熒光定量PCR 技術在防控非洲豬瘟中的應用及其質量控制要點

丁小伍 李輝

(1，安徽省涇縣畜牧獸醫(yī)水產服務中心 242000；2，安徽省靈璧縣畜牧獸醫(yī)水產服務中心尹集畜牧獸醫(yī)水產站 234216)

非洲豬瘟傳入我國之后,對我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失和社會負面影響,準確檢測是防控非洲豬瘟疫情的一個重要手段。疫情發(fā)生至今,熒光定量PCR 檢測技術在非洲豬瘟防控中發(fā)揮了重要作用,本文主要從熒光定量PCR 技術簡介、熒光定量PCR 在非洲豬瘟防控中的應用、熒光定量PCR 檢測非洲豬瘟的質量控制要點等方面進行綜述。

1 熒光定量PCR 技術簡介

熒光定量PCR 是20 世紀末從美國引進的核酸定量檢測技術,現已廣泛應用于病原體檢測、遺傳疾病的早期診斷、轉基因檢測、遺傳育種、親自鑒定等,近年在動物疫病檢測中逐步得到廣泛應用,尤其是非洲豬瘟疫情發(fā)生后,一些縣級實驗室也配備了熒光PCR 檢測儀。

實時熒光定量PCR,是在PCR 反應體系中加入熒光染料或特異性熒光探針,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 進程,使每一個循環(huán)變得“可見”,最后通過Ct 值和標準曲線對樣品中的DNA 進行定性并對其起始濃度進行定量的技術。非洲豬瘟熒光PCR 檢測中,主要采用TaqMan 探針檢測法,在PCR 反應的退火階段,TaqMan 探針與靶序列DNA 特異性結合,在PCR 反應的延伸階段,結合的探針由于其Taq 聚合酶的核酸外切酶活性而被降解,供體熒光分子與受體熒光分子分離,熒光信號得到釋放,此時檢測熒光信號的強度,就可確定與DNA特異性結合的探針數量,間接測出模板DNA 量,理論上熒光信號強度與PCR 擴增產物一樣是呈指數型增長；但如果PCR過程中,模板不能與引物探針互補,探針將保持完整并處于游離狀態(tài),則不會釋放熒光信號。

與普通PCR 相比,熒光PCR 技術具有更高的靈敏度,臨床檢測結果表明一般要高出100 倍左右；熒光PCR 多一條探針,具有更強的特異性,可實現一管檢測多種疾病；全封閉的PCR 過程,無須后續(xù)處理,儀器自動分析,直接讀出結果。在2018 年農業(yè)農村部非洲豬瘟試劑評價中,熒光PCR 試劑占比70%以上,近2 年的實踐證明,熒光PCR 已成為非洲豬瘟檢測的主流技術。

2 熒光定量PCR 在非洲豬瘟防控中的應用

2.1 常規(guī)監(jiān)測

依靠熒光定量PCR 技術建立ASF 預警體系,定期開展監(jiān)測。對于未發(fā)生ASF 疫情的養(yǎng)殖場,重點放在異常豬、車輛、人員、生產資料、物品等能與外界接觸的環(huán)節(jié)和風險因素；對于周邊發(fā)生疫情的豬場,可先檢測外面環(huán)境和人員,再檢測場區(qū)內環(huán)境,一般不輕易檢測豬群；如果場內出現了問題,可對生豬各單元環(huán)境進行檢測,主要是料槽、水管等環(huán)節(jié),同時對異常豬群及其鄰近豬群采樣監(jiān)測。

2.2 引種檢測

引進種豬前,必須要全面了解供種場的基本情況,采集口鼻拭子、豬血液、環(huán)境拭子樣本進行非洲豬瘟檢測,保證所供種豬安全,引進精液也是如此。引種前一般雙方先要確定檢測方案,明確采樣數量、采樣類型,由誰來采樣,由誰來檢測,保證檢測結果的準確性,確保雙方利益。國家最新修訂的《生豬產地檢疫規(guī)程》和《跨省調運乳用種用動物產地檢疫規(guī)程》明確要求對種豬調運前必須進行非洲豬瘟檢測,《農業(yè)農村部關于規(guī)范生豬及生豬產品調運活動的通知》（農牧發(fā)〔2018〕23 號）對檢測樣品類型和數量進行了規(guī)定。

