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    樺褐孔菌多酚抑菌活性分析研究

    2020-12-14 11:25:20戴航宇滕春瑩張榮濤
    中國(guó)釀造 2020年11期
    關(guān)鍵詞:單增孔菌細(xì)胞膜

    戴航宇,滕春瑩,張榮濤

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所,黑龍江 哈爾濱 150070)

    隨著生活水平的提高,以多酚為原料的健康產(chǎn)品的研發(fā)越來(lái)越受到重視。目前國(guó)內(nèi)外多酚產(chǎn)品主要源于綠色植物,其強(qiáng)大的抗氧化活性在疾病預(yù)防和治療方面有良好的表現(xiàn)。我國(guó)是食用菌生產(chǎn)大國(guó),對(duì)食用菌天然活性物質(zhì)如多酚類物質(zhì)的提取純化和生物活性分析,有助于食用菌在功能性食品和醫(yī)藥保健品的應(yīng)用和開發(fā)。樺褐孔菌(Inonotus obliquus)是生長(zhǎng)在樺樹上的一種食藥用真菌,其子實(shí)體中含有200多種活性物質(zhì),具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂、降血糖、延緩衰老、提高免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、抑菌等多種生理功能[1-2]。目前關(guān)于樺褐孔菌活性物質(zhì)報(bào)道較多的是其多糖和三萜類物質(zhì),關(guān)于樺褐孔菌多酚抗細(xì)菌活性較少報(bào)道[3-4]。研究表明,多酚中如鞣酸、黃酮類等成分具有抗菌性能[5]。酚類物質(zhì)對(duì)多種細(xì)菌都有抑制作用,如對(duì)霍亂菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等常見致病菌抑制能力更強(qiáng),同時(shí)多酚類并不影響生物體本身的生長(zhǎng)發(fā)育[6]。SHIN Y S等[7]研究發(fā)現(xiàn),多酚可以有效的抑制一些微生物的毒性,比如說(shuō)致病性的病毒、真菌和細(xì)菌等。麝香葡萄(Vitis rotundifolia)含有的兒茶素和表兒茶素、槲皮素、山奈酚和反式白藜蘆醇已被證明有很好的抑菌活性[8]。張慧麗等[9]研究花生紅衣提取物黃酮酚類、單寧類等多酚類物質(zhì),并證明其對(duì)大腸桿菌、葡萄球菌等均有一定的抑制活性。鐘秀宏等[10]報(bào)道了蘋果中多酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)菌具有一定的抑制作用,且多酚濃度與抑菌活性呈量效關(guān)系。本研究通過(guò)抑菌圈試驗(yàn)確定樺褐孔菌(Inonotusobliquus)多酚的抑菌譜,探究pH、溫度、紫外照射、鹽濃度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響,通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)、紫外吸收、電導(dǎo)率及細(xì)胞形態(tài)變化研究樺褐孔菌多酚的抑菌活性。

    目前關(guān)于樺褐孔活性物質(zhì)報(bào)道較多的是多糖和三萜類物質(zhì),關(guān)于樺褐孔菌多酚的提取純化及生物活性分析較少報(bào)道。本研究以樺褐孔菌子實(shí)體為原材料,提取樺褐孔菌多酚類物質(zhì),對(duì)其抗細(xì)菌活性進(jìn)行了初步探索。為樺褐孔菌多酚在生物醫(yī)藥產(chǎn)品食品防腐劑等領(lǐng)域的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    樺褐孔菌(Inonotus obliquus)子實(shí)體:哈爾濱貝加爾泰生物工程有限公司;無(wú)水、正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、鐵氰化鉀、抗壞血酸(均為分析純):上海生物化學(xué)試劑公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、Tris(均為分析純):美國(guó)Sigma公司。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)固體培養(yǎng)基:10 g 胰蛋白胨,5 g 牛肉膏,10 g NaCl,15 g瓊脂,1 L蒸餾水,pH 7.0;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液體培養(yǎng)基:10 g 胰蛋白胨,5 g 牛肉膏,10 g NaCl,1 L蒸餾水,pH 7.0。121.3 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后,自然冷卻備用。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SU1510掃描電鏡:日本日立高新技術(shù)公司;TP-2000E電子天平:湘儀天平儀器設(shè)備有限公司;AUTOCLAVEMLS-3020不銹鋼滅菌鍋:日本三洋公司;SG-81電熱恒溫干燥箱:日本雅瑪拓公司;M-CENTRIFUGE小型離心機(jī):杭州柏恒科技有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮儀器廠;EZ550Q冷凍干燥儀:美國(guó)FTSSystems公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樺褐孔菌多酚的提取

