糖醋蒜理化微生物指標(biāo)分析與工藝優(yōu)化

劉春雷，侯進(jìn)慧，孫 宇，仝 童，李 佳，錢(qián)昱含

（徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018）

大蒜（Allium Sativum），也稱(chēng)為蒜頭、胡蒜，鱗莖是其主要的食用部分。大蒜是我國(guó)主要的農(nóng)產(chǎn)品出口品種，其種植地區(qū)主要以大蒜頭和大蒜加工品作為商品獲得經(jīng)濟(jì)效益，為我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了可觀的產(chǎn)值[1]。在分類(lèi)學(xué)上，大蒜屬于蔥科（Alliaceae） 蔥屬（Allium）[2]，是一種淺根性多年生草本植物，原產(chǎn)地分布在亞洲西部和歐洲南部等地。大蒜早期主要在古羅馬和地中海沿岸的部分地區(qū)種植，隨后引入我國(guó)[3]。國(guó)內(nèi)大蒜資源的產(chǎn)品形式主要有新鮮大蒜、脫水大蒜、糖醋大蒜、大蒜片、大蒜粉、大蒜泥、大蒜汁等，也有部分企業(yè)將大蒜產(chǎn)品與食品加工生產(chǎn)技術(shù)結(jié)合生產(chǎn)出大蒜香腸、大蒜面包等即食食品[4-6]。新鮮大蒜中含有大蒜素、超氧化物歧化酶（SOD）、大蒜多糖、大蒜揮發(fā)油等成分，這些成分賦予大蒜的抗氧化、抗腫瘤和抗感染的作用[7]。大蒜具有降低血液中的血脂和抑制血小板聚集的作用，可以對(duì)心腦血管起到良好的保護(hù)調(diào)節(jié)作用。大蒜能改善人體細(xì)胞的免疫功能，可以促進(jìn)新陳代謝、能量轉(zhuǎn)換和血液循環(huán)，并可增強(qiáng)體質(zhì)，提高身體素質(zhì)[8]。

以新鮮大蒜為原料，通過(guò)改變大蒜前處理方式、腌制原料配比，從而確定糖醋蒜腌制工藝的優(yōu)化參數(shù)，并對(duì)相關(guān)理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和微生物分析，以期為大蒜的加工企業(yè)提供有參考價(jià)值的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用的新鮮大蒜產(chǎn)自江蘇邳州；其他腌制輔料購(gòu)于超市；葡萄糖、NaCl、蛋白胨、瓊脂粉、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） 培養(yǎng)基及理化性質(zhì)測(cè)定的相關(guān)化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；細(xì)菌基因組提取及PCR 反應(yīng)的所需試劑，寶生物工程（大連） 有限公司提供。

腌制所用大蒜要求新鮮肥大、無(wú)破損、無(wú)病蟲(chóng)、大小均勻；白砂糖、醬油、食醋等均為市售優(yōu)級(jí)；處理用水為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的生活飲用水。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 型電子天平；臺(tái)秤；溫度計(jì)；蘇泊爾不銹鋼鍋；泡菜專(zhuān)用玻璃瓶；Sigma3-16pk 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA 公司產(chǎn)品；三洋超低溫冰箱，日本SANYO 電子有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR 擴(kuò)增儀，天津金思德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD 公司產(chǎn)品；723C型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-IC 型標(biāo)準(zhǔn)型雙人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.3 糖醋蒜腌制

1.3.1 工藝流程

原料選擇→剝皮去莖→清水浸泡→換水→再浸泡→食鹽腌制→曝曬→配料液→腌制→成品。

1.3.2 操作要點(diǎn)[9-10]

選擇無(wú)病蟲(chóng)、無(wú)破損、大小均勻、鱗莖整齊肥大的新鮮大蒜。在進(jìn)行原料處理時(shí)削去大蒜莖盤(pán)根須，莖要保留1 cm 左右的假莖，以防散瓣，并去掉包在蒜頭外面的大部分鱗片，根據(jù)所選用大蒜的老嫩只保留1～2 層內(nèi)皮，清水洗凈。清水浸泡時(shí)需漫過(guò)大蒜頭，使之浸泡均勻。大蒜鹽腌時(shí)按一層大蒜一層食鹽的方法進(jìn)行，并每天翻動(dòng)1 次。配制糖醋鹵汁時(shí)，先將食醋煮沸，再加入白砂糖進(jìn)行攪拌溶化，待鹵汁冷卻到30 ℃左右時(shí)倒入壇中進(jìn)行腌制。裝壇不宜過(guò)滿(mǎn)，離壇口3～6 cm 為宜[10]，裝壇完畢后蓋好壇口，進(jìn)行腌制后熟。

