昌化江河谷隔離對海南島特有植物盾葉苣苔遺傳多樣性的影響

李歌 凌少軍 陳偉芳 任明迅 唐亮

摘 要：? ?為評估盾葉苣苔的遺傳多樣性與遺傳分化格局，探索影響盾葉苣苔遺傳變異地理分布的因素，該研究采集盾葉苣苔（Metapetrocosmea peltata）11個種群172份材料，通過PCR擴增和測序分析核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列的變異式樣。結(jié)果表明：（1）盾葉苣苔物種水平的遺傳多樣性很高（HT=0.998， π=0.023 5），種群間基因流很弱（Nm=0.04）且存在強烈的遺傳分化（GST=0.375）。（2）單倍型分析顯示，盾葉苣苔的單倍型大多是種群特異的，僅白馬嶺與南茂嶺種群有共享單倍型。（3）Mantel test表明，遺傳距離和地理距離存在一定相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r=0.322，P=0.010）。（4）Structure聚類分析將盾葉苣苔劃分為6種遺傳成分，其地理分布與昌化江河谷導致的隔離樣式基本一致，基于Nei遺傳距離的種群聚類分析支持這一結(jié)果，顯示盾葉苣苔遺傳多樣性的分布受到昌化江河谷的隔離作用。（5）AMOVA分析確定67%的變異來自地區(qū)間，表明地理隔離是盾葉苣苔種群分化的重要因素。這表明昌化江及其支流所引起的海南島山地內(nèi)部隔離是盾葉苣苔種群發(fā)生強烈遺傳分化的重要原因，從而導致盾葉苣苔在物種水平具有較高的遺傳多樣性。上述研究結(jié)果為海南特有苦苣苔資源盾葉苣苔的保護和可持續(xù)利用提供了理論指導，將有助于理解海南島特有植物和其他海島植物遺傳變異的地理分布及其影響因素。

關(guān)鍵詞：? 盾葉苣苔， 遺傳多樣性， 遺傳結(jié)構(gòu)， 地理隔離， 島嶼特有種

中圖分類號：? ?Q948.15

文獻標識碼：? ? A

文章編號：? ?1000-3142（2020）10-1505-09

Effects of geographic isolation caused by Changhua River on genetic diversity of Hainan-endemic Metapetrocosmea peltata （Gesneriaceae）

LI Ge1， LING Shaojun1， CHEN Weifang1， REN Mingxun1， TANG Liang1，2*

（ 1. Research Center for Terrestrial Biodiversity of South China Sea， Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China; 2. Institute of Tropical Rain Forest National Park， Hainan University， Haikou 570228， China ）

Abstract：? ?Metapetrocosmea peltata （Gesneriaceae） is an endemic species distributed in the middle and southern mountainous area of Hainan Island. In this study， we collected 172 M. peltata individuals from 11 natural populations， and assessed the genetic diversity and differentiation of this species based on sequence variation of intergenic transcribed spacer （ITS） region. In addition， the factors that may impact the level and distribution of genetic diversity were explored. The results were as follows： （1） M. peltata had a high level of genetic diversity at its species level （HT=0.998， π=0.023 5）， however， the gene flow between populations was very weak （Nm=0.04）， whereas the genetic differentiation was quite strong （GST=0.375）. （2） Most haplotypes of M. peltata were population specific， only except for BM and NM populations， which shared a few haplotypes. （3） Mantel test showed that the genetic distances between haplotypes were correlated with their geographic distances （correlation index r=0.322， P=0.010）. （4） Structure analysis clustered individuals of M. peltata into six genetic groups， whose geographic distributions were largely concordant with the isolation pattern of Hainan mountainous area caused by Changhua River. The geographic distribution of genetic clusters was further supported by population cluster analysis based on Neis genetic distance. This study manifests the isolation effect of Changhua River on the distribution of genetic diversity of M. peltata. （5） AMOVA analysis showed that 67% genetic variation was partitioned among populations， suggesting genetic differentiation of this species was mainly caused by geographic isolation. In conclusion， geographic isolation of Hainan mountainous area caused by Changhua River and its tributaries should be the driving force for the strong genetic differentiation among M. peltata populations， and also may lead to the high genetic diversity detected at the species level of M. peltata. This study not only provides recommendation for efficient conservation and utilization of M. peltata， a potential ornamental plant species， but also facilitates the understanding of geographic distribution of genetic variation for Hainan Island endemic and other plant species.