    樺褐孔菌子實(shí)體于65 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量后,粉碎至粉末狀,準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的樺褐孔菌子實(shí)體粉末放入一定體積的乙醇溶液中,提取條件為料液比1∶20(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min。浸提處理得上清液,經(jīng)無(wú)水乙醇醇沉、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)、有機(jī)溶劑萃取、離心及冷凍干燥后測(cè)定多酚提取率。采用經(jīng)過(guò)部分修改的福林酚(Folin-Ciocalteu)法測(cè)定樺褐孔菌中多酚的含量[11]。

    1.3.2 菌懸液的制備

    需要檢測(cè)的菌株首先使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為220 r/min、37 ℃、12 h過(guò)夜,然后再將需要檢測(cè)的菌株重新接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為220 r/min、37 ℃、2~4 h,使得菌株增長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期,OD600nm值校正到0.3~0.5之間。待檢測(cè)的微生物數(shù)量級(jí)調(diào)整為約105CFU/mL[12]。

    1.3.3 抑菌圈的測(cè)定

    首先把提前準(zhǔn)備好的濾紙制作成直徑為15 mm的圓形紙片,放入培養(yǎng)皿內(nèi)。然后在超凈臺(tái)上,使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌進(jìn)行培養(yǎng)。然后在培養(yǎng)皿中加入5 mL過(guò)膜后的10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL的多酚溶液,充分浸泡2 h后,用無(wú)菌鑷子貼在培養(yǎng)基上,濾紙片一貼就不能再拿起,于37 ℃培養(yǎng)24 h。以無(wú)菌水做空白對(duì)照,觀察抑菌圈直徑大小,平行三次試驗(yàn),取平均值。當(dāng)抑菌圈直徑大于6 mm時(shí)表示其具有抑菌活性。

    1.3.4 最低抑菌濃度的測(cè)定

    用試管二倍稀釋法確定待測(cè)樣品的最低抑菌濃度(minmum inhibitory concentration,MIC)[13]:培養(yǎng)液含菌量105CFU/mL,待測(cè)樣品用無(wú)菌水連續(xù)稀釋最終質(zhì)量濃度為0、0.1562mg/mL、0.3150mg/mL、0.625 0mg/mL、1.250 0mg/mL、2.500 0 mg/mL、5.000 0 mg/mL、10.000 0 mg/mL。在37 ℃培育18~24 h后,150 r/min搖床培養(yǎng),每個(gè)濃度平行做三次測(cè)試,以試管中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度作為最小抑制濃度。以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。

    1.3.5 樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響因素

    (1)pH值對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

    用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液,調(diào)節(jié)5 mg/mL質(zhì)量濃度下的樺褐孔菌多酚溶液的pH值分別為3、4、5、6、7、8、9共7個(gè)梯度進(jìn)行抑菌試驗(yàn),以金黃葡萄球菌為指示菌,按照濾紙片法觀察pH對(duì)多酚抑菌活性的影響,以無(wú)菌水作空白對(duì)照,重復(fù)3個(gè)平板。

    將5 mg/mL質(zhì)量濃度下的樺褐孔菌多酚溶液分別在40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃5個(gè)溫度下處理一定時(shí)間,以金黃葡萄球菌為指示菌,同樣采用濾紙片法觀察溫度對(duì)多酚抑菌活性的影響,以無(wú)菌水作空白對(duì)照,重復(fù)3個(gè)平板。

