豬細小病毒L株毒種最高代次范圍及其依據(jù)

李建華，張智明，何世岷，竇海燕，方超，劉旭

（哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心，哈爾濱150069）

1 材料

1.1 毒種

豬細小病毒L株E0代，批號：PPV-E1-201301，由哈藥集團生物疫苗有限公司制備、鑒定和保存；檢驗用強毒：豬細小病毒7909株，批號：PPV-Q-201201，規(guī)格：2.0 mL·支-1，紅細胞凝集價為1:512，病毒含量107.75TCID50/mL，由哈藥集團生物疫苗有限公司制備、鑒定和保存。

1.2 血清

豬細小病毒陽性血清，HI效價：1:512，規(guī)格1.0 mL·支-1；豬細小病毒陰性血清規(guī)格1.0 mL·支-1，均來源于東北農(nóng)業(yè)大學。

1.3 紅細胞懸液制備

0.5%豚鼠紅細胞懸液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行制備。

1.4 主要試劑

MontanideTMISA 206 VG佐劑，購自法國賽比克公司；二乙烯亞胺，購自FLUCA公司。

1.5 無菌檢驗用培養(yǎng)基

TG（硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基）、GA（酪胨瓊脂）、GP（葡萄糖蛋白胨湯），均由哈藥集團生物疫苗有限公司提供。

1.6 支原體檢驗培養(yǎng)基

購自北京海淀中海動物保健科技公司。

1.7 試驗動物

妊娠40日初產(chǎn)母豬（豬瘟中和抗體陰性、豬細小病毒HI抗體不超過1:8），購自黑龍江省哈爾濱市郊某豬場，品種為長白；350～400 g成年豚鼠（豬細小病毒HI抗體不高于1:8），由哈藥集團生物疫苗有限公司實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 毒種的傳代

將豬細小病毒L株原始毒種E0代按培養(yǎng)液體積0.5%的比例接種到新消化的ST細胞懸液中（2.0×105個細胞·mL-1），置37℃靜置培養(yǎng)，每日觀察1～2次。培養(yǎng)48 h后，收獲含病毒的細胞培養(yǎng)液和細胞，收獲的病毒液反復凍融3次，吸取部分病毒液做無菌檢驗。將檢驗無菌的病毒液作為E1代病毒液，并按以上方法在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代。每代分別留樣用于檢驗，剩余病毒液置于-20℃凍存。取E1～E12代病毒液進行病毒含量和紅細胞凝集價測定，對E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液進行了毒力、免疫原性、特異性和純凈性檢測。

2.2 病毒含量

將各代毒種用MEM細胞培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7 3個稀釋度，各加入96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度6孔，每孔100μL，同時設6孔加100μL MEM作為無病毒空白對照。每孔加入100μL新消化的ST細胞懸液（4.0×105個·mL-1），置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5日，每日觀察和記錄各孔中病毒感染情況，取最高細胞病變時間點，按Reed-Muench法，計算病毒的致半數(shù)細胞感染滴度（TCID50）。

2.3 紅細胞凝集價測定

將毒種作2倍系列稀釋，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄測定對0.5%豚鼠紅細胞的凝集價。

2.4 毒力

取妊娠40日的初產(chǎn)母豬（豬瘟中和抗體陰性、豬細小病毒HI抗體效價低于1:8）5頭，經(jīng)鼻內(nèi)接種2.0 mL病毒液（每mL病毒含量106.0TCID50）。攻毒后觀察妊娠母豬是否產(chǎn)出死胎或胎，記錄胎兒生長情況，并采集胎兒肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結等組織，用PCR方法檢測是否感染豬細小病毒。

2.5 免疫原性測定

將病毒液按本規(guī)程制備疫苗。用細小病毒血凝抑制（HI）抗體陰性體重350～400 g的豚鼠5只，各肌肉注射疫苗0.5 mL。28日后，連同條件相同的對照豚鼠2只，采血，測定HI抗體效價。

2.6 特異性檢驗

將毒種用MEM稀釋成200TCID50/0.1 mL，分別與等量豬細小病毒陽性血清和豬細小病毒陰性血清混合，置37℃水浴作用1 h后，加入96孔細胞培養(yǎng)板6個孔內(nèi)，其后每孔加入100μL新消化的ST細胞懸液（4.0×105個·mL-1）。同時設正常細胞對照，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5日。

2.7 無菌檢驗

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。

2.8 支原體檢驗

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。

2.9 外源病毒檢測

2.9.1樣品的處理

取保存的F0代毒種3瓶，混合后用相應的的特異性抗血清中和后作為檢品。

2.9.2接種的細胞與樣品的培養(yǎng)

接種的細胞將檢品接種以下細胞：Vero細胞、MDBK細胞、PK15細胞。樣品的接種與培養(yǎng)，將1.0 mL已處理的被檢樣品接種到已長成單層的上述細胞，另設1瓶未接種的正常細胞對照，并培養(yǎng)不少于14日，其間應至少繼代1次。最后1次繼代的細胞單層數(shù)量和培養(yǎng)面積應符合熒光抗體檢查法、致細胞病變檢查法和紅細胞吸附性外源病毒檢驗的要求。判定在至少14日的培養(yǎng)期內(nèi)，要對細胞培養(yǎng)物進行常規(guī)檢查，如果培養(yǎng)期間出現(xiàn)細胞病變即判定為不符合規(guī)定。如無細胞病變，培養(yǎng)結束，時，細胞單層應按2.9.3進行檢驗。