Key words：? ?Metapetrocosmea peltata， genetic diversity， genetic constructure， geographic isolation， island endemic species

島嶼物種的分布區(qū)通常比較狹小，種群規(guī)模小，基因流受島嶼復雜地形的影響而減弱或阻斷，是研究種群遺傳分化的理想材料（王中生等， 2004）。島嶼的氣候、地形等因素會影響種群的大小與分布，進而影響其遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)（Stuessy et al.， 2014）。海南島具有明顯的地形特征，五指山和鸚哥嶺為海南最高峰，以其為中心向外圍海拔逐漸降低（邢福武， 2012）。昌化江為海南第二大河，它發(fā)源于瓊中空禾嶺，橫貫海南島的中西部，自東北向西南流經(jīng)瓊中五指山，在樂東縣轉(zhuǎn)向西北，經(jīng)東方市和昌江縣向西匯入北部灣（周祖光， 2015）。昌化江支流眾多，將海南島中南部山地分割為不連續(xù)的地理區(qū)域，這種地形特點對海南特有植物遺傳多樣性和遺傳分化的影響目前并沒有得到深入研究。

苦苣苔科（Gesneriaceae）植物大多具有獨特的花形與花色和良好的耐蔭性，觀賞價值極高，因而受到廣泛關(guān)注（溫放， 2008; 代正福和羅冠勇， 2009; 史佑海等， 2011）。中國苦苣苔科植物均屬于苦苣苔亞科，海南島及其附近地區(qū)是苦苣苔亞科的多樣性熱點地區(qū)之一（李振宇和王印政， 2005; 韋毅剛等， 2010; 許為斌等， 2017）。海南島共有24種苦苣苔亞科植物，包括2個特有屬和8 個特有種（含1變種）（韋毅剛等， 2010; 邢福武， 2012）。昌化江及其支流是導致海南島中南部山地彼此隔離的重要因素，海南苦苣苔科植物的起源與進化很可能受到昌化江河谷以及島嶼地質(zhì)歷史的影響（王策等， 2015; 凌少軍等， 2017）。

盾葉苣苔（Metapetrocosmea peltata）隸屬于苦苣苔科盾葉苣苔屬，為單種屬，是海南特有種，通常生長在海拔400～800 m的濕潤巖壁上或石壁夾縫中，種群呈斑塊分布，對生境要求嚴格。近年來，由于氣候變化、局部地區(qū)干旱加劇、溪流干涸，導致盾葉苣苔部分種群縮減甚至滅絕，現(xiàn)已被列入易危物種名單（韋毅剛等， 2010）。盾葉苣苔現(xiàn)存種群的遺傳變異是否充足，昌化江引起的海南島中南部山地隔離是否影響了盾葉苣苔遺傳變異的地理分布，如何有效地保護盾葉苣苔的遺傳多樣性，這些問題尚未得到解答。核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）替換速率快、測序難度小，常用于近緣類群的系統(tǒng)發(fā)育與種群遺傳學研究（段義忠等， 2010; 王曉雄等， 2011）。本研究選用ITS標記分析海南特有種盾葉苣苔的種群遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)，探究海南島地理格局對盾葉苣苔種群遺傳變異水平與空間分布的影響，為海南特有種的起源、進化和保育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采集了盾葉苣苔11個種群共172份樣本，采樣點覆蓋該種在海南島的主要分布地點（韋毅剛， 2010）。野外采集生長良好、無病斑的幼葉，用硅膠快速干燥后帶回實驗室，每種群采集11～21個體（表1）。昌化江及其支流將這11個種群分割在3塊不連續(xù)的區(qū)域中，其中獼猴嶺（JX）、鸚哥嶺（YG）、霸王嶺（BW）、南高嶺（NG）與黎母山（LM）種群位于昌化江以北側(cè)，尖峰嶺（JF）與仙安石林（XA）種群大體位于昌化江的西南，其余種群分布在昌化江的東南。同側(cè)種群被溝谷與河流進一步分割（圖1）。

1.2 DNA提取和PCR擴增、測序

采用改良的CTAB法 （Doyle， 1990），從硅膠干燥的葉片中提取總DNA。由通用引物ITS4（5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）和ITS 5HP（5′ GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG 3′）（White et al.， 1990）擴增盾葉苣苔的ITS片段。