    (3)鹽濃度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

    配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%氯化鈉溶液。以金黃葡萄球菌為指示菌,按照濾紙片法觀察鹽濃度對(duì)多酚抑菌活性的影響,以含同等濃度氯化鈉的無(wú)菌水作空白對(duì)照組,重復(fù)3個(gè)平板。

    (4)紫外輻射對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

    樺褐孔菌多酚溶液使用紫外光滅菌,滅菌時(shí)間分別為0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min,以金黃色葡萄球菌為指示菌,同樣采用濾紙片法觀察紫外輻射對(duì)多酚抑菌活性的影響,以無(wú)菌水作空白對(duì)照,重復(fù)3個(gè)平板。1.3.6 樺褐孔菌多酚抑菌機(jī)制

    (1)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制

    在制備細(xì)菌菌懸液中分別加入2.5 mg/mL和5.0 mg/mL樺褐孔菌多酚溶液,于30 ℃、160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)。在0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 分別取樣,以金黃葡萄球菌為指示菌,在波長(zhǎng)630 nm處測(cè)定其吸光度值。然后繪制生長(zhǎng)曲線,另外以不加樺褐孔菌多酚溶液的為對(duì)照組。

    采用焊接電流70~110A,電弧電壓10~16V,焊接速度40~95mm/min,層間溫度<58℃的工藝進(jìn)行焊接。焊接接頭根部焊道使用?2.4mm的焊絲打底,填充及蓋面層焊道使用?1.6~?2.4mm的焊絲打底。熱輸入量要小,不得超越工藝規(guī)程中熱輸入量的要求,填充、蓋面時(shí)的熱輸入量不得高于打底時(shí)的熱輸入量。

    (2)樺褐孔菌對(duì)多酚細(xì)胞膜通透性的影響

    根據(jù)PARK Y K等[14]的方法,將金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌分別接入液體培養(yǎng)基中,按照上述菌懸液的制備方法,使細(xì)菌數(shù)調(diào)整為大約105CFU/mL左右。將質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL樺褐孔菌多酚溶液等體積加入懸菌液,在37 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。用蒸餾水代替供試菌種作為對(duì)照組,分別于0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 測(cè)定懸菌液的電導(dǎo)率值,每樣重復(fù)3次。

    (3)樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞泄漏的影響

    具體檢測(cè)參照崔鶴松等[15]方法。

    (4)樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞完整性的影響

    將0.2 mL細(xì)菌菌懸液加入到牛肉膏蛋白棟固體培養(yǎng)基中,5 mg/mL樺褐孔菌多酚溶液處理濾紙片,按照濾紙片進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)觀察至出現(xiàn)明顯的抑菌圈,取抑菌圈部位和沒有抑菌圈部位。用雙面刀片切成2 mm×5 mm的小條,按照掃描電鏡生物樣品制備方法,固定、沖洗、脫水、置換、干燥、粘樣、鍍膜于掃描電鏡下觀察菌體形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化,以沒有抑菌圈部位的固體培養(yǎng)基作為對(duì)照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樺褐孔菌多酚抑菌譜的測(cè)定

    樺褐孔菌多酚抑菌效果的定性試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知,樺褐孔菌多酚對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌均具有一定的抑制活性,且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。樺褐孔菌多酚的濃度和抑菌圈大小具有正相關(guān)的劑量關(guān)系,當(dāng)多酚質(zhì)量濃度從2.5 mg/mL升高到5 mg/mL時(shí),抑菌圈直徑增加11.9%~28.3%,而多酚質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高至10 mg/mL時(shí),抑菌直徑增加34.5%~51.0%。在本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著樺褐孔菌多酚質(zhì)量濃度的增大抑菌圈越大,抑制效果越明顯。通過(guò)比較每個(gè)抑制圈的大小,發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多酚對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好,10 mg/mL時(shí)最大抑菌圈直徑為(19.5±0.15)mm,比同濃度下枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌分別高23.4%、8.9%、18.2%和40.2%,因此選用金黃色葡萄球菌為后續(xù)試驗(yàn)的指示菌。