1.3.3 工藝優(yōu)化

通過(guò)改變清水浸泡時(shí)間，同時(shí)在保證相同浸泡時(shí)間的前提下，改變換水次數(shù)對(duì)大蒜進(jìn)行脫臭效果的對(duì)比；通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同料液比，腌制過(guò)程中每隔5 d 進(jìn)行1 次風(fēng)味分析，確定最短腌制成熟天數(shù)，最后結(jié)合感官鑒定，確定最佳腌制工藝。

1.3.4 感官評(píng)定

對(duì)糖醋蒜進(jìn)行的感官評(píng)價(jià)主要分為4 個(gè)方面，即色澤、體態(tài)、氣味、滋味。

糖醋蒜感官鑒定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.4 糖醋蒜理化指標(biāo)檢測(cè)

表1 糖醋蒜感官鑒定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

（1） 糖醋蒜的相關(guān)理化指標(biāo)按照醬腌菜國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10439—2007[11]中規(guī)定的理化指標(biāo)和相應(yīng)的GB/T 5009.54—2003[12]中規(guī)定的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。糖醋蒜中的水分按照GB/T 5009.3—2006[13]中直接干燥法操作、食鹽按照GB/T 5009.51—2003[14]中的方法操作、總酸按照GB/T 5009.51—2003[14]中的方法操作、總糖按照SB/T 10213-1994[15]中的方法測(cè)定。

（2） 羥基自由基的清除作用的測(cè)定。利用水楊酸作為捕獲劑與Fenton 反應(yīng)生成的羥基自由基結(jié)合，生成2,3 - 二羥基苯甲酸于波長(zhǎng)510 nm 處有最大吸收進(jìn)行羥基自由基的測(cè)定[16-18]。反應(yīng)體系包含了糖醋蒜提取液、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L 水楊酸溶液- 乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液。

取15 g 左右糖醋蒜樣品研磨至糊狀，加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇攪拌，超聲波浸提15 min，過(guò)濾后取清液定容至100 mL 得樣品提取液。在2 mL EP 管中分別加入稀釋10 倍的樣品提取液，樣品管加入9 mmol/L FeSO4溶液，9 mmol/L 水楊酸- 乙醇溶液，8.8 mmol/L H2O2溶液各300 μL。為了消除糖醋蒜樣品本身吸光度的影響，設(shè)置空白對(duì)照液。振蕩搖勻后放入37 ℃水浴鍋中水浴加熱30 min 后取出，分別吸取混合反應(yīng)液200 μL 于96 孔微孔板中，測(cè)定其在波長(zhǎng)510 nm 處的吸光度。清除率（D） 計(jì)算公式如下：

式中：D——評(píng)價(jià)糖醋蒜的抗氧化活性；

A1——樣品組反應(yīng)后測(cè)得的吸光度；

A2——不加H2O2溶液用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇代替的樣品溶液吸光度；

A3——用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇代替樣品對(duì)照組的吸光度；

A4——空白對(duì)照參比，體積分?jǐn)?shù)80%乙醇代替雙氧水及樣品溶液吸光度。

1.5 腸桿菌、霉菌指標(biāo)測(cè)定

腌制成熟后對(duì)糖醋蒜成品進(jìn)行微生物指標(biāo)檢定，微生物指標(biāo)測(cè)定按照GB/T 5009.54—2003《醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[12]執(zhí)行，按照GB 4789.3—2016[18]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》的方法進(jìn)行試驗(yàn)，大腸桿菌數(shù)≤30 個(gè)/100 g，致病菌不得檢出。

采用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） 培養(yǎng)基進(jìn)行大腸菌群的計(jì)數(shù)檢驗(yàn)，該培養(yǎng)基的配制及使用方法為：稱(chēng)取本品41.5 g，加熱溶解于1 000 mL 蒸餾水中，煮沸不超過(guò)2 min。取適宜稀釋度的樣品液1 mL，加入到無(wú)菌平皿中心，將涼至45 ℃左右的VRBA 10～15 mL 置于平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿將培養(yǎng)基與樣液混合。凝固后，再加3～4 mL VRBA 覆蓋平板表層，于37 ℃下倒置培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