PCR擴增體系為25 μL，包括17 μL去離子水，2.5 μL 10× 緩沖液，0.5 μL 10 mM dNTps，5 μmol·L-1引物各0.5 μL，1 μL DNA模板和0.5 μL 5 U·μL-1 Taq酶。ITS片段擴增程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)36次，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送廣州天一輝遠生物科技有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

先用ContigExpress 2014對測序結(jié)果手工校正，然后通過MEGA 6.0 （Kumar et al.， 2008）程序構(gòu)建序列比對。用DnaSP 5.1 （Librado & Rozas， 2009）確定單倍型，并計算單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（π）、種群間平均基因流（Nm）和居群間遺傳分化系數(shù)（FST）。采用PERMUT （Pons & Petit， 1996）軟件計算種群內(nèi)平均遺傳多樣性

（HS）、物種水平總遺傳變異（HT），以及遺傳分化系數(shù)（GST和NST）。GST只考慮單倍型的頻率，NST考慮了單倍型的頻率和序列差異（Raymond & Rousset， 1995）。NST大于GST通常表明種群存在譜系地理結(jié)構(gòu)，其顯著性通過1 000次置換進行檢驗。使用GenAlEx 6.5 （Peakall & Smouse， 2012）進行AMOVA （Analysis of Molecular Variance）分析，將總遺傳變異在種群內(nèi)、種群間與地區(qū)間三個層次上進行剖分。用Mantel檢驗（Mantel， 1967）比較盾葉苣苔種群遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性，通過10 000次隨機重復檢驗顯著性。采用Network 5.0 （Bandelt， 1999）的中點連接法（Median-joining Networks）對盾葉苣苔11個種群構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。種群遺傳結(jié)構(gòu)用Structure 2.3.4分析，MCMC鏈起始的105世代不計入似然值計算，隨后重復抽樣106世代。K代表遺傳成分的種數(shù)，其取值范圍設(shè)置為1～11，對于每個K重復10次聚類分析，將10次運算的平均似然值作為每個K的似然值。聚類模型假定種群可以混合，且等位基因頻率是相關(guān)的（Pritchard et al.， 2000）。使用Structure Harvester進行DeltaK作圖分析，以確定最優(yōu)K值，即最可能的遺傳成分的數(shù)目（Evanno et al.， 2005）。將Structure輸出結(jié)果上傳至CLUMPAK server繪制遺傳結(jié)構(gòu)圖（Jakobsson & Rosenberg， 2007）?；贜ei遺傳距離使用MEGA 6.0中的鄰接法構(gòu)建盾葉苣苔地理種群的聚類關(guān)系圖（Tamura et al.， 2013）。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異

經(jīng)比對，ITS序列的長度為647 bp，一共檢測到64個變異位點，包括7個堿基插入缺失突變。種群BM和QX的變異位點比例最高，為0.92%;種群NG的ITS序列沒有變異;其余種群的變異位點比例在0.15%～0.77%之間（表1）。

2.2 單倍型多樣性與地理分布

基于ITS序列共發(fā)現(xiàn)42個單倍型，盾葉苣苔種群的單倍型個數(shù)從1～7不等（表1）。大部分種群擁有獨特的單倍型，只有地理距離較近的種群BM和NM共享了單倍型H28、H30和H31。盾葉苣苔種群的單倍型多樣性較高，除種群NG僅有1種單倍型外，其余種群均有2種以上的單倍型，單倍型多樣性在0.381 0～0.909 1之間。

盾葉苣苔的單倍型網(wǎng)絡(luò)具有清晰的地理結(jié)構(gòu)。不同種群的單倍型在網(wǎng)絡(luò)圖上處于相對獨立的位置，地理距離近的種群其單倍型的遺傳距離也較近（圖2）。根據(jù)單倍型網(wǎng)絡(luò)可以大致將盾葉苣苔的11個采樣種群劃分為6組：Ⅰ： YG;Ⅱ： JX;Ⅲ： NG與BW;Ⅳ： LM;Ⅴ： JF與XA;Ⅵ： BM、NM、QX與WZ（圖2）。組內(nèi)單倍型的遺傳距離（0.004±0.003）遠小于組間單倍型的遺傳距離（0.026±0.006）。