    表1 樺褐孔菌多酚抑菌活性定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Qualitative test results of the antimicrobial activity of Inonotus obliquus polyphenols

    2.2 最低抑菌濃度的測(cè)定

    由表2可知,樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌均具有抑制生長(zhǎng)的作用,但抑菌能力因濃度不同而不同,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC最低,MIC為1.25 mg/mL,MIC越小說(shuō)明抑菌效果越好,對(duì)單增李斯特菌和大腸桿菌的MIC 低于2.5 mg/mL,對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的MIC低于5 mg/mL,樺褐孔菌多酚對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑制活性低于其他幾種供試菌。進(jìn)一步說(shuō)明了在供試菌中,樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌效果最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,樣品對(duì)細(xì)菌的抑制能力具有選擇性,對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)的抑制能力優(yōu)于大腸桿菌和沙門氏菌(革蘭氏陰性菌)。對(duì)照樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和沙門氏菌沒有抑菌性。

    表2 樺褐孔菌多酚抑菌的最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of minimum inhibitory concentration of Inonotus obliquus polyphenols

    2.3 不同因素對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響

    2.3.1 pH對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

    圖1 pH值對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.1 Effect of pH value on the antimicrobial activity of Inonotus obliquus polyphenols

    由圖1可知,不同pH值樺褐孔菌多酚溶液的抑菌活性有一定改變。隨著pH升高,抑菌圈直徑呈先升高后降低的趨勢(shì),在pH值為3~6范圍處理后,抑菌圈直徑隨著pH升高而增大,在pH值為6時(shí),抑菌圈直徑達(dá)到最大值為18.36 mm,當(dāng)pH值>6處理后,抑菌圈直徑降低較明顯,抑菌效果變?nèi)?。這說(shuō)明樺褐孔菌多酚在強(qiáng)酸強(qiáng)堿下具有顯著的抑菌效果,而且酸性條件下的抑菌效果要顯著強(qiáng)于堿性條件。

    2.3.2 溫度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

    圖2 溫度對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the antibacterial activity of Inonotus obliquus polyphenols

    由圖2可知,多酚提取液在40~121 ℃范圍處理后,抑菌圈直徑大小變化不明顯,說(shuō)明樺褐孔菌多酚抑菌熱穩(wěn)定性較好,當(dāng)溫度>80 ℃處理后,其抑菌圈直徑雖有變小但減小不明顯,仍有很好的抑菌效果。可能原因是高溫使提取液中的抑菌物質(zhì)發(fā)生了化學(xué)變化,致使其在高溫高壓條件下仍然具有一定的抑菌效果。

    2.3.3 氯化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

    圖3 氯化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on the antibacterial activity of Inonotus obliquus polyphenols

    由圖3可知,隨著氯化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,抑菌圈直徑逐漸增大,當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí),抑菌圈直徑最大為18.66 mm,與未添加鹽的抑菌圈直徑相比增加顯著,低濃度的鹽對(duì)樺褐孔菌多酚的抑菌效果具有一定的促進(jìn)作用,抑菌圈大小隨著氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈正相關(guān)。

    2.3.4 紫外輻射時(shí)間對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌的影響

    由圖4可知,隨著紫外輻射時(shí)間增加,抑菌圈直徑變化不明顯,說(shuō)明紫外輻射在試驗(yàn)條件下,多酚對(duì)金黃葡萄球菌抑菌效果不明顯。當(dāng)紫外輻射后抑菌圈直徑較未經(jīng)紫外輻射的抑菌圈變化微弱。說(shuō)明紫外照射沒有對(duì)樺褐孔菌多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性產(chǎn)生影響。

    圖4 紫外輻射對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性的影響Fig.4 Effect of UV radiation on the antibacterial activity of Inonotus obliquus polyphenols