2.3 復養(yǎng)檢測

發(fā)生非洲豬瘟疫情的豬場復養(yǎng)前評估和復產過程中都離不開檢測。復產前,首先要對場內疫源清除和滅活情況進行評估,對環(huán)境進行采樣檢測,對進場物料進行評估檢測；引入生豬后,要密切關注豬群,發(fā)現異常情況,及時檢測排除風險。

2.4 精準清除

熒光定量PCR 是進行精準清除的重要手段,多數年出欄5000 頭以上養(yǎng)殖場都已建立了熒光PCR 檢測室。豬場出現異常時,依靠檢測手段和流行病學調查,密切關注豬群,及時清除風險豬群。精準清除中,采樣的合理和規(guī)范至關重要,一般口鼻拭子樣品的檢出時間要比血液早3 天左右,但口鼻拭子病毒含量較低,對檢測靈敏度要求較高,采樣技術要求較高,很多養(yǎng)殖場采用皮膚扎出少量血液與拭子樣品混樣檢測方式進行,這樣不容易漏檢,拭子采樣可使用拭子咀嚼也可采用商品化的采樣包。

2.5 屠宰檢測

當前生豬價格高,控制風險豬只屠宰后進入市場對防控很關鍵,一旦陽性豬肉流入市場,那么傳染鏈條可直接到達養(yǎng)殖場,引發(fā)疫情。農業(yè)農村部119 號公告要求屠宰場對宰后暫存血液進行抽樣檢測,我省對此進行了全面部署,宰后檢測方法均為熒光定量PCR。

3 熒光定量PCR 檢測非洲豬瘟的質量控制要點

3.1 實驗室嚴格分區(qū)

熒光定量PCR 檢測技術靈敏,極其微量的污染即可造成假陽性,對PCR 實驗室進行分區(qū)管理可以避免檢測污染。一般將實驗室分為試劑準備區(qū)、核酸提取區(qū)、PCR 擴增區(qū),每個區(qū)的物品固定,不交叉使用,并做到相對獨立。

3.2 規(guī)范操作

從事檢測的人員必須經培訓合格后上崗,切實掌握實驗原理和操作步驟。試驗操作不規(guī)范,移液器操作不當,容易使移液器與不同試劑和樣品之間發(fā)生交叉污染,而造成檢測結果錯誤。養(yǎng)殖場或屠宰場應加強檢測人員培訓,提高檢測能力和實驗分析能力,這樣即使出了問題,也很容易找到根源。

3.3 做好質控體系

目前主要采用陰性對照和陽性對照對整個實驗過程進行質控,陰性對照和陽性對照直接參與樣本提取過程,能夠質控整個實驗過程。但當前很多實驗室,陽性對照和陰性對照沒有參與提取過程,這樣不能監(jiān)控提取過程是否有誤或提取試劑是否失效。

3.4 核酸污染的處理措施

核酸污染是影響結果準確性的重要因素之一,導致假陽性結果的出現。預防核酸污染,首先要規(guī)范處理PCR 產物,可經過消毒液浸泡、高壓、危廢回收；為防止PCR 管開蓋而形成高濃度核酸氣溶膠,造成環(huán)境污染,可選擇優(yōu)質的PCR 反應管,上機前蓋緊PCR 管。消除DNA 片段可采用商品化的DNA 去除劑噴灑擦拭,使用紫外燈照射,加強通風,也有的向空中噴水而使DNA 溶于水中；對于污染的移液器要進行清洗或高壓,實驗臺面和生物安全柜可用DNA 去除劑擦拭,PCR 儀用DNA去除劑擦拭和紫外燈照射。