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳分化

DeltaK作圖分析發(fā)現(xiàn)K=6時DeltaK取得最大值（圖3：A）。盾葉苣苔6種遺傳成分的地理分布與基于單倍型網(wǎng)絡(luò)劃分的6組種群完全對應(yīng)（圖3：B）。位于昌化江以北的5個種群，除BW與NG共享同一成分（Ⅲ），其余種群均由獨特遺傳成分構(gòu)成。位于昌化江西側(cè)及南側(cè)的JF與XA由成分V構(gòu)成，位于昌化江東南的4個種群（QX、WZ、NM與BM）由成分VI構(gòu)成（圖3：B）。這6種遺傳成分的地理分布與海南島中南部山地的隔離樣式基本吻合（圖1）。盾葉苣苔種群聚類分析結(jié)果與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖和Structure分析結(jié)果一致。相同遺傳成分的種群首先聚為單系進化支。昌化江東南側(cè)4個種群構(gòu)成的進化支與其余種群的遺傳距離較遠，分布在昌化江北側(cè)和西南的種群則構(gòu)成另一進化支（圖4）。種群YG和西南部的JF、XA聚在一起，而位于昌化江以北的種群JX、BW、NG與LM構(gòu)成一單系，其單倍型彼此遺傳距離較?。▓D2）。

將上述6種遺傳成分所在種群的地理分布區(qū)作為地區(qū)層次進行AMOVA分析。表2結(jié)果顯示，地區(qū)間、種群間與種群內(nèi)的遺傳變異分別占總變異量的67%、27%和6%，揭示盾葉苣苔的遺傳變異主要來源于不同地區(qū)種群的遺傳差異。DnaSP估計種群間的平均基因流Nm=0.04，種群間遺傳分化系數(shù)FST=0.8。Mantel test顯示地理距離和遺傳距離存在一定相關(guān)性（相關(guān)性系數(shù)r=0.322，P=0.010）?；趩伪缎陀嬎愕亩苋~苣苔總遺傳多樣性HT=0.998 （±0.012 1），種群內(nèi)平均遺傳多樣性HS=0.624 （±0.076 8），而基于DNA序列計算的盾葉苣苔物種水平核苷酸多樣性π=0.023 5，單種群核苷酸多樣性在0～0.004 6之間，遠低于物種水平的遺傳多樣性。度量種群遺傳分化的指數(shù)GST和NST分別為0.375±0.078 1和0.933±0.015 2，NST顯著大于GST （P<0.001）。

3 討論與結(jié)論

3.1 海南島地理隔離對盾葉苣苔遺傳變異空間分布的影響

本研究中，昌化江河谷將海南島中南部山地分割，形成山地內(nèi)部彼此隔離的地理格局。隔離將減弱甚至阻斷基因交流，是種群遺傳分化的主要原因（Slatkin， 1987; Ouborg， 1999; Manel et al.， 2003）。通常GST > 0.25，表明種群間有很強的遺傳分化（Buso et al.， 1998）。盾葉苣苔的GST= 0.375，顯示不同地理種群存在強烈的遺傳分化?；蛄骺梢越档头N群分化，如果基因流較弱（Nm<1），就不能抵擋由隔離引起的種群趨異（Slatkin， 1985）。盾葉苣苔生長在林下、溪邊及石縫中，植株矮小，其花粉和種子傳播的距離很有限。加之昌化江河谷的隔離作用，不同地理種群發(fā)生基因流的可能性較小。本研究估計盾葉苣苔的基因流Nm=0.04，遠小于1，顯示種群間基因交流很有限，這與盾葉苣苔種群存在強烈遺傳分化的結(jié)果一致。Structure分析確定了6種遺傳成分，其中4種（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）分布在昌化江以北，成分Ⅴ和Ⅵ分布在昌化江的西南與東南，同側(cè)種群因山谷與昌化江支流的隔離作用而進一步分化為不同的遺傳成分。單倍型網(wǎng)絡(luò)和種群聚類分析揭示，分布在昌化江東南的盾葉苣苔與其余種群有較大的遺傳分化。昌化江河谷阻斷了東南種群與北部種群的基因交流，而五指山與仙安石林間的山谷導致東南與西南兩地種群隔離，形成昌化江以北、東南和西南三地彼此隔離的地理格局。盾葉苣苔6種遺 傳成分的地理分布， 以及地理種群的聚類關(guān)系與海南島中南部山地的隔離樣式大致吻合，進一步證實海南島昌化江河谷造成的地理隔離是導致盾葉苣苔遺傳分化的重要原因。邢婀娜等（2018）利用ITS序列變異研究海南特有種毛花馬鈴苣苔（Oreocharis dasyantha）遺傳變異的水平與地理分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛花馬鈴苣苔在昌化江河谷兩側(cè)有較明顯的分化，推測隔離是河谷兩側(cè)種群遺傳趨異的主要原因?？嘬奶浦参锸艿降乩砀綦x的影響容易發(fā)生明顯的遺傳分化，如報春苣苔屬中國特有種牛耳朵（Primulina eburnea）生長在中國西南部的石灰?guī)r地區(qū)，有東西兩個主要分布區(qū)，間隔距離大約200 km。Gao et al. （2015）發(fā)現(xiàn)西部與東部的牛耳朵種群存在明顯分化（FST=0.665），認為地理隔離是導致東西兩地種群出現(xiàn)遺傳分化的重要因素。綜上所述，本研究揭示盾葉苣苔遺傳變異的地理分布與海南山地的隔離樣式基本一致，表明地理隔離是促使盾葉苣苔遺傳分化格局形成的重要因素。