    2.4 樺褐孔菌多酚抑菌機(jī)制

    2.4.1 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制

    采用生長(zhǎng)曲線法[16]鑒定抑菌效果,結(jié)果見圖5。由圖5可知,經(jīng)樺褐孔菌多酚處理的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線與正常培養(yǎng)的對(duì)照組存在明顯的變化。未添加樺褐孔菌多酚處理的金黃葡萄球菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加具有典型的生長(zhǎng)特征,生長(zhǎng)狀況較好。對(duì)照組中,金黃葡萄球菌在0~5 h內(nèi)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng),5 h之后開始進(jìn)入穩(wěn)定期;樺褐孔菌多酚處理組均隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),OD600nm值初始增殖緩慢,在4 h到達(dá)增殖頂點(diǎn),4 h后趨于穩(wěn)定,之后出現(xiàn)小幅度下降,且多酚質(zhì)量濃度為5 mg/mL處理組較2.5 mg/mL處理組OD600nm值小。說(shuō)明經(jīng)多酚處理后的金黃葡萄球菌的生長(zhǎng)受到抑制,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短、甚至無(wú)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,且抑制效果與多酚濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。

    圖5 樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.5 Effect of Inonotus obliquus polyphenols on growth curve of Staphylococcus aureus

    可能原因是多酚抑菌物質(zhì)沒有起到明顯作用,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間處理后,細(xì)菌生長(zhǎng)開始受到抑制,但是并沒有完全殺死細(xì)菌,表明其進(jìn)入衰亡期。并且細(xì)菌生長(zhǎng)情況隨著樺褐孔菌多酚質(zhì)量濃度的增加變得緩慢,但是整體變化趨勢(shì)相同。

    2.4.2 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

    細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障,當(dāng)細(xì)菌遇到強(qiáng)抑菌劑,細(xì)胞膜遭到破壞時(shí),菌體的保護(hù)屏障被打破,使其內(nèi)部電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中,進(jìn)而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升。因此,菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化[17]。

    圖6 樺褐孔菌多酚處理對(duì)細(xì)菌電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of treatment of Inonotus obliquus polyphenols on conductivity of bacteria

    由圖6可知,將1 mg/mL的樺褐孔菌多酚提取液作用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液,電導(dǎo)率較未經(jīng)處理的對(duì)照組存在明顯的變化,多酚作用細(xì)菌組的電導(dǎo)率明顯高于未處理組電導(dǎo)率。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率高于枯草芽孢桿菌、沙門氏菌,且均呈持續(xù)上升趨勢(shì)。處理1 h后金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的電導(dǎo)率值分別為6.79 mS/cm、6.53 mS/cm、6.39 mS/cm、6.04 mS/cm、5.77 mS/cm,處理4 h后分別增加到7.134 mS/cm、6.79 mS/cm、6.653 mS/cm、6.35 mS/cm、5.97 mS/cm。處理4 h后金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌與對(duì)照相比電導(dǎo)率分別變大。作用4 h后,所有樣品的電導(dǎo)率值變化不明顯。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)樺褐孔菌多酚溶液處理的菌體細(xì)胞細(xì)胞膜發(fā)生破壞而失去其選擇滲透性功能,使電解質(zhì)的滲出量不斷增大,因此導(dǎo)致菌液中電導(dǎo)率增加,可能原因是首先破壞細(xì)胞膜的完整性,增加了細(xì)胞膜的通透性,促使內(nèi)容物快速滲出,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性被破壞,從而起到抑菌作用。對(duì)照組的電導(dǎo)率開始0~1 h 內(nèi)略微上升,可能是由于測(cè)量時(shí)環(huán)境溫度的變化引起的,1 h后基本無(wú)變化。

    2.4.3 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞泄漏的影響

    細(xì)胞膜是細(xì)胞完整的主要組成部分,可以使得細(xì)胞行使正常的生理活性。細(xì)菌細(xì)胞壁的口徑很小,只能夠通過(guò)1 nm大小的分子,大分子物質(zhì)就無(wú)法通過(guò)細(xì)胞壁[18]。一旦細(xì)菌遭受到破壞,例如遭受到抑菌物質(zhì)的影響后,細(xì)胞膜的功能會(huì)破壞,導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,使細(xì)胞的功能喪失[19]。由于核酸在波長(zhǎng)260 nm處的釋放有強(qiáng)吸收,因此OD260nm值被廣泛用作評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)[20]。

