豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化研究及其腐乳產(chǎn)品開(kāi)發(fā)

王霏霏，王 莎，李丹林

（浙江農(nóng)林大學(xué) 暨陽(yáng)學(xué)院，浙江 諸暨 311800）

0 引言

我國(guó)作為生產(chǎn)加工大豆的主要國(guó)家之一，在生產(chǎn)各種豆制品的過(guò)程中均會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品——豆渣。研究表明，這些豆渣占全豆質(zhì)量的16%～25%。豆渣含有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含蛋白質(zhì)18%～23%，膳食纖維50%～55%，還含有人體必需的8 種氨基酸及豐富的礦物質(zhì)和維生素[1]。但是，豆渣水分含量高，容易腐爛發(fā)臭變質(zhì)，并且傳統(tǒng)豆渣口感粗糙難以消化，使得人們對(duì)豆渣產(chǎn)品接受度差，因此豆渣的潛在價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有充分開(kāi)發(fā)利用。

目前，豆渣改性方法主要有機(jī)械粉碎法、酸-堿水解法、生物發(fā)酵法等，其中發(fā)酵法產(chǎn)率高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉，并且微生物發(fā)酵能有效提高豆渣中的營(yíng)養(yǎng)成分。羅勇泉等人[2]利用釀酒酵母對(duì)豆渣和蘋(píng)果渣的混合物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合蘋(píng)果渣的豆渣經(jīng)發(fā)酵后口感得到明顯改善。謝歡等人[3]利用黑曲霉發(fā)酵豆渣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵豆渣有效提高了豆渣膳食纖維的品質(zhì)。鑒于此，選用黑曲霉、小曲、黑曲霉- 小曲混菌種發(fā)酵豆渣，以氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，探究最佳發(fā)酵菌種并采用正交試驗(yàn)探究該菌種的最佳發(fā)酵工藝；同時(shí)，研究了豆渣發(fā)酵前后纖維素酶活、半纖維素酶活及其粒徑分布，旨在探究有一種高氨基酸態(tài)氮含量、口感良好、膳食纖維品質(zhì)高的發(fā)酵豆渣，并以此豆渣為主要原料，研制一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的腐乳，更大程度地利用豆渣，變廢為寶，同時(shí)也為腐乳行業(yè)提供了新的發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料

黃豆，安徽燕之坊食品有限公司提供；新鮮豆渣由實(shí)驗(yàn)室自行研磨而得。

試驗(yàn)菌種：黑曲霉、毛霉菌種，錦潤(rùn)生物提供；小曲，安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備

GZX-9076MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SW-CJ-1CU 型超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；KQ-500B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；DY04-13-44-00 型壓力蒸汽滅菌器，上海東亞壓力容器制造有限公司產(chǎn)品；BSD 型振蕩培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豆渣腐乳工藝流程

新鮮豆渣→121 ℃高溫蒸汽滅菌→冷卻接種→發(fā)酵培養(yǎng)→接種毛霉→腌坯、調(diào)味裝罐→腐乳成品。

1.3.2 單因素發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取30 g 豆渣在一定條件下分別接種一定量的黑曲霉、小曲、黑曲霉- 小曲混菌種（黑曲霉與小曲的比例為1∶1），取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，確定發(fā)酵效果最好的菌種并探究該菌種最佳發(fā)酵條件，測(cè)試3 次，取平均值。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳工藝。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 腐乳產(chǎn)品開(kāi)發(fā)

將發(fā)酵后的豆渣團(tuán)切成5 cm×5 cm 的方塊，在其表面均勻噴灑毛霉懸浮液，平放于鋪有3 層無(wú)菌紗布的籠屜之中，控制環(huán)境溫度為20 ℃左右，同時(shí)還需要保持一定環(huán)境濕度。約5 d 后腐乳坯表面會(huì)布滿酶絲，加食鹽腌制，逐層加食鹽并隨層數(shù)增高而增加食鹽量，接近瓶口的食鹽要鋪厚一點(diǎn)，8 d 左右加食鹽腌制完成，對(duì)于腐乳的調(diào)味按照糟方調(diào)味方式，裝罐封存，即為腐乳成品。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮的測(cè)定采用GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中第一法：酸計(jì)度法。

1.4.2 酶活的測(cè)定[4-5]

（1） 半纖維素酶活的測(cè)定。取1 g 發(fā)酵后的豆渣用蒸餾水稀釋并且定容至100 m 容量瓶中，取0.5 mL溶液并在其中加入1.5 mL 多糖，酶解30 min，然后用DNS 法測(cè)定木糖含量。酶活計(jì)算公式如下：

