高效液相色譜法測(cè)定油茶餅粕多糖組成

李怡欣，張盟雨，王 頌，王 靜，張應(yīng)中，謝桂軍，李興偉

(廣東省林業(yè)科學(xué)研究院 廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510520)

植物多糖是一種來源廣泛的天然高分子化合物，一般由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖等單糖及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等組成[1]。多糖不僅可作為能量資源和結(jié)構(gòu)材料，還參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)，具有抗氧化、降血糖、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2]。目前紫芝多糖、香菇多糖、黃芪多糖、豬苓多糖、人參多糖等植物多糖產(chǎn)品已被應(yīng)用于治療神經(jīng)衰弱、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等醫(yī)藥領(lǐng)域[3]。油茶(CamelliaoleiferaAbel)，為山茶科山茶屬，常綠小喬木或灌木，是我國(guó)特有的多年生木本油料作物。在優(yōu)化的工藝條件下，可從油茶餅粕、油茶果殼、油茶籽殼中分別提取11.29%[4]、5.42%[5]、0.27%[6]的多糖。油茶餅粕多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等功能[7-9]。油茶餅粕作為油茶籽榨油的副產(chǎn)物，年產(chǎn)量約40萬t[7]，而目前國(guó)內(nèi)大部分油茶餅粕被用作肥料及飼料的原材料。分析油茶餅粕多糖的組成，對(duì)進(jìn)一步研究油茶餅粕多糖的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系及生物活性等具有重要的意義，有利于促進(jìn)油茶餅粕的高效利用，延長(zhǎng)油茶加工產(chǎn)業(yè)鏈。

多糖的組成分析一般需先將多糖水解成單糖，再利用薄層色譜[10]、氣相色譜[11]、液相色譜[12]等方法對(duì)單糖進(jìn)行分離分析。在液相色譜法中，可用C18柱[13]、氨基(NH2)柱[14]、離子交換柱[15]、糖分析柱[16]等進(jìn)行單糖分離，再用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)[17]、示差折光檢測(cè)器(RID)[18]、紫外檢測(cè)器(UV)[13]、串級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)器(MS/MS)[14]等進(jìn)行檢測(cè)。NH2柱是利用柱上氨丙基與單糖分子的—OH的氫鍵強(qiáng)度不同，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同單糖的分離；非極性的C18柱對(duì)單糖的保留較弱，但單糖經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后極性降低，故可利用C18柱分離。RID檢測(cè)利用了單糖分子折光活性；單糖本身雖不產(chǎn)生紫外吸收信號(hào)，但其PMP衍生化產(chǎn)物具有生色團(tuán)，故可用UV檢測(cè)；MS/MS適用范圍廣，靈敏度高，也可應(yīng)用于單糖分析。

本研究首次對(duì)比了3種分析油茶餅粕多糖組成的高效液相色譜方法，即NH2柱-RID法、NH2柱-MS/MS法和PMP柱前衍生-C18柱-UV法，并對(duì)優(yōu)選的PMP柱前衍生-C18柱-UV法進(jìn)行分析方法驗(yàn)證，以期為油茶餅粕多糖的定量分析及高值開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，以利于油茶產(chǎn)業(yè)的綜合發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶餅粕多糖樣品，由廣東省林業(yè)科學(xué)研究院油茶研究團(tuán)隊(duì)提供，已經(jīng)脫蛋白、脫色素處理。乙腈(色譜純)，歐普森試劑；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，麥克林試劑；葡萄糖(Glc)，國(guó)藥試劑；阿拉伯糖(Ara，98%)、甘露糖(Man，98%)、半乳糖(Gal，99%)、鼠李糖(Rha，98%)、木糖(Xyl，99%)、葡萄糖醛酸(GlcUA，98%)、半乳糖醛酸(GalUA，97%)，源葉生物科技有限公司；硫酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、三氯甲烷均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；超純水，由Synergy UV純水系統(tǒng)(德國(guó)默克密理博公司)制備。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LC-30AD高壓泵、SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-30A柱溫箱、RID-10A示差折光檢測(cè)器、LCMS 8040三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；CO-1000柱溫箱，武漢恒信世紀(jì)科技有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；0.22 μm聚砜醚(PES)針式過濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及分析

