基于轉(zhuǎn)錄組測序的西瓜果肉硬度相關(guān)基因表達(dá)分析

鄭雪夢 時月 王雪敏 馬越 趙曉燕 張超

摘 要：以脆肉型‘京欣3號西瓜和硬肉型‘甜王西瓜為樣品，評價果肉硬度表型差異，并利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測2個品種間差異表達(dá)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，‘甜王西瓜品種果肉硬度是‘京欣3號西瓜的1.9倍，表型與‘京欣3號西瓜具有顯著性差異。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，與‘京欣3號西瓜相比，‘甜王西瓜樣品有5 342個基因差異表達(dá)，其中2 360個基因上調(diào)表達(dá)，2 982個基因下調(diào)表達(dá)。差異基因主要注釋在碳水化合物代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝等途徑，其中與果肉硬度變化的候選基因主要包括果膠酯酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、酸性幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶和脂氧合酶基因。鈣調(diào)蛋白、乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、乙烯不敏感樣蛋白、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、MYC2轉(zhuǎn)錄因子、過氧化氫酶、呼吸爆發(fā)氧化酶和脫落酸受體PYR1參與果肉細(xì)胞活動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能與果肉硬度相關(guān)。

關(guān)鍵詞：西瓜;硬度;轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因

中圖分類號：S651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-2871（2020）10-015-08

Abstract： Firmness of pulp is an important index for the sensory quality and shelf life of watermelon. In this study， watermelon （Citrullus lanatue） of ‘Jingxin No. 3 variety and ‘Tianwang variety were used to analyze the firmness and differentially expressed genes by transcriptome sequencing .‘Tianwang variety showed a different firmness phenotype to the ‘Jingxin No. 3 variety with the firmness 1.9 times of that of the ‘Jingxin No. 3 variety. Transcriptome sequencing analysis showed that， a total of 5 342 genes differentially expressed was detected in ‘Tianwang variety， of which 2 360 genes were up-regulated and 2 982 genes were down-regulated compared with ‘Jingxin No. 3 variety. Differential genes were mainly annotated in carbohydrate metabolism， signal transduction， lipid metabolism and other pathways. Candidate genes that may be related to the firmness of pulp were screened. Pectinase， Pectin lyase， polygalacturonase， cellulase， cellulose synthase， β-galactosidase， β-glucosidase， acid chitinase， chitinase， xylan endoglucanase/hydrolase and lipoxygenase genes participate in cell wall degradation. Calmodulin， ethylene reactive transcription factor， ethylene insensitive like protein， WRKY transcription factor， MYC2 transcription factor， catalase， respiratory burst oxidase and abscisic acid receptor PYR1 related genes were involved in signal transduction pathways and mediate the firmness of pulp.

Key words： Watermelon; Firmness; Transcriptome; Differentially expessed genes

西瓜是葫蘆科西瓜屬（Citrullus lanatus）植物，廣泛種植于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國是西瓜的主要產(chǎn)區(qū)，2015年全國西瓜播種面積186萬hm2，產(chǎn)量為7 714萬t，占全球西瓜產(chǎn)量的67%[1]。目前，西瓜全基因組測序已經(jīng)完成[2]，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在西瓜表型方面的應(yīng)用，現(xiàn)已在西瓜果皮顏色、果實(shí)糖分積累、乙烯調(diào)控、有機(jī)酸積累和果實(shí)品質(zhì)形成等[3-8]關(guān)鍵基因定位均取得一定成績。但是，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在西瓜果肉硬度方面的研究還鮮有報道。

西瓜果肉硬度是影響西瓜品質(zhì)和貨架期的重要因素[9-13]，是一個多基因參與、多種代謝過程相互影響的復(fù)雜過程，與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡等因素密切相關(guān)[14]。質(zhì)構(gòu)分析儀可以較為客觀準(zhǔn)確的反映果肉硬度表型，并廣泛應(yīng)用于果蔬制品硬度測定，包括葡萄、萵筍、棗、甜瓜、西瓜等[15-19]。