3.2 盾葉苣苔的遺傳多樣性

一般認為特有種、狹域種或瀕危種的遺傳多樣性較低（Ellstrand & Elam， 1993; Hamrick & Godt， 1996），也有研究顯示這些物種仍能維持較高水平的遺傳變異。這可能是由于種群間發(fā)生了劇烈遺傳分化，雖然單個種群的多樣性不高，但整個物種卻具有較高水平的遺傳變異（Dixo et al.， 2009）。例如，青藏高原瀕危植物唐古特大黃（Rheum tanguticum）的種群稀少，但總遺傳多樣性較高（HT=0.632） （王愛蘭和李維衛(wèi)， 2017）。唐古特大黃經(jīng)歷了漫長的種群分化，不同地理種群的遺傳分歧很大，導致物種水平的遺傳多樣性較高，同時唐古特大黃異交的繁育系統(tǒng)也使得遺傳變異能長期維持在種群中。使用ITS序列估計盾葉苣苔物種水平的遺傳多樣性（HT=0.998，π=0.023 5）遠高于單個種群的變異（種群內(nèi)平均遺傳變異HS=0.624，π=0～0.004 6）。海南島中南部山地被昌化江河谷及山谷分割，導致盾葉苣苔種群顯著分化，在物種水平上具有較豐富的遺傳變異。Song & Thomas （2007）研究多年生草本植物Boechera fecunda發(fā)現(xiàn)，該種遺傳結(jié)構(gòu)受地理隔離影響，基因流被阻斷，種群顯著分化（FST=0.57），導致物種整體維持較高水平的遺傳變異（HT=0.46）。與盾葉苣苔地理分布和繁育系統(tǒng)類似的Elymus glaucus，島嶼特有多年生草本植物Lithophragma maximum，以及海南島特有植物毛花馬鈴苣苔，均因地理隔離引起種群強烈分化，使得物種的遺傳多態(tài)性水平較高（Furches et al.， 2008; Hufford et al.， 2013; 邢婀娜等， 2018）。物種維持高水平遺傳變異的另一原因是祖先多態(tài)性沒有發(fā)生顯著喪失（Frankham & Briscoe， 2005）?？嘬奶茍蟠很奶Γ≒rimulina tabacum）是我國華南石灰?guī)r地區(qū)的特有種，僅分布在湖南和廣東交界的狹窄地區(qū)，但物種水平的遺傳多樣性較高（PPB=85.6%，HE=0.339，I=0.495）（Ni et al.， 2006）。Ni et al. （2006）認為報春苣苔在冰期通過避難所保留了大部分祖先多態(tài)性，該種目前的遺傳變異仍然比較豐富。盾葉苣苔分布在低緯度熱帶地區(qū)，第四紀冰期的擾動對其影響甚微，遺傳變異能夠穩(wěn)定的維持在種群中（顏家安， 2006; 陳冬梅等， 2011）。因此，其盾葉苣苔種群間遺傳分化和祖先多態(tài)性維持，可能是其物種水平具有較高遺傳多樣性的主要原因。