分別準(zhǔn)確稱取鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解配制成單標(biāo)溶液。取適當(dāng)體積的若干種單標(biāo)溶液混合，配制成混標(biāo)溶液。分別采用NH2柱-RID法、NH2柱-MS/MS法及PMP柱前衍生-C18柱-UV法進(jìn)行分析。

1.2.2 NH2柱-RID法分析

取一定質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液直接進(jìn)樣分析。色譜條件：InertSustain NH2分析柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，島津技邇)，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為水-乙腈(體積比20∶80)，流速1.4 mL/min。

1.2.3 NH2柱-MS/MS法分析

取一定質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液直接進(jìn)樣分析。色譜條件：InertSustain NH2分析柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，島津技邇)，InertSustain NH2保護(hù)柱(10 mm×4.0 mm×5 μm，島津技邇)，柱溫35℃，進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相為水-乙腈(體積比20∶80)，流速1.1 mL/min(柱后連接三通，進(jìn)MS流速約為0.4 mL/min)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，脫溶劑管溫度150℃，加熱塊溫度450℃，離子源電壓-3.5 kV，霧化氣流速2.5 mL/min，干燥氣流速10 L/min，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)(具體條件見表1)。

表1 NH2柱-MS/MS法分析單糖的MRM條件

1.2.4 PMP柱前衍生-C18柱-UV法

取一定質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液，按參考文獻(xiàn)[13,19]進(jìn)行衍生化。具體如下：取40 μL待測(cè)樣品于1.5 mL聚丙烯離心管中，依次加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液50 μL和0.3 mol/L氫氧化鈉溶液50 μL，渦旋混勻后置于70℃烘箱中，反應(yīng)1 h后取出，冷卻至室溫。再加入0.3 mol/L鹽酸溶液50 μL，混勻后用1 mL三氯甲烷萃取，小心棄去有機(jī)層，重復(fù)3次。加入100 μL去離子水，混勻后用0.22 μm PES針式過濾器過濾，待高效液相色譜分析。

色譜條件：InertSustain C18分析柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，島津技邇)，InertSustain C18保護(hù)柱(10 mm×4.0 mm×5 μm，島津技邇)，柱溫35℃；檢測(cè)器波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量15 μL；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈-0.5 mol/L磷酸緩沖溶液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)(體積比15∶85)，流動(dòng)相B為乙腈-0.5 mol/L磷酸緩沖溶液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)(體積比40∶60)，梯度見表2。

表2 PMP柱前衍生-C18柱-UV法分析單糖的流動(dòng)相梯度

1.2.5 油茶餅粕多糖樣品分析

取0.250 g多糖樣品，加入約60 mL 2 mol/L稀硫酸，120℃加熱水解4 h，冷卻至室溫，上清液加0.2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH約為7，并用超純水定容至50 mL。按照1.2.4步驟進(jìn)行衍生化和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種高效液相色譜法(HPLC)的單糖混標(biāo)分析結(jié)果

2.1.1 NH2柱-RID法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2種糖醛酸具備折光信號(hào)，這與文獻(xiàn)[20]報(bào)道相符。但采用NH2柱-RID法檢測(cè)時(shí)，糖醛酸并未出峰，這可能與流動(dòng)相pH、組成等因素有關(guān)[21-22]。對(duì)鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的混標(biāo)溶液(質(zhì)量濃度均為10 g/L)進(jìn)行檢測(cè)，HPLC譜圖如圖1所示。