目前，對西瓜果肉硬度的轉(zhuǎn)錄組測序研究主要集中在野生西瓜和栽培西瓜比對方面[19-21]，筆者選擇親緣關(guān)系相近，但果肉硬度表型差異較大的脆肉型‘京欣3號西瓜和硬肉型‘甜王西瓜為試驗(yàn)材料，其中‘京欣3號西瓜果肉松脆，而‘甜王西瓜果肉較硬。研究以‘京欣3號西瓜作為對照組，比較果肉硬度表型間差異，并通過轉(zhuǎn)錄組測序分析差異表達(dá)基因參與的代謝途徑，以期挖掘與西瓜果肉硬度相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 材料

供試西瓜品種為脆肉型‘京欣3號，京研益農(nóng)（北京）種業(yè)科技有限公司提供;硬肉型‘甜王，育種和生產(chǎn)單位不詳。試驗(yàn)選擇新鮮、大小相近、無顯著性機(jī)械傷的果實(shí)作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 西瓜果肉取樣 試驗(yàn)于2019年9月在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心加工樓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。首先用蒸餾水清洗果實(shí)表面灰塵，再在150 μL·L-1次氯酸鈉溶液中清洗2 min，蒸餾水漂洗2次，靜置瀝水。在超凈工作臺下，將西瓜縱向切開，果肉切割成邊長約3 cm的小果塊，混合均勻，裝入聚乙烯保鮮盒內(nèi)，每盒約300 g，放置于4 ℃的冰箱中冷藏，隨機(jī)抽取整塊果塊，混合取樣，測定果肉硬度。在貯藏期第5天，隨機(jī)抽取整塊果塊，混合取樣，部分用于測定果肉硬度，其他果塊使用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 果肉質(zhì)構(gòu)測定 使用 TA-XT plus 質(zhì)構(gòu)分析儀的 P/5 探頭測定樣品硬度：設(shè)定最小感知力 5 g，測試前速度 10 mm·s-1;測試速度 2 mm·s-1;測試后速度 10 mm·s-1，下壓距離 10 mm，以下壓過程中平均力大小代表硬度，每次測試位置均勻，每個樣品取 5 個點(diǎn)，取平均值。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 以‘京欣3號西瓜果肉作為CK組，‘甜王西瓜果肉作為HF（Hard flesh）組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，為確保轉(zhuǎn)錄組測序的準(zhǔn)確性和可靠性，每個處理組作3次重復(fù)，分別標(biāo)記為CK1、CK2、CK3、HF1、HF2和HF3。采用 TRIzol法提取西瓜總 RNA。轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建、高通量測序和序列組裝工作均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

對各樣本的對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)（clean data），與西瓜97103基因組（Watermelon_97103 ，http：//cucurbitgenomics.org/organism/1）進(jìn)行序列比對。使用軟件RSEM對基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，計算各基因的表達(dá)水平，定量指標(biāo)為TPM（Transcripts Per Million reads）。利用DESeq2軟件進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，以P adjust < 0.05 & |log2FC| ≥ 1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。將差異表達(dá)基因與GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，采用軟件 Goatools 進(jìn)行GO富集分析，采用美吉自主研發(fā)流程對基因集中進(jìn)行KEGG PATHWAY富集分析，以P adjust<0.05為閾值，滿足此條件則認(rèn)為此GO功能/KEGG通路存在顯著富集情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Origin 9.0 軟件繪制圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜果肉硬度表型分析

圖1顯示，‘京欣3號西瓜和‘甜王西瓜在貯藏期期間硬度變化情況?！┬?號西瓜和‘甜王西瓜具有相同的母本，屬于近緣品種，‘京欣3號西瓜果肉松脆，而‘甜王西瓜果肉較硬。測定結(jié)果顯示‘甜王西瓜果肉硬度顯著高于‘京欣3號西瓜，是‘京欣3號西瓜果肉硬度的1.9倍;在貯藏期間，‘甜王西瓜果肉硬度未見顯著性變化，而‘京欣3號西瓜的果肉硬度有顯著性的降低。因此，‘甜王西瓜果肉硬度表型與‘京欣3號西瓜具有顯著性差異。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

