Vector Laboratories，美國(guó))；Masson染色試劑盒(貨號(hào)：SG542-1，上海古朵生物科技有限公司)、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：P2359，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、Trizol試劑(貨號(hào)：FE4256，北京華邁科生物技術(shù)公司)；動(dòng)物超聲成像儀(S-Sharp Prospect，上海迪博斯生物科技有限公司)、生物病理切片機(jī)(型號(hào)：徠卡TD45，上海聚慕醫(yī)療器械有限公司)、熒光顯微鏡(型號(hào)：TL3201，上海締倫光學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 MI模型復(fù)制及分組給藥

MI大鼠模型復(fù)制選用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法造模[7]。通過(guò)向大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)進(jìn)行麻醉，以仰臥位固定頭部及四肢在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，進(jìn)行氣管插管保持呼吸道通暢。大鼠胸部備皮后沿左側(cè)第三肋間依次切開(kāi)直至暴露心臟。用9-0手術(shù)線(xiàn)穿過(guò)肺動(dòng)脈根部和左心耳之間的左前降支進(jìn)行結(jié)扎，可見(jiàn)左心室廣泛前壁色澤由紅變灰白成為梗死區(qū)。假手術(shù)組穿線(xiàn)不結(jié)扎，造模成功后逐層縫合，術(shù)后為預(yù)防感染持續(xù)3 d選用青霉素鈉80萬(wàn)單位行腹腔注射。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為黃芪丹參配伍提取物組[H+D組，40 mg/(kg·d)]、假手術(shù)對(duì)照組(Sham組，等量生理鹽水)和模型組(MI組，等量生理鹽水)各15只，采用尾靜脈藥物注射連續(xù)4周。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

在藥物干預(yù)的第2周和第4周采用30 MHz超聲探頭進(jìn)行超聲心動(dòng)圖測(cè)量，評(píng)估各組MI大鼠的心臟功能。測(cè)算左心室收縮分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening,LVFS)和左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

2.3 Masson染色法測(cè)量

MI大鼠心臟摘除后固定于10%的甲醛24 h，石蠟包埋切成4 μm厚度切片。采用Masson染色試劑盒復(fù)染后測(cè)量MI大鼠心肌纖維化程度，使用Image Pro Plus圖像處理分析軟件(6.0版)測(cè)算MI心肌膠原的纖維化面積，并按整個(gè)心室面積的百分比進(jìn)行計(jì)算。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)

將心肌載玻片在4 ℃下用標(biāo)記的Isolectin B4(1∶50)熒光素孵育過(guò)夜，并用染料DAPI封閉。熒光顯微鏡放大200倍下對(duì)心肌載玻片進(jìn)行盲檢。使用Image Pro Plus圖像處理分析軟件(6.0版)分別在心肌的梗塞區(qū)、周?chē)Ｈ麉^(qū)和邊緣區(qū)三個(gè)區(qū)域的組織切片中采集分析B4抗體陽(yáng)性細(xì)胞。

2.5 免疫組織化學(xué)染色

心肌石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水處理，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)后，用3%的過(guò)氧化氫蒸餾水中培養(yǎng)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。4 ℃黑暗環(huán)境下加入HIF-1a抗體、p-VEGFR2抗體和p-AKT抗體孵育12 h，切片用蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封閉。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法(western blot)分析

采用RIPA裂解液溶解MI大鼠心肌組織，4 ℃下以12 000 r/min的速度離心8 min后，吸取上清液，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)蛋白濃度。經(jīng)過(guò)十二烷基黃硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離蛋白后移動(dòng)至聚偏二氟乙烯膜。常溫下選用適量的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖鹽溶液洗膜，將細(xì)胞膜與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(1∶1 000)、HIF-1a抗體(1∶200)、VEGFA抗體(1∶1 000)、AKT抗體(1∶1 000)、P-AKT抗體(1∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜。將膜與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗在室溫環(huán)境下共同孵育1 h后，磷酸鹽緩沖溶液每次洗膜3 min，反復(fù)3次。加入化學(xué)熒光試劑后，曝光顯色成像，采用定量分析系統(tǒng)讀片。

2.7 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析

取MI大鼠心肌組織進(jìn)行勻漿離心后，采用Trizol試劑提取組織中的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA,cDNA)。引物設(shè)計(jì)如下：HIF-1a上游引物5′-CCGGTAGGCTTGCTT-3′，下游引物5′-TGCGGACTCAGCCT-3′；VEGFA上游引物5′-TCCTAACAGCAGCAGGCG-3′，下游引物5′-ACCGGTCAAGGCTAATCC-3′；GAPDH上游引物5′-CTACCGGCTGACCGGACC-3′，下游引物5′-ATGGTTCCGGATCGCCTT-3′。參照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction，PCR)擴(kuò)增后2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行圖像攝錄分析，各目標(biāo)基因與內(nèi)參GAPDH基因灰度片段比值作為自身基因信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)的表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 黃芪丹參配伍提取物對(duì)MI大鼠心功能的影響

藥物干預(yù)4周后，模型組存活12只，黃芪丹參配伍提取物組存活14只，假手術(shù)對(duì)照組無(wú)死亡。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程的第2周和第4周，采用超聲心動(dòng)圖測(cè)量各組MI大鼠的左室射血功能，評(píng)價(jià)心肌收縮力。與假手術(shù)對(duì)照組第2周和第4周相比，模型組和黃芪丹參配伍提取物組的LVFS和LVEF明顯降低(P<0.05)。在心肌梗死后的第2周，模型組和黃芪丹參配伍提取物組的LVFS和LVEF相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。4周后，與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組的LVEF和LVFS均明顯升高(P<0.05)。表明經(jīng)過(guò)4周的藥物干預(yù)，黃芪丹參配伍提取物對(duì)MI大鼠的左室射血功能和心肌收縮力有一定改善，如圖1所示。