式中：m——所測(cè)木糖質(zhì)量，μg；

M——豆渣樣品質(zhì)量，mg；

30——酶解時(shí)間，min；

0.5 ——測(cè)試樣品體積，mL；

100——樣品總體積，mL。

（2） 纖維素酶活的測(cè)定。纖維素酶活測(cè)定同上，僅將需要測(cè)定的木糖替換為葡萄糖。

1.4.3 粒度分布

采用濕式篩分法測(cè)定豆渣粒度分布。

取10 g 發(fā)酵后的豆渣樣品，置于250 mL 的三角瓶中，加入200 mL 的水，隨后將其置于超聲波清洗器中超聲處理，促使豆渣顆粒分布均勻（超聲條件：水溫20 ℃，50 W，40 kHz，20 min）。超聲處理后的豆渣樣品放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩處理（振蕩條件：水溫60 ℃，轉(zhuǎn)速80 r/min，時(shí)間4 h）。將處理后的已經(jīng)給顆粒分散均勻的豆渣倒入依次疊好的標(biāo)準(zhǔn)篩中進(jìn)行篩析（標(biāo)準(zhǔn)套篩由上至下疊放順序：篩孔直徑為1 500，900，450，200，30 μm 標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩），每層標(biāo)準(zhǔn)篩用清水沖洗5 min，將殘留在篩上的豆渣顆粒分別依次轉(zhuǎn)入事先編號(hào)的稱量皿中，于烘箱中105 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱取質(zhì)量并分別計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%），由此依次求出0～30，＞30～200，＞200～450，＞450～900，＞900～1 500，＞1 500 μm 顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 接種量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響

取30 g 豆渣置于250 mL 的錐形瓶中，分別按0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的接種量加入黑曲霉、小曲、黑曲霉- 小曲混菌種，在35 ℃下發(fā)酵2 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定豆渣中氨基酸態(tài)氮的含量。

接種量對(duì)各菌種發(fā)酵豆渣產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮含量影響曲線見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，發(fā)酵后豆渣中的氨基酸態(tài)氮含量水平顯著升高，并且呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為1%時(shí)，小曲和黑曲霉結(jié)合小曲發(fā)酵豆渣產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量出現(xiàn)最高值，分別為0.35，0.39 g/100 g；當(dāng)接種量為1.5%，黑曲霉發(fā)酵豆渣產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到0.33 g/100 g。這說(shuō)明當(dāng)菌種接種量較少時(shí)，產(chǎn)酶量不足，即分泌的蛋白酶不足，分解蛋白質(zhì)效率較低，進(jìn)而影響氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)率。同時(shí)，當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)菌體過(guò)度繁殖，菌內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)激烈，菌體所獲得的營(yíng)養(yǎng)成分不夠充足，生長(zhǎng)代謝受到限制，甚至還會(huì)造成菌體早衰，不利于發(fā)酵，因此高濃度的接種量使得氨基酸態(tài)氮產(chǎn)率逐漸開(kāi)始下降。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響曲線見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，發(fā)酵溫度上升使得發(fā)酵后豆渣氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，黑曲霉發(fā)酵豆渣得到的氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量最高，達(dá)到0.33 g/100 g；當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，小曲、黑曲霉結(jié)合小曲發(fā)酵得到的氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量最高，分別為0.36，0.37 g/100 g。這主要是由于溫度的增加影響了黑曲霉及小曲中的酵母、根霉的生長(zhǎng)和代謝，同時(shí)也受到蛋白酶最適溫度的影響。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響曲線見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，氨基酸態(tài)氮含量增加，且隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量增長(zhǎng)速率逐漸變慢，豆渣水分增加，同時(shí)從3 d 開(kāi)始黑曲霉發(fā)酵豆渣產(chǎn)生了不愉快的氣味且氣味逐漸變重，這都不利于后期腐乳產(chǎn)品的成型與滋味。因此，取3 d 為小曲、黑曲霉、黑曲霉結(jié)合小曲發(fā)酵豆渣最佳時(shí)間，所得氨基酸態(tài)氮分別為0.37，0.36，0.42 g/100 g。