注：1.鼠李糖;2.木糖;3.阿拉伯糖;4.甘露糖;5.葡萄糖;6.半乳糖。

由圖1可知，目標(biāo)物質(zhì)在8 min內(nèi)出峰。該法具備不需對(duì)多糖水解產(chǎn)物進(jìn)行再處理、分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于測(cè)定谷物類、乳制品、果蔬制品、蜂蜜、糖漿、飲料等食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中[23]，但未能將油茶餅粕多糖中的2種目標(biāo)戊糖(木糖、阿拉伯糖)和3種目標(biāo)己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)完全分開。由于采用RID，因此也無法進(jìn)行梯度淋洗以獲得更好的分離度，且信號(hào)受柱溫和流動(dòng)相流速影響較大。以3倍信噪比計(jì)算，6種單糖的檢出限在4 823～9 846 ng，靈敏度較低。此外，單糖中的羰基可能與色譜柱固定相中的—NH2發(fā)生反應(yīng)生成席夫堿[24]，導(dǎo)致柱效降低、柱壽命縮短。因此，該法不能滿足油茶餅粕多糖的單糖組成分析要求。

2.1.2 NH2柱-MS/MS法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在優(yōu)化的MRM條件下，6種單糖和2種糖醛酸均具有質(zhì)譜響應(yīng)。但連接上NH2柱時(shí)，糖醛酸并未出峰，原因與2.1.1分析的NH2柱-RID法的相同。對(duì)鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的混標(biāo)溶液(質(zhì)量濃度均為200 mg/L)進(jìn)行檢測(cè)，HPLC譜圖如圖2所示。

由圖2可見，目標(biāo)物質(zhì)在10 min內(nèi)出峰。6種單糖的出峰順序與NH2柱-RID法一致。與RID法相比，由于MRM所選擇的離子對(duì)不同，因此避免了鼠李糖與其他戊糖、己糖譜圖的互相干擾。但2種戊糖(木糖、阿拉伯糖)之間、3種己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)之間的分離度仍然沒有改善。以3倍信噪比計(jì)算，6種單糖的檢出限為3.53～8.39 ng，靈敏度較RID法約提高3個(gè)數(shù)量級(jí)。該法與NH2柱-RID法一樣，具有不需對(duì)多糖水解產(chǎn)物進(jìn)行再處理、分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，并克服了RID靈敏度低的缺點(diǎn)。缺點(diǎn)是同分異構(gòu)體之間未能完全分離，糖羰基可能與NH2柱反應(yīng)導(dǎo)致色譜柱受損。此外，多糖水解產(chǎn)物中的鹽或其他雜質(zhì)可能影響目標(biāo)物質(zhì)的離子化效率，并對(duì)離子源造成污染，儀器成本和維護(hù)成本較高。

注：1.鼠李糖;2.木糖;3.阿拉伯糖;4.甘露糖;5.葡萄糖;6.半乳糖。

2.1.3 PMP柱前衍生-C18柱-UV法

利用PMP柱前衍生-C18柱-UV法對(duì)鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的混標(biāo)溶液(質(zhì)量濃度均為55 mg/L)進(jìn)行分離分析，所得HPLC譜圖如圖3所示。

注：1.甘露糖;2.葡萄糖醛酸;3.鼠李糖;4.半乳糖醛酸;5.葡萄糖;6.半乳糖;7.木糖;8.阿拉伯糖。

由圖3可見，在流動(dòng)相的梯度淋洗下，甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的PMP衍生物在17～35 min依次出峰，13.8 min處的峰歸屬于殘留的PMP。除木糖與阿拉伯糖外，其他4種單糖衍生物均能得到較好的基線分離，分離效果較NH2柱好；8種目標(biāo)物質(zhì)的檢出限在0.26～4.31 ng，靈敏度高。該法所用的色譜柱和檢測(cè)器較前兩種方法更普遍、易得、易維護(hù)。缺點(diǎn)是衍生化步驟較煩瑣，衍生化過程中可能導(dǎo)致樣品損失或引入雜質(zhì)，需仔細(xì)操作。

3種分析方法的檢出限對(duì)比見表3。綜合比較3種分析方法的靈敏度優(yōu)缺點(diǎn)，決定采用PMP柱前衍生-C18柱- UV法檢測(cè)油茶餅粕多糖樣品的組成，并對(duì)其進(jìn)行分析方法驗(yàn)證。