3.3 盾葉苣苔的保護措施

一般島嶼特有種的種群規(guī)模小，其生境脆弱且分布范圍狹窄，比大陸種群或物種更易瀕?；驕缃^（Ortega et al.， 2000）。盾葉苣苔為海南特有種，對生境要求嚴格，只生長在濕潤崖壁上或石壁夾縫中，目前因生境退化種群持續(xù)縮減（韋毅剛等， 2010）。本研究揭示盾葉苣苔67%的遺傳變異存在于地區(qū)間，需要盡可能多地保護不同地理種群，以維持盾葉苣苔物種水平的遺傳多樣性。11個種群中，NG（π=0.000 0， Hd=0.000 0）在ITS序列上無變異，YG （π=0.000 6， Hd=0.381 0）的變異水平很低，應(yīng)作為重點種群優(yōu)先保護，同時引入不同基因型個體以增加NG與YG的遺傳變異?？紤]到盾葉苣苔具有6種遺傳成分，因此每種成分都應(yīng)予以保護;昌化江以北的YG （I）、JX （ Ⅱ）與LM （IV）各自具有獨特遺傳成分且只存在于單個種群，因此這些種群也應(yīng)優(yōu)先保護。

參考文獻：

BA NDELT HJ， FORSTER P， ROHL A， 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies [J]. Mol Biol Evol， 16（1）： 37-48.

BUSO GSC， RANGEL PH， FERREIRA ME， 1998. Analysis of genetic variability of South American wild rice populations （Oryza glumaepatula） with isozymes and RAPD markers [J]. Mol Ecol， 7（1）： 107-117.

CHEN DM， KANG HZ， LIU CJ， 2011. An overview on the potential quaternary glacial refugia of plants in China Mainland [J]. Bull Bot Res， 31（5）： 623-632.? [陳冬梅， 康宏樟， 劉春江， 2011. 中國大陸第四紀冰期潛在植物避難所研究進展 [J]. 植物研究， 31（5）： 623-632.]

DAI ZF， LUO GY， 2009. Resources of wild gesneriaceae ornamental plant in tropical region of China [J]. Guizhou Acta Sci， 37（1）： 13-15.? [代正福， 羅冠勇， 2009. 中國熱帶特有野生苦苣苔科觀賞植物資源 [J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 37（1）： 13-15.]

DIXO M， METZGER JP， MORGANTE JS， et al.， 2009. Habitat fragmentation reduces genetic diversity and connectivity among toad populations in the Brazilian Atlantic Coastal Forest [J]. Biol Conserv， 142（8）： 1560-1569.

DOYLE J， 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue [J]. Focus， 12（1）： 13-15.

DUAN YZ， ZHANG DJ， GAO QB， et al.， 2010. Characteristic of molecular evolution of Sibiraea angustata based on nrDNA ITS and cpDNA trnL-F squnece analysis [J]. Bull Bot Res， 30（2）： 146-151.? [段義忠， 張得鈞， 高慶波， 等， 2010. 窄葉鮮卑花（Sibiraea angustata） nrDNA ITS和cpDNA trnL-F序列分子進化特點的分析 [J]. 植物研究， 30（2）： 146-151.]

ELLSTRAND NC， ELAM DR， 1993. Population genetic consequences of small population size： Implications for plant conservation [J]. Ann Rev Ecol Syst， 24（24）： 217-242.

EVANNO G， REGNAUT S， GOUDET J， 2005. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE： A simulation study [J]. Mol Ecol， 14（8）： 2611-2620.

FRANKHAM R， BRISCOE DA， 2005. Introduction to conservation genetics [M]. Beijing： Science Press.? [FRANKHAM R， BRISCOE DA， 2005. 保育遺傳學導論 [M]. 北京： 科學出版社.]

FURCHES MS， WALLACE， LE， HELENURM K， 2009. High genetic divergence characterizes populations of the endemic plant Lithophragma maximum（Saxifragaceae） on San Clemente Island [J]. Conserv Genet， 10（1）： 115-126.

GAO Y， AI B， KONG H， et al.， 2015. Geographical pattern of isolation and diversification in karst habitat islands： A case study in the Primulina eburnea complex [J]. J Biogeogr， 42（11）： 2131-2144.

HAMRICK JL， GODT MJW， 1996. Effects of life history traits on genetic diversity in plant species [J]. Phil Trans Roy Soc B-Biol Sci， 351（1345）： 1291-1298.

HUFFORD KM， MAZER SJ， HODGES SA， 2013. Genetic variation among mainland and island populations of a native perennial grass used in restoration [J]. AoB Plants， 6（3）： 623-626.

JAKOBSSON M， ROSENBERG NA， 2007. CLUMPP： A cluster matching and permutation program for dealing with label switching and multimodality in analysis of population structure [J]. Bioinformatics， 23（14）： 1801-1806.

KUMAR S， NEI M， DUDLEY J， et al.， 2008. MEGA： A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences [J]. Brief Bioinform， 9（4）： 299-306.