2.1.4 單因素試驗(yàn)結(jié)論

由上述研究可得，黑曲霉結(jié)合小曲發(fā)酵豆渣產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于單菌發(fā)酵，發(fā)酵效果更好，因此選取黑曲霉- 小曲混菌種進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)，根據(jù)上述研究，接種量選取0.5%，1.0%，1.5%；溫度選取30，35，40 ℃；發(fā)酵時(shí)間選取1，2，3 d 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交數(shù)據(jù)試驗(yàn)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交數(shù)據(jù)試驗(yàn)與結(jié)果

由表2 可知，A，B，C 3 個(gè)因素的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即對(duì)黑曲霉結(jié)合小曲發(fā)酵豆渣中氨基酸態(tài)氮含量影響最大的是接種量，其次是發(fā)酵溫度，影響最小的是發(fā)酵時(shí)間。最佳發(fā)酵條件為A2B2C3，即接種量1%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間為3 d。在此條件下，豆渣中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到0.42 g/100 g，較未發(fā)酵豆渣的0.13 g/100 g，提高了3.23 倍。

2.3 纖維素及半纖維素酶活的變化

豆渣經(jīng)黑曲霉- 小曲混菌種在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵所產(chǎn)生的纖維素酶活和半纖維素酶活與未發(fā)酵豆渣所含酶活對(duì)比。

纖維素與半纖維素酶活變化見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，發(fā)酵后豆渣的纖維素酶活與半纖維素酶活均有顯著上升的趨勢(shì)，發(fā)酵后纖維素酶活達(dá)到3 169.48 μg·min·mg，是未發(fā)酵豆渣的2.02 倍，半纖維素酶活達(dá)到5 447.37 μg·min·mg，是未發(fā)酵豆渣的10.64 倍。纖維素酶活與半纖維素酶活的變化影響豆渣中膳食纖維的結(jié)構(gòu)與含量，纖維素酶和半纖維素酶降解水不溶性膳食纖維多糖，使水溶性膳食纖維多糖成分得到增加，使得豆渣中SDF/TDF 增高，提高膳食纖維品質(zhì)，從而提高以發(fā)酵豆渣為原料的豆渣腐乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.4 粒徑分布

豆渣經(jīng)黑曲霉- 小曲混菌種在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵后的粒度分布與未發(fā)酵豆渣粒度分布對(duì)比。

豆渣發(fā)酵前后粒徑分布見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，未發(fā)酵豆渣粒徑主要集中在＞200 ～450 μm 和＞450～900 μm，共占74.74%，其中0～30 μm 的顆粒僅占5.86%。而發(fā)酵后的豆渣粒徑則主要分布在＞30～200 μm 和＞200～450 μm，共占74.19%，0～30 μm 的顆粒為未發(fā)酵豆渣的2.66 倍，并且發(fā)酵后豆渣幾乎不含＞900 μm 粒徑的顆粒。即經(jīng)過(guò)發(fā)酵，豆渣大顆粒被降解成小顆粒，豆渣粒徑明顯變小，有利于腐乳產(chǎn)品渣感降低，更利于吞咽與消化。

2.5 腐乳產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)

經(jīng)毛霉接種的豆渣坯見(jiàn)圖6，進(jìn)行腌坯的豆渣腐乳見(jiàn)圖7。

發(fā)酵后的豆渣坯經(jīng)毛霉接種，2 d 菌絲開(kāi)始進(jìn)行生長(zhǎng)，3 d 菌絲生長(zhǎng)旺盛，5 d 豆渣坯表面布滿菌絲。由圖6、圖7 可知，毛霉在豆渣坯上生長(zhǎng)良好，并且進(jìn)過(guò)毛霉接種、腌坯的豆渣腐乳坯同時(shí)也具有良好的成型性，因此利用發(fā)酵后的豆渣制做腐乳是可行的。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到了黑曲霉- 小曲混菌種對(duì)豆渣大分子蛋白分解最佳發(fā)酵條件為接種量1%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間3 d，在此發(fā)酵條件下，氨基酸態(tài)氮值可達(dá)到0.42 g/100 g，是未發(fā)酵豆渣的3.23 倍，提高了豆渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味。

同時(shí)，黑曲霉- 小曲混菌種發(fā)酵豆渣后，豆渣中的纖維素酶活和半纖維素酶活增加顯著，分別為未發(fā)酵豆渣的2.02 倍和10.64 倍，提高了豆渣膳食纖維品質(zhì)。發(fā)酵后豆渣的粒徑逐漸變小、渣感顯著降低、吞咽較為容易，且發(fā)酵后豆渣毛霉生長(zhǎng)良好。因此，利用發(fā)酵后豆渣制得一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的腐乳是可行的。