表3 3種分析方法的檢出限對(duì)比 ng

2.2 PMP柱前衍生-C18柱-UV法分析方法驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍及檢出限(LOD)、定量限(LOQ)

配制不同質(zhì)量濃度的單糖與糖醛酸混標(biāo)溶液，并按照1.2.4步驟進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，擬合線性方程，對(duì)最低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋、測(cè)定，按信噪比分別為3、10計(jì)算檢出限和定量限，結(jié)果見表4。

表4 6種單糖和2種糖醛酸的線性范圍、擬合方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)

由表4可知，各衍生物峰面積與單糖/糖醛酸質(zhì)量濃度之間線性良好，線性系數(shù)均大于0.99，檢出限為0.02～0.29 mg/L，定量限為0.06～0.96 mg/L。

2.2.2 加標(biāo)回收率和精密度

取一個(gè)已知單糖組成的油茶餅粕多糖樣品，分別按照50%、100%、150%3個(gè)加標(biāo)水平添加6種單糖和2種糖醛酸的混標(biāo)溶液，每個(gè)水平制備5個(gè)平行樣。按照1.2.5方法測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表5。

表5 6種單糖和2種糖醛酸的加標(biāo)回收率(n=5)

取一個(gè)已完成衍生化的樣品溶液，在同一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次并計(jì)算各組分的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，即得日內(nèi)精密度。連續(xù)6 d測(cè)定該溶液，并計(jì)算各組分的保留時(shí)間和峰面積的RSD，即得日間精密度，結(jié)果見表6。8種PMP衍生物的峰面積日間變化見圖4。

表6 6種單糖和2種糖醛酸的日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6) %

注：1.甘露糖;2.葡萄糖醛酸;3.鼠李糖;4.半乳糖醛酸;5.葡萄糖;6.半乳糖;7.木糖;8.阿拉伯糖。

由表5可知，6種單糖的加標(biāo)回收率為77.2%～111.9%，2種糖醛酸的加標(biāo)回收率偏低，為60.1%～87.0%，可能與糖醛酸分子易發(fā)生內(nèi)酯化有關(guān)[25]。

由表6可知，6種單糖保留時(shí)間的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.08%～0.12%和0.61%～1.04%，峰面積的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.08%～3.77%和0.39%～4.38%。其中甘露糖的峰面積精密度較其他5種單糖低(除鼠李糖的日間RSD)，這與所測(cè)樣品中甘露糖含量較低有關(guān)。葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸保留時(shí)間的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.11%、0.12%和1.07%、1.19%，峰面積的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.90%、1.83%和17.15%、15.85%。2種糖醛酸的峰面積日內(nèi)RSD較小，但從2 d開始呈現(xiàn)出峰面積逐漸減小的趨勢(shì)(見圖4)，可能因糖醛酸易發(fā)生內(nèi)酯化而導(dǎo)致衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定。綜上，該方法測(cè)定甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖的精密度高，測(cè)定葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸時(shí)日內(nèi)精密度高，日間精密度較低。為減小誤差，建議糖醛酸的標(biāo)液現(xiàn)配現(xiàn)用，并在衍生化后的1 d內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

2.3 油茶餅粕多糖樣品分析

依據(jù)1.2.5的方法對(duì)4個(gè)未知的油茶餅粕多糖樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表7。

表7 油茶餅粕多糖樣品的檢測(cè)結(jié)果 mg/g

由表7可知，4個(gè)油茶餅粕多糖樣品均含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，此外樣品1和樣品2還含有少量甘露糖，單糖及糖醛酸總含量為32.8～93.8 mg/g。4個(gè)樣品中含量最高的均為葡萄糖，分別占單糖和糖醛酸總量的85.0%、54.0%、35.2%和29.8%。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)比了3種分析油茶餅粕多糖的單糖組成的高效液相色譜方法，并建立了稀酸水解與PMP柱前衍生-C18柱-UV法相結(jié)合的測(cè)定油茶餅粕多糖組成的方法。該法可同時(shí)測(cè)定6種單糖和2種糖醛酸含量，靈敏度高，檢出限低，分離效果較好，可為油茶多糖的高值開發(fā)利用提供技術(shù)支撐，有利于促進(jìn)油茶產(chǎn)業(yè)的綜合發(fā)展。