采用孟加拉紅培養(yǎng)基檢測(cè)霉菌情況。取糖醋蒜發(fā)酵液，用無(wú)菌槍頭接種于孟加拉紅培養(yǎng)基上，無(wú)菌操作涂布3 個(gè)平板，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂（無(wú)水） 0.5 g，瓊脂20 g，孟加拉紅0.033 g，卡那霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL。

1.6 糖醋蒜中微生物分析

1.6.1 培養(yǎng)基

主要選用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行微生物篩選分離，LB液體培養(yǎng)基用于菌種培養(yǎng)，LB 液體培養(yǎng)基配制：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，于121 ℃下滅菌20 min 備用；每1 000 mL的LB 固體培養(yǎng)基需要在LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g 的瓊脂粉，滅菌備用。

1.6.2 菌株基因組DNA 提取與菌株16S rDNA 擴(kuò)增

利用苯酚- 氯仿法抽提獲得菌株基因組DNA[19]。根據(jù)提取的細(xì)菌基因組作為模板進(jìn)行擴(kuò)增16S rDNA。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA 序列保守性設(shè)計(jì)合成引物[20]，F(xiàn)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-G GTTAC CTTGTTACGACTT-3'。

根據(jù)試驗(yàn)需要設(shè)計(jì)50 μL 的PCR 反應(yīng)體系：37.5 μL 無(wú)菌超純水，5 μL 緩沖液，4 μL dNTP 上游引物F 和下游引物R 各1 μL，1 μL 模板DNA 和0.5 μL TaqDNA 聚合酶，通常第一步要先加37.5 μL無(wú)菌超純水。反應(yīng)步驟：94 ℃下預(yù)變性5 min→94 ℃下變性30 s→55 ℃下退火60 s→72 ℃下延伸90 s（包括30 個(gè)循環(huán)） →72 ℃下延伸5 min。PCR 成功后將樣品送上海生工生物測(cè)序。利用生物信息學(xué)軟件，結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息，制作菌株系統(tǒng)演化樹(shù)，分析菌株的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 清水浸泡脫臭效果分析

由試驗(yàn)可知，不同清水浸泡時(shí)間的脫臭效果不同，在相同浸泡時(shí)間下改變換水次數(shù)的脫臭效果也有差別。結(jié)果顯示，浸泡2 d 左右，換水4 次時(shí)對(duì)大蒜的脫臭效果最明顯。

不同浸泡時(shí)間和換水次數(shù)的脫臭效果對(duì)比見(jiàn)表2。

表2 不同浸泡時(shí)間和換水次數(shù)的脫臭效果對(duì)比

2.2 配方篩選

為了保證糖醋蒜特有風(fēng)味和口感，采用正交試驗(yàn)法篩選腌制輔料的最佳配方，由于使用食鹽水對(duì)大蒜進(jìn)行濕腌處理時(shí)，腌制效果較差，大蒜呈現(xiàn)水浸狀，嚴(yán)重影響糖醋蒜成品的外觀和口感，因此在試驗(yàn)腌制過(guò)程中均選用干腌處理2 d，即直接將食鹽撒在清水浸泡脫臭后的大蒜表面，腌制效果明顯。每組試驗(yàn)大蒜用量均為10 kg。最后對(duì)腌制成品進(jìn)行感官評(píng)定。

腌制料液配比正交試驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3 腌制料液配比正交試驗(yàn)

由表3 可知，糖醋大蒜腌制的最佳配料組合為A3B3C2，最佳的分析組合為A3B2C2，即每10 kg 的新鮮大蒜需要使用1 kg 的食鹽干腌，其料液配方為6 kg 食醋和3 kg 白砂糖。按照最佳分析組合進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，評(píng)分為92 分，成品糖醋蒜色澤呈紅褐色有光澤，具有良好的風(fēng)味，無(wú)異味，脆嫩爽口。

2.3 理化指標(biāo)與微生物指標(biāo)