LI ZY， WANG YZ， 2005. Plants of Gesneriaceae in China [M]. Zhengzhou： Henan Science and Technology Publishing House.? [李振宇， 王印政， 2005. 中國苦苣苔科植物 [M]. 鄭州： 河南科學技術(shù)出版社.]

LIBRADO P， ROZAS J， 2009. DnaSP v5： A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data [J]. Bioinformatics， 25（11）： 1451-1452.

LING SJ， MENG QW， TANG L， et al.， 2017. Gesneriaceae on Hainan Island： Distribution patterns and phylogenetic relationships? [J]. Biodivers Sci， 25（8）： 807-815.? [凌少軍， 孟千萬， 唐亮， 等， 2017. 海南島苦苣苔科植物的地理分布格局與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 [J]. 生物多樣性， 25（8）： 807-815.]

MANEL S， SCHWARTZ MK， LUIKART G， et al.， 2003. Landscape genetics： Combining landscape ecology and population genetics? [J]. Trend Ecol Evol， 18（4）： 189-197.

MANTEL N， 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression approach? [J]. Appl Microbiol Biotechnol， 59（2-3）： 209-220.

NI X， HUANG Y， WU L， et al.， 2006. Genetic diversity of the endangered Chinese endemic herb Primulina tabacum （Gesneriaceae） revealed by amplified fragment length polymorphism （AFLP） [J]. Genetica， 127（1-3）： 177-183.

ORTEGA JF， GUERRA AS， KIM SC，et al.， 2000. Plant genetic diversity in the Canary Islands： A conservation perspective [J]. Am J Bot， 87（7）： 909-919.

OUBORG NJ， PIQUOT Y， GROENENDAEL JMV， 1999. Population genetics， molecular markers and the study of dispersal in plants [J]. J Ecol， 87（4）： 551-568.

PEAKALL R， SMOUSE PE， 2012. GenAlEx 6.5： genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research — an update [J]. Bioinformatics， 28（12）： 2537-2539.

PONS O， PETIT RJ， 1996. Measuring and testing genetic differentiation with ordered versus unordered alleles [J]. Genetics， 144（3）： 1237-1245.

PRITCHARD JK， STEPHENS M， DONNELLY P， 2000. Infe-rence of population structure using multilocus genotype data [J]. Genetics， 155（2）： 945-959.

RAYMOND M， ROUSSET F， 1995. An exact test for population differentiation [J]. Evolution， 49（6）： 1280-1283.

SHI YH， XU SS， HUANG JW， 2011. Evaluation of wild plant resources and their ornamental characteristics of Hainan chicory [J]. N Hortic， （11）： 79-82.? [史佑海， 徐世松， 黃覺武， 2011. 海南苦苣苔科野生植物資源及其觀賞特性評價 [J]. 北方園藝， （11）： 79-82.]

SLATKIN M， 1985. Gene flow in natural populations [J]. Ann Rev Ecol Syst， 16（1）： 393-430.

SLATKIN M， 1987. Gene flow and the geographic structure of natural populations [J]. Science， 236（4803）： 787-792.

SONG BH， THOMAS MO， 2007. High genetic diversity and population differentiation in Boechera fecunda， a rare relative of Arabidopsis [J]. Mol Ecol， 16（19）： 4079-4088.

STUESSY TF， TAKAYAMA K， LPEZSEPLVEDA P， et al.， 2014. Interpretation of patterns of genetic variation in endemic plant species of oceanic islands [J]. Bot J Linn Soc， 174（3）： 276-288.

TAMURA K， STECHER G， PETERSON D，et al.， 2013. MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. [J]. Mol Biol Evol， 30（12）： 2725-2729.

WANG AL， LI WW， 2017. Genetic diversity of an endangered species， Rheum tanguticum （Polygonaceae）， on the Qinghai-Tibetan Plateau [J]. Acta Ecol Sin， 37（21）：? 7251-7257.? [王愛蘭， 李維衛(wèi)， 2017. 青藏高原瀕危植物唐古特大黃的遺傳多樣性 [J]. 生態(tài)學報， 37（21）： 7251-7257.]