與Sham組相比，*表示P<0.05；與MI組相比,#表示P<0.05圖1 各組MI大鼠心功能表現(xiàn)Fig.1 Cardiac function of MI rats in each group

3.2 黃芪丹參配伍提取物對(duì)MI大鼠心肌纖維化的影響

實(shí)驗(yàn)第4周結(jié)束時(shí)，采用Masson染色法檢測(cè)MI大鼠的心肌纖維化水平。與假手術(shù)組相比，模型組和黃芪丹參配伍提取物組心肌藍(lán)色膠原纖維顯著增加(P<0.05)；但與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組藍(lán)色膠原纖維沉積明顯較少(P<0.05)。表明黃芪丹參配伍提取物可有效降低MI大鼠的心肌纖維化，如見(jiàn)圖2所示。

與Sham組相比，*表示P<0.05；與MI組相比,#表示P<0.05圖2 各組MI大鼠心肌纖維化表現(xiàn)Fig.2 Myocardial fibrosis in MI rats of each group

3.3 黃芪丹參配伍提取物對(duì)MI大鼠心肌血管生成的影響

Isolectin B4用于標(biāo)識(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在藥物干預(yù)4周后，選用Isolectin B4抗體染色測(cè)量MI大鼠心肌內(nèi)毛細(xì)血管的密度，評(píng)價(jià)MI大鼠的血管生成作用。與模型組相比，心肌梗死的梗塞區(qū)和周?chē)Ｈ麉^(qū)中Isolectin B4陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)。表明通過(guò)黃芪丹參配伍提取物干預(yù)后，可促進(jìn)MI大鼠心肌中的血管新生，如圖3所示。

與Sham組相比，*表示P<0.05；與MI組相比,#表示P<0.05圖3 各組MI大鼠毛細(xì)血管密度表現(xiàn)Fig.3 Capillary density of MI rats in each group

3.4 黃芪丹參配伍提取物對(duì)HIF-1a、VEGFA和p-AKT表達(dá)的影響

為進(jìn)一步闡明黃芪丹參配伍提取物對(duì)MI的作用機(jī)制，觀察了4周后MI大鼠心肌中HIF-1a、VEGFA和p-AKT表達(dá)的水平。采用免疫組化染色法檢測(cè)HIF-1a、p-VEGFR2(主要由VEGFA激活)和p-AKT的分布，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征顯示HIF-1a陽(yáng)性細(xì)胞和p-AKT陽(yáng)性細(xì)胞分布在心肌細(xì)胞中，p-VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞分布在模型組和黃芪丹參配伍提取物組的血管內(nèi)皮細(xì)胞。藥物干預(yù)4周后，與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組中HIF-1a、VEGFA、p-AKT/AKT的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。表明黃芪丹參配伍提取物可上調(diào)MI大鼠心肌中HIF-1a、VEGFA和p-AKT的表達(dá)水平，如圖4所示。

與Sham組相比，*表示P<0.05；與MI組相比,#表示P<0.05圖4 各組MI大鼠HIF-1a、VEGFA和p-AKT表達(dá)Fig.4 Expression of HIF-1a, VEGFA and p-AKT in MI rats of each group

4 討論及結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)黃芪丹參配伍提取物在MI大鼠缺血性心肌中具有促血管新生的積極作用。課題組前期研究工作已證實(shí)黃芪丹參提取物協(xié)同使用可有效增強(qiáng)心肌舒縮功能，減輕心室重塑[8]。在此次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)以及Masson染色法顯示再次證實(shí)，MI大鼠模型構(gòu)建成功，黃芪丹參配伍提取物對(duì)保護(hù)MI大鼠受損心肌具有積極作用。經(jīng)過(guò)黃芪丹參配伍提取物干預(yù)4周后，MI大鼠心肌組織中HIF-1a、VEGFA和p-AKT的表達(dá)明顯上調(diào)。

AKT是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信號(hào)通路的特征性靶點(diǎn)，磷酸化后的AKT具有抑制MI心肌細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)血管再生的作用[9]。心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生在MI的早期階段，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，p-AKT主要分布于心肌細(xì)胞，黃芪丹參配伍提取物可上調(diào)p-AKT表達(dá)，說(shuō)明該組配伍藥可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)心臟功能，進(jìn)一步預(yù)防心力衰竭。HIF-1a是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境作出反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，提高HIF-1a表達(dá)可以減少M(fèi)I的梗死面積，改善心臟功能[10]。研究表明，心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下，HIF-1a可直接誘導(dǎo)VEGF增加，促進(jìn)心臟梗死的修復(fù)。具有酪氨酸活性的p-VEGFR2是介導(dǎo)VEGF的主要活性受體之一，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞再生、增加血管通透性等功能，廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等處，代表著血管的新生程度[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)黃芪丹參配伍提取物干預(yù)4周后，可明顯上調(diào)HIF-1a及其下游VEGF因子的表達(dá)，表明該組配伍藥通過(guò)HIF-1a/VEGFA信號(hào)通路促進(jìn)MI的血管生成，從而改善心臟功能。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)肯定了中藥黃芪丹參配伍提取物在缺血性心肌中的促血管新生作用，通過(guò)上調(diào)HIF-1a/VEGFA信號(hào)通路參與血管生成，為中醫(yī)藥防治此類(lèi)疾病提供了有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和研究思路。