    圖7 樺褐孔菌多酚處理對(duì)金黃葡萄球菌紫外吸收的影響Fig.7 Effects of treatment of Inonotus obliquus polyphenols on ultraviolet absorption of Staphylococcus aureus

    由圖7可知,樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌的抑制率具有顯著影響。未經(jīng)多酚處理組的OD260nm值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加變化不明顯,說(shuō)明細(xì)菌處于穩(wěn)定的生長(zhǎng)情況。經(jīng)多酚處理組的OD260nm值隨著作用時(shí)間的增加呈顯著上升趨勢(shì)。0~4 h范圍內(nèi)OD260nm值隨著多酚作用時(shí)間增加顯著增大,作用4~6 h后OD260nm值緩慢增加。當(dāng)作用6 h后OD260nm值呈穩(wěn)定趨勢(shì)。且OD260nm值與多酚作用濃度呈正相關(guān)。說(shuō)明樺褐孔菌多酚可是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸大量滲出,且樺褐孔菌多酚的濃度越大核酸泄露越明顯。

    2.5 樺褐孔菌多酚對(duì)細(xì)胞完整性的影響

    大腸桿菌經(jīng)樺褐孔菌多酚作用后,其掃描電鏡圖(scanningelectron microscopy,SEM)結(jié)果見圖8。

    圖8 樺褐孔菌多酚處理大腸桿菌的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy image of Escherichia coli treated with Inonotus obliquus polyphenols

    由圖8A可知,正常的大腸桿菌菌體保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),細(xì)胞表面光滑均勻、飽滿完整;由圖8B可知,經(jīng)過(guò)多酚抑菌處理后的部分菌體形態(tài)受到損壞,有不規(guī)則的突起,有輕微褶皺,個(gè)別菌體的形狀發(fā)生改變;放大倍數(shù)后可以清晰地看出菌體形態(tài)的扭曲、變形,個(gè)別甚至出現(xiàn)有黑色孔洞。多酚類是親水的物質(zhì),可以通過(guò)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)變化證明了樺褐孔菌多酚破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜表面的光滑結(jié)構(gòu),使細(xì)胞膜出現(xiàn)孔隙,導(dǎo)致菌體自身裂解,細(xì)胞中的物質(zhì)滲出,代謝功能不平衡,從而對(duì)抗菌抑菌效果起到重要的作用。SEM 從形態(tài)學(xué)角度驗(yàn)證了樺褐孔菌多酚的抑菌機(jī)制,與以上微生物生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率變化及紫外吸收推測(cè)的結(jié)果吻合一致。

    3 討論

    抑菌活性研究結(jié)果表明,樺褐孔菌多酚提取物對(duì)供試菌具有廣譜抑菌效果。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌的抑菌效果。可能是由于兩種細(xì)菌細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)的差異。研究發(fā)現(xiàn),革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁含有大量的肽聚糖,因此,多酚能與肽聚糖作用可以自由進(jìn)出細(xì)胞。與革蘭陽(yáng)性菌相比,革蘭氏陰性菌由于其細(xì)胞壁有外膜覆蓋,不利于酚類物質(zhì)與肽聚糖脂多糖作用,滲透進(jìn)細(xì)胞壁[21]。陳崗[22]研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌核提取物可以抑制某些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的數(shù)量和活性。曲詞等[23]在對(duì)海黍子多酚的抑菌活性研究時(shí)證明多酚對(duì)革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌均有很好的抑制作用,且對(duì)金黃葡萄球菌抑菌效果最好。最低抑菌濃度與抑菌活性的測(cè)定同時(shí)證明以金黃葡萄球菌為指示菌,進(jìn)行抑菌因素的影響是可行的。與文獻(xiàn)[24]描述相一致,在對(duì)樺褐孔菌多酚抑菌活性影響因素試驗(yàn)可知,樺褐孔菌多酚在pH為6時(shí)抑菌活性達(dá)到最大。多酚類在自然條件下處于酸性物質(zhì),物質(zhì)極其不穩(wěn)定,當(dāng)外界環(huán)境處于堿性條件下易發(fā)生反應(yīng),多酚提取物中的抑菌物質(zhì)被破壞,所以導(dǎo)致其抑菌能力變?nèi)酢_@與沈夢(mèng)薇[25]報(bào)道相一致,樺褐孔菌多酚經(jīng)低鹽濃度處理后,其抑菌活性增加,可能是由于低鹽本身是細(xì)菌生長(zhǎng)的有利條件,低鹽濃度對(duì)樺褐孔菌多酚提取物沒有影響。與董周永等[26]關(guān)于石榴提取物中多酚類物質(zhì)的存在結(jié)果相一致,儀淑敏[27]關(guān)于茶多酚對(duì)魚糜制品的冷藏保鮮作用及抑菌機(jī)理的研究也表明細(xì)菌在低鹽濃度條件下生長(zhǎng)良好。樺褐孔菌多酚提取物經(jīng)升溫和紫外照射后,其抑菌圈變化不明顯,仍然存在很強(qiáng)的抑菌能力,說(shuō)明樺褐孔菌多酚對(duì)加熱和紫外照射具有很好的穩(wěn)定性,可能原因與樺褐孔菌多酚結(jié)構(gòu)有關(guān),經(jīng)鑒定樺褐孔菌多酚具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),在紫外區(qū)具有強(qiáng)吸收峰,結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定不至于受影響,從而保證了抑菌活性的穩(wěn)定。