通過Illumina平臺對‘京欣3號西瓜、‘甜王西瓜果肉樣本測序（表1），使用SeqPrep和Sickle軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，使用TopHat2和HISAT2軟件將質(zhì)控后的clean reads與參考基因組比對，獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝、表達(dá)量計算等的 mapped reads，對轉(zhuǎn)錄組測序的比對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估。表1顯示，6個樣品共獲得 330 387 592個原始數(shù)據(jù)，通過過濾和質(zhì)量控制的原始數(shù)據(jù)共產(chǎn)出327 389 480個的clean reads，并且配對錯誤率均小于0.025 3%，Q30堿基比例在93.87%以上，與參考基因組的比對率在74.00%以上，比對效率較高。因此，6個西瓜樣本轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)生物學(xué)分析。

2.3 基因表達(dá)量分析

通過相關(guān)性熱圖，對樣本間基因表達(dá)量的生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性進(jìn)行評估，將皮爾遜相關(guān)系數(shù)r作為評估指標(biāo)，r2越接近1，說明2個重復(fù)樣品相關(guān)性越強(qiáng)。圖2顯示，每個樣本間的3次生物學(xué)重復(fù)的相關(guān)性較強(qiáng)，其中CK組樣本的3個組間重復(fù)相關(guān)性最好。同時，對6個樣本的基因表達(dá)量進(jìn)行主成分分析，找出離群樣本，判別相似性高的樣品簇。如圖3所示，相同處理的樣本之間聚集在一起，相似度較高，而不同處理之間基因表達(dá)差異顯著，分別形成不同的集群，與圖2結(jié)果一致。

2.4 差異表達(dá)基因分析

通過對不同西瓜樣本的表達(dá)基因進(jìn)行比較，篩選出差異表達(dá)基因。將FC（差異倍數(shù)）≥2且P adjust < 0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，差異表達(dá)基因的數(shù)目統(tǒng)計如表2所示，2組間共有5 342個基因差異表達(dá)，其中2 360個基因上調(diào)表達(dá)，2 982個基因下調(diào)表達(dá)。差異基因火山圖（圖4）可以簡明地看出各組別的差異基因分布。

2.5 差異表達(dá)基因的GO功能富集

GO（Gene Ontology， http：//www.geneontology.org/）是基因本體論聯(lián)合會建立的將全世界所有與基因有關(guān)的研究結(jié)果進(jìn)行分類匯總的綜合數(shù)據(jù)庫，利用GO數(shù)據(jù)庫，可以將基因按照它們參與的生物學(xué)過程、構(gòu)成細(xì)胞的組分和實(shí)現(xiàn)的分子功能進(jìn)行分類。如圖5所示，對富集程度前20的GO term做散點(diǎn)圖，差異基因顯著富集在寡糖的生物合成過程（14個）、海藻糖代謝過程（12個）、二糖生物合成過程（12個）、海藻糖的生物合成過程（11個）、含磷酸鹽的化合物代謝過程（389個）、磷代謝過程（391個）、寡糖代謝過程（19個）、二糖代謝過程（17個）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（102個）、磷酸化（284個）、轉(zhuǎn)移酶活性（674個）方面。

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

利用 KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫，可將基因按照參與的pathway通路分類，通過對代謝通路的分析，更好地揭示差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。對‘京欣3號西瓜與‘甜王西瓜的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，共富集到131個代謝通路中，選擇富集程度較前的代謝通路散點(diǎn)圖（圖6）展示。差異基因在DNA復(fù)制（23個）、果糖和甘露糖代謝（25個）、甘油脂代謝（25個）、半乳糖代謝（23個）、N-聚糖生物合成（14個）、精氨酸和脯氨酸代謝（18個）、MAPK信號傳導(dǎo)途徑-植物（44個）、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝（18個）、氨基糖和核苷酸糖代謝（40個）、磷酸戊糖途徑（16個）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（83個）、糖酵解/糖異生（33個）、植物病原體相互作用（45個）、淀粉和蔗糖代謝（47個）通路富集。

2.7 與果肉硬度相關(guān)的候選基因篩選

如表3所示，根據(jù)‘京欣3號西瓜和‘甜王西瓜樣品差異基因的表達(dá)情況，篩選了一些與果肉硬度有關(guān)的基因。對篩選出的差異表達(dá)基因做層次聚類分析，如圖7所示，將具有相同或相似表達(dá)模式的基因進(jìn)行聚類，圖中每列表示1個樣本，每行表示1個基因，圖中的顏色表示該基因在每個樣本中標(biāo)準(zhǔn)化處理后的表達(dá)量值，可以看出多數(shù)候選基因在‘京欣3號西瓜樣本中有更高的表達(dá)，具體基因注釋詳情見表3。