理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

由表4 可知，部分理化指標(biāo)與SB/T 10439—2007（醬腌菜） 中規(guī)定指標(biāo)不符，但其適合當(dāng)?shù)厝说目谖?，這對(duì)當(dāng)?shù)靥谴姿鈾z測(cè)指標(biāo)的制定具有一定的參考價(jià)值；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） 培養(yǎng)基用于腸桿菌計(jì)數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在用于腸桿菌計(jì)數(shù)的VRBA 培養(yǎng)基中沒(méi)有菌落存在，說(shuō)樣品中不含腸桿菌。采用孟加拉紅培養(yǎng)基檢測(cè)糖醋蒜的霉菌情況，結(jié)果未培養(yǎng)出菌落，說(shuō)明無(wú)霉菌污染。

2.4 糖醋蒜樣品中微生物分離

通過(guò)分離，純培養(yǎng)獲得2 株形態(tài)各異的菌株，分別命名為C1，C2。

菌落圖片見(jiàn)圖1。

菌落特征為：C1 菌體為污白色，表面粗糙，不透明，邊緣不光滑、不規(guī)則，大致為圓形，中央成花狀；C2 菌體為乳白色，表面光滑，不透明，邊緣比較整齊，略呈半球狀凸起，實(shí)心菌落。由此初步斷定2 株菌株均屬于芽孢桿菌。

2.5 菌株16S rDNA 擴(kuò)增

分別提取出C1，C2 的細(xì)菌基因組，作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果顯示獲得單一清晰條帶，大小為1 500 bp 左右，樣品送到上海生工測(cè)序后獲得序列。

電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.6 菌株16S rDNA 序列與系統(tǒng)演化樹(shù)分析

將測(cè)序獲得的堿基序列放在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 分析，獲取高度相似序列。利用DNAMAN、Primer 等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析，并利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)演化樹(shù)。序列分析結(jié)果顯示分離出的2 株菌株均為芽孢桿菌屬，C1 菌株與Bacillus subtilis strain SB2（MH603612.1） 的相似性達(dá)到97.81%，C2菌株與Bacillus megaterium strain E2-04（MN525604.1） 的同源性達(dá)到99.79%。

C1 菌株演化樹(shù)見(jiàn)圖3，C2 菌株演化樹(shù)見(jiàn)圖4。

3 結(jié)論

我國(guó)大蒜產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，但大蒜加工產(chǎn)品仍舊缺乏系統(tǒng)深入開(kāi)發(fā)，需要將傳統(tǒng)加工技術(shù)進(jìn)行現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)化改進(jìn)，增加技術(shù)含量。開(kāi)展大蒜深加工研究，可以提高大蒜銷(xiāo)售的附加值，增加經(jīng)濟(jì)效益。

利用清水浸泡新鮮大蒜2 d，換水4 次時(shí)大蒜脫臭效果明顯。采用正交試驗(yàn)確定糖醋蒜腌制輔料的最佳參數(shù)組合為A3B2C2，即每10 kg 的新鮮大蒜需要使用1 kg 的食鹽干腌處理2 d，其料液配方為食醋6 kg，白砂糖3 kg。按照最佳組合進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，評(píng)分為92 分。腌制的糖醋蒜在腌制到35 d 左右時(shí)已經(jīng)具有商品價(jià)值，表現(xiàn)出成品糖醋蒜的感官指標(biāo)，如色澤、香氣、滋味、質(zhì)地等均符合相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。所檢測(cè)樣品中不含大腸桿菌和致病菌，不存在使用工業(yè)級(jí)原料的現(xiàn)象，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)適合當(dāng)?shù)厝丝谖兜奶谴姿猱a(chǎn)品，存在部分理化指標(biāo)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)不一致的情況，體現(xiàn)了糖醋蒜產(chǎn)品的地域特征[21]，在保證食品安全的前提下，可以制定糖醋蒜檢測(cè)的地方標(biāo)準(zhǔn)。

分離的2 株菌株均為芽孢桿菌屬，C1 菌株與Bacillus subtilis strain SB2（MH603612.1） 的相似性達(dá)到97.81%，C2 菌株與Bacillus megaterium strain E2-04（MN525604.1） 的同源性達(dá)到99.79%。芽孢桿菌被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、環(huán)境領(lǐng)域、化學(xué)農(nóng)藥的降解、微生物菌肥的生產(chǎn)、抗生素的合成、酶工業(yè)等領(lǐng)域[22-23]。在后續(xù)研究中，可以通過(guò)微生物分子生物學(xué)手段，分析菌株與發(fā)酵、風(fēng)味的關(guān)系，推動(dòng)傳統(tǒng)大蒜發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化，使其具有更高的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。