    目前對(duì)多酚抑菌機(jī)理有有以下幾點(diǎn)[28],多酚通過(guò)作用于細(xì)菌的內(nèi)外細(xì)胞膜,來(lái)破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性及半透性功能致使細(xì)胞膜破裂促使胞內(nèi)內(nèi)溶物外泄。多酚通過(guò)作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁而發(fā)揮其抑菌作用;多酚通過(guò)影響細(xì)菌的生物大分子合成,如脫氧核糖核酸(deoxyribonucleosides,DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)、蛋白質(zhì)等,從而影響細(xì)菌遺傳表達(dá),導(dǎo)致細(xì)菌形態(tài)改變。樺褐孔菌多酚對(duì)金黃葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的具有一定的抑制作用,且與濃度呈劑量關(guān)系。此研究與胡公義等[29]對(duì)茶多酚對(duì)空腸彎曲菌抑菌機(jī)理研究相符合,紫外吸收和DNA條帶的變化表明樺褐孔菌多酚可能影響細(xì)菌DNA而完成抑菌作用,這與唐正偉[30]對(duì)廣藿香酮及其衍生物對(duì)抗菌機(jī)理的研究相符合。樺褐孔菌多酚作用細(xì)菌電導(dǎo)率的變化與高愿軍等[31]研究的結(jié)果趨勢(shì)一致。說(shuō)明樺褐孔菌多酚影響了細(xì)胞膜的通透性。掃描電鏡觀察樺褐孔菌多酚處理過(guò)的大腸桿菌的形態(tài)變化與趙艷霞等[32]用掃描電鏡觀察得到相同的結(jié)論。說(shuō)明樺褐孔菌多酚可改變細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。樺褐孔菌多酚其本身無(wú)毒性,可以使其作為一種天然抑菌劑,可作為防腐劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。

    4 結(jié)論

    樺褐孔菌多酚具有廣譜抑菌效果,且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制能力優(yōu)于革蘭氏陰性菌,對(duì)大腸桿菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、單增李斯特菌(G+)、沙門氏菌(G-)和枯草芽孢桿菌(G+)最小抑菌濃度分別為2.50 mg/mL、1.25 mg/mL、2.50 mg/mL、5.00 mg/mL和5.00 mg/mL。在pH值為6、鹽濃度為0.8%時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到最大值,分別為18.36 mm、18.66 mm。樺褐孔菌多酚抑菌在40~121 ℃熱穩(wěn)定性較好,并且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,10 mg/mL時(shí)最大抑菌圈直徑為(19.5±0.15)mm,比同濃度下枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌分別高23.4%、8.9%、18.2%和40.2%。

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