果膠酯酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、酸性幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶、脂氧合酶基因參與細(xì)胞壁降解，且大部分基因在‘京欣3號西瓜果肉中有更高的表達(dá)，這可能是造成2個品種西瓜果肉硬度差異的主要原因。此外，還發(fā)現(xiàn)一些與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的鈣調(diào)蛋白、乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、乙烯不敏感樣蛋白、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、MYC2轉(zhuǎn)錄因子、過氧化氫酶、呼吸爆發(fā)氧化酶、脫落酸受體PYR1基因在2個樣本間也有較大差異，這可能是因?yàn)樾盘柗肿优c受體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞活動，進(jìn)而對果肉硬度造成影響。

3 討論與結(jié)論

硬度是衡量西瓜果實(shí)感官和商業(yè)品質(zhì)的重要指標(biāo)。如果肉質(zhì)太硬，則汁液偏少，口感較差;如果肉質(zhì)過于酥松，則口感綿軟，爽口度下降，且不耐貯藏，貨架期短[6]。在本研究中，‘甜王西瓜果肉硬度是‘京欣3號西瓜果肉硬度的1.9倍，同時發(fā)現(xiàn)有2 360個上調(diào)基因和2 982個下調(diào)基因，與KEGG數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，差異基因注釋在碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、聚糖的生物合成與代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝方面。碳水化合物代謝可能是造成細(xì)胞壁降解的主要原因，細(xì)胞壁降解與水果軟化緊密相關(guān)，差異基因可能是通過參與果實(shí)碳水化合物代謝影響果實(shí)硬度。

植物細(xì)胞壁降解涉及原細(xì)胞壁和中層膜的一系列協(xié)調(diào)多糖修飾，果膠質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞壁和胞間層的主要成分，木葡聚糖是植物細(xì)胞壁半纖維素的主要成分，幾丁質(zhì)是高等植物細(xì)胞壁中除纖維素外的重要多糖。果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶是植物細(xì)胞壁降解的關(guān)鍵酶，參與果實(shí)軟化。Chen等[22]發(fā)現(xiàn)，冷藏可以抑制PG、纖維素酶、β-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶的酶活性，延緩果膠解聚，進(jìn)而延緩藍(lán)莓果實(shí)軟化。沈穎等[23]發(fā)現(xiàn)，原果膠的降解和纖維素的水解是甜櫻桃果實(shí)軟化的關(guān)鍵因素。在本研究中發(fā)現(xiàn)果膠酯酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、酸性幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶、脂氧合酶基因參與細(xì)胞壁降解，且大部分基因在‘京欣3號西瓜中有更高的表達(dá)。

脂氧合酶參與植物脂肪酸氧化，與植物的抗病和抗傷害反應(yīng)密切相關(guān)。鈣調(diào)蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，介導(dǎo)細(xì)胞活動。乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子是植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，對植物的生長發(fā)育、次生代謝過程和植物的抗脅迫能力具有重要的調(diào)控作用[24]。Gao等[19]對‘PI186490和‘Sanbai品種不同的成熟階段的西瓜果肉轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)除果膠酯酶基因、聚半乳糖醛酸酶、果膠酸裂合酶、糖基轉(zhuǎn)移酶基因、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶基因、木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶外，脂氧合酶基因、植物激素、轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)與西瓜果實(shí)的成熟和軟化有關(guān)。類似的，在本研究中發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白、乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、乙烯不敏感樣蛋白、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、MYC2轉(zhuǎn)錄因子、過氧化氫酶、呼吸爆發(fā)氧化酶、脫落酸受體PYR1相關(guān)基因參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)果肉細(xì)胞活動，可能與2個品種西瓜果實(shí)的硬度表型有關(guān)。

西瓜果肉的硬度是一個多基因參與、多種代謝過程相互影響的復(fù)雜過程，研究結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平為解析貨架期西瓜果肉硬度變化的分子機(jī)理提供參考，為挖掘西瓜硬度相關(guān)的關(guān)鍵功能基因提供基因資源。

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