2.9.3檢查方法

熒光抗體檢查法最后1次繼代的細胞單層培養(yǎng)5～7日后用于熒光抗體檢查。對每一種特定外源病毒的檢驗應至少包含3組細胞：1.被檢樣品處理細胞；2.在最后1次繼代時接種100～300 FAID50特定病毒的陽性對照細胞；3.未加樣品的陰性對照細胞。每一組細胞單層檢查面積應不小于6 cm2。

每一組細胞應按下列規(guī)定選擇特異的抗病毒熒光抗體：①所有細胞均應檢驗：牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）；②豬源細胞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）。

細胞單層樣品經(jīng)甲醇定后，用適宜的熒光抗體進行染色，檢查每一組細胞單層是否存在特定外源病毒的熒光。當陽性對照出現(xiàn)特異熒光，正常細胞無熒光時，如果被檢樣品出現(xiàn)外源性病毒特異性熒光，判為存在相應病毒污染而樣品不合格。如果陽性對照組熒光不明顯，或者正常細胞出現(xiàn)明顯熒光，判為無結果，應重檢。

致細胞病變檢查法取經(jīng)傳代后培養(yǎng)至少7日的敏感細胞單層（每個至少6 cm2）進行檢驗。用適宜染色液對細胞單層進行染色。觀察細胞，檢查包涵體、細胞融合形成的巨細胞、局部細胞壞死脫落或其他由外源病毒引起的CPE的出現(xiàn)情況。如果出現(xiàn)外源病毒所致的特異性CPE，判為樣品不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通過其他試驗排除這種可能性時，則判為樣品不合格。

紅細胞吸附性外源病毒檢驗取經(jīng)傳代后培養(yǎng)至少7日的敏感細胞單層（每個至少6 cm2）進進行檢驗。以PBS（pH 7.2，下同）洗滌細胞單層2～3次。加入適量0.2%的豚鼠紅細胞和雞紅細胞的等量混合懸液，以覆蓋整個單層表面為準，紅細胞懸液可在加入前混合，亦可以分別滴加于不同的細胞單層上。選2個細胞單層，分別在2～8℃和20～25℃放置30 min后，用PBS洗滌，檢查紅細胞吸附情況。如果出現(xiàn)外源病毒所致的紅細胞吸附現(xiàn)象，判為樣品不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通過其他試驗排除這種可能性時，則判為樣品不合格。

3 結果

3.1 病毒含量測定結果

將豬細小病毒L株E0代毒種在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代，進行各代病毒液病毒含量的測定，結果見表1。

3.2 紅細胞凝集價測定結果

將豬細小病毒L株E0代毒種在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代，進行各代病毒液紅細胞凝集價的測定，結果見表2。

表1病毒含量的測定結果

表2紅細胞凝集價測定結果

3.3 毒力測定結果

E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液進行毒力的測定。結果表明，E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液均能至少引起4/5的妊娠母豬產(chǎn)下死胎或弱胎，且采集胎兒組織PCR檢測豬細小病毒為陽性，E1、E3、E5、E7代病毒液的毒力測定結果見“豬細小病毒L株基礎種子批的系統(tǒng)鑒定報告”，E9和E12代病毒液毒力測定結果見表3。

3.4 免疫原性測定結果

將E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液，按照本規(guī)程方法制備疫苗進行免疫原性測定。結果表明，E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液經(jīng)滅活后制備的疫苗均能使3/4以上注射豚鼠出現(xiàn)抗體反應，其HI效價均高于1:64。E1、E3、E5、E7代病毒液的免疫原性測定結果見“豬細小病毒L株基礎種子批的系統(tǒng)鑒定報告”，E9及E12代病毒液的免疫原性測定結果見表4。

3.5 特異性檢驗結果

將豬細小病毒L株E0代毒種在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代，將各代病毒液進行特異性檢驗，結果表明各代次病毒液均可被豬細小病毒陽性血清完全中和，接種ST細胞觀察5日不產(chǎn)生細胞病變，特異，結果見表5[1-4]。

3.6 無菌檢驗結果

各代毒種按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗，結果見表6。

表3毒力測定結果

表4免疫原性測定結果

表5特異性檢驗結果

表6無菌檢驗結果

3.7 支原體檢驗結果

各代病毒液按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行支原體檢驗，結果見表7。

表7支原體檢驗結果

3.8 外源病毒檢測結果

熒光抗體檢查法檢測結果結果見表8。

表8熒光抗體法檢測結果

致細胞病變法檢測結果結果見表9。

紅細胞吸附性外源病毒檢測結果結果見表10。

表9致細胞病變法檢測結果

表10紅細胞吸附性外源病毒檢測結果

4 結論

豬細小病毒L株E1～E12代病毒液，病毒含量為107.36～107.60TCID50/mL、紅細胞凝集價在1:512～1:1 024；E1、E3、E5、E7、E9和E12代 病 毒液，毒力穩(wěn)定、免疫原性良好、特異、純凈。為進一步確保L株作為生產(chǎn)用毒種的遺傳穩(wěn)定性，將其作為生產(chǎn)用毒種的基礎代次限定為E1～E5代，生產(chǎn)代次限定為E6～E8代，生產(chǎn)毒種最高使用代次不超過3代。