WANG C， LIANG XQ， ZHOU Y， et al.， 2015. Construction ofage frequencies of provenances on the eastern side of the Yinggehai Basin： Studies of LA-ICP-MS U-PB ages of detrital zircons from six modern rivers， western Hainan， China [J]. Earth Sci Front， 22（4）： 277-289.? [王策， 梁新權(quán)， 周云， 等， 2015. 鶯歌海盆地東側(cè)物源年齡標志的建立：來自瓊西6條主要河流碎屑鋯石LA-ICP-MS U-PB年齡的研究 [J]. 地學前緣， 22（4）： 277-289.]

WANG XX， LE JP， SUN H， et al.， 2011. Phylogeographical study on Eriophyton wallichii （Labiatae） from alpine scree of Qinghai-Tibetan Plateau [J]. Plant Divers Resour， 33： 605-614.? [王曉雄， 樂霽培， 孫航， 等， 2011. 青藏高原高山流石灘特有植物綿參的譜系地理學研究 [J]. 植物分類與資源學報， 33： 605-614.]

WANG ZS， AN SQ， LENG X， et al.， 2004. Population genetic diversity of the insular plant Neolitsea sericea based on random amplified polymorphic DNA （RAPD） [J]. Acta Ecol Sin， 24（3）： 414-422.? [王中生，安樹青，冷欣， 等， 2004. 島嶼植物舟山新木姜子居群遺傳多樣性的RAPD分析 [J]. 生態(tài)學報， 24（3）： 414-422.]

WEI YG， WEN F， MOLLER M， et al.， 2010. Gesneriaceae of South China [M]. Nanning： Guangxi Science & Technology Publishing House.? [韋毅剛， 溫放， MOLLER M， 等， 2010. 華南苦苣苔科植物 [M]. 南寧：廣西科學技術(shù)出版社.]

WEN F， 2008. Studies on investigation and introduction of wild ornamental resources of Gesneriaceae in Guangxi [D]. Beijing： Beijing Forestry University.? [溫放， 2008. 廣西苦苣苔科觀賞植物資源調(diào)查與引種研究 [D]. 北京： 北京林業(yè)大學.]

WHITE TJ， BRUNS T， LEE S， et al.， 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]//PCR Protocols： A guide to methods and applications. New York： Academic Press： 315-322.

XING EN， XU ST， REN MX， 2018. Age structure and gene flows of fine-scale populations of Oreocharis dasyantha （Gesneriaceae）， an alpine herb endemic to Hainan Island [J]. J Trop Biol， 1（9）： 37-46.? [邢婀娜， 徐詩濤， 任明迅， 2018. 海南特有毛花馬鈴苣苔小尺度局域種群的年齡結(jié)構(gòu)與基因流 [J]. 熱帶生物學報， 1（9）： 37-46.]

XING FW， 2012. Inventory of plant species diversity of Hainan [M]. Wuhan： Huazhong University of Science and Technology Press.? [邢福武， 2012. 海南植物物種多樣性編目 [M]. 武漢： 華中科技大學出版社.]

XING GY， 2004. Starting from the initial establishment of Hainan Island [J]. Hainan Arch，3： 43-47.? [邢關(guān)英， 2004. 從海南島最初設(shè)治說起 [J]. 海南檔案， 3： 43-47.]

XU WB， GUO J， PAN B， et al.， 2017. Diversity and distribution of Gesneriaceae in China [J]. Guihaia， 37（10）： 1219-1226.? [許為斌， 郭婧， 盤波， 等， 2017. 中國苦苣苔科植物的多樣性與地理分布 [J]. 廣西植物， 37（10）： 1219-1226.]

YAN JA， 2006. Paleontology and ecologic environmental evolution of the quaternary in Hainan Island [J]. J Palegeogr， 8（1）： 103-115.? [顏家安， 2006. 海南島第四紀古生物及生態(tài)環(huán)境演變 [J]. 古地理學報， 8（1）： 103-115.]

YU ZY， 2012. Regulation mechanism of tourist ecological effect must be established to build hainan into international tourism island of Hainan [J]. Ecol Environ， 1： 166-170.? [余中元， 2012. 國際旅游島建設(shè)旅游用地生態(tài)效應(yīng)調(diào)控機制研究 [J]. 生態(tài)經(jīng)濟， 1： 166-170.]

ZHOU ZG， 2015. Analysis on the ecological compensation mechanism of the three major rivers in Hainan Island [C]. Changchun： The Chinese Lake BBS.? [周祖光， 2015. 海南島三大河流生態(tài)補償機制探析 [C]. 長春： 中國湖泊論壇.]

（ 責任編輯 蔣巧媛 ）