細(xì)胞膜受體蛋白的熒光成像與寡聚化調(diào)控研究進(jìn)展

黃梓蕓，薛 倩，鄧翔熙，趙聰慧，孫蕓琳，潘松蘭，鄒 振

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，細(xì)胞化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410114）

0 前言

細(xì)胞膜受體是細(xì)胞表面的一類分子，它們能識(shí)別并結(jié)合專一的生物活性物質(zhì)（配體），生成的復(fù)合物能激活和啟動(dòng)一系列生物學(xué)過(guò)程，從而導(dǎo)致該活性物質(zhì)的最終生物學(xué)效應(yīng)[1]。細(xì)胞膜受體是溝通細(xì)胞與其外部環(huán)境的橋梁，它能感知細(xì)胞環(huán)境中各種因素的變化，隨后通過(guò)受體相互作用，影響細(xì)胞內(nèi)的生理過(guò)程發(fā)生相應(yīng)的變化[2-3]。多年以來(lái)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞膜上各種受體來(lái)改變其生物或化學(xué)活性的方法層出不窮。盡管如此，許多細(xì)胞表面受體以相對(duì)較低的量存在，但是，受體在生理和病理過(guò)程中的重要性已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[4-6]。細(xì)胞中的大多數(shù)生物過(guò)程是由各種受體激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所控制的，例如細(xì)胞周期、增殖、通訊、遷移和凋亡等[7]。因此對(duì)細(xì)胞膜表面受體的熒光成像和相關(guān)活動(dòng)熒光監(jiān)測(cè)一直是細(xì)胞化學(xué)的熱門領(lǐng)域。

此外，細(xì)胞膜受體寡聚（或受體低聚）是細(xì)胞活動(dòng)中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[8]。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，大多數(shù)受體并不是作為單個(gè)實(shí)體起作用，它們往往可以在相應(yīng)的配體介導(dǎo)下組裝成二聚體或高階寡聚體形式[9]，細(xì)胞膜受體可利用該機(jī)制將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)機(jī)器中，以促進(jìn)細(xì)胞中下游信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。受體寡聚的形成，大多數(shù)發(fā)生在一些主要的受體家族中，例如整聯(lián)蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）、受體酪氨酸激酶（RTK）、T細(xì)胞受體（TCR）等[11]。它們參與了大多數(shù)重要的細(xì)胞過(guò)程[12]。細(xì)胞表面的受體二聚化或高階寡聚化作為激活受體的一般機(jī)制，通常被認(rèn)為是第一步[13]。因此，驗(yàn)證細(xì)胞表面受體的表達(dá)水平和二聚化狀態(tài)對(duì)于深入了解細(xì)胞中下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。該文綜述了用于活細(xì)胞中受體監(jiān)測(cè)成像策略及調(diào)控細(xì)胞膜受體寡聚化策略的最新發(fā)展。

1 細(xì)胞膜受體靶向成像

化學(xué)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展，引起了人們以自定義的方式對(duì)細(xì)胞表面受體進(jìn)行監(jiān)測(cè)與調(diào)控的高度興趣[14]。對(duì)細(xì)胞膜受體精確和可靠的監(jiān)測(cè)，是人工調(diào)控細(xì)胞膜受體并操縱細(xì)胞下游信號(hào)的關(guān)鍵和初始過(guò)程。細(xì)胞膜受體作為許多疾病的生物標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)，實(shí)時(shí)原位、動(dòng)態(tài)準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)和調(diào)控細(xì)胞膜受體，對(duì)探索受體與細(xì)胞生理學(xué)的復(fù)雜聯(lián)系以及生理和病理功能具有重要意義[15]。已經(jīng)開發(fā)出許多策略用于識(shí)別監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜表面受體，這些策略為精確識(shí)別特定細(xì)胞和對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行治療提供了大量重要的時(shí)空信息。近幾年來(lái)，已經(jīng)開發(fā)出了利用單克隆抗體、DNA適配體、靶向肽等一系列策略來(lái)對(duì)細(xì)胞膜表面受體進(jìn)行識(shí)別監(jiān)測(cè)[16]。

1.1 抗體識(shí)別的受體成像

單克隆抗體，是一種通過(guò)采用雜交瘤技術(shù)制備的，由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體。自從單克隆抗體問(wèn)世以來(lái)，由于其獨(dú)有的特征已經(jīng)迅速作為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的診斷試劑，譬如特異性強(qiáng)、純度高和均一性好等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于免疫組化和流式細(xì)胞儀等技術(shù)[17]。2020年，Wang等[18]基于HER2受體特異性單克隆抗體Herceptin（一種注射用曲妥珠單抗，它能夠與存在于HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞表面的HER2受體結(jié)合，阻止它們接收生長(zhǎng)信號(hào)并標(biāo)記它們被免疫系統(tǒng)破壞。）合成了一種熒光Au NCs的穩(wěn)定劑。該策略如圖1所示：三價(jià)Au離子鑲嵌在Herceptin分子復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的空腔中，隨后在堿性條件下，Herceptin的還原性被激活，以形成Au NCs。這種Herceptin單克隆抗體穩(wěn)定化的Au NCs（Her-Au NCs）將對(duì)HER2受體的胞外域保持高親和力，并具有用作HER2受體特異性熒光成像光學(xué)探針的潛力。

圖1 Her-Au NC的合成與特異性活細(xì)胞表面HER2受體成像機(jī)理示意圖[18]Fig.1 Her-Au NC mechanism of action[18]

2018年，Lin等[19]提出一種split proximity circuit（SPC）的一鍋法分子工具箱，用于細(xì)胞表面受體成簇的自主可視化檢測(cè)。該策略如圖2所示：起始鏈I1和I2首先與特定的識(shí)別抗體結(jié)合在一起，在沒(méi)有目標(biāo)受體的二聚體存在時(shí)，作為兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)體存在。但當(dāng)它們與靶受體結(jié)合后，I1和I2的局部濃度增加，這促進(jìn)了結(jié)構(gòu)域a的結(jié)合以觸發(fā)發(fā)夾單體（HP1和HP2）之間的雜交鏈反應(yīng)（HCR）。該策略通過(guò)抗體識(shí)別和一系列自主DNA雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)局部無(wú)酶信號(hào)放大。研究的對(duì)象是均在細(xì)胞裂解物中和原位固定的全細(xì)胞上的HER2:HER2同源二聚體和HER2:HER3異源二聚體。

圖2 用于細(xì)胞表面受體聚類的局部檢測(cè)和可視化的SPC示意圖[19]Fig.2 Schematics of SPC for the localized detection and visualization of cell surface receptor clustering[19]

1.2 核酸適配體的受體成像

核酸適配體，一段單鏈DNA或RNA寡核苷酸，是一種新型的細(xì)胞表面受體識(shí)別靶向劑[20]。利用核酸適配體對(duì)細(xì)胞膜受體進(jìn)行靶向識(shí)別成像具有多種優(yōu)勢(shì)。核酸適配體以高選擇性、可編程性和對(duì)受體高親和力結(jié)合的能力受到人們的極大關(guān)注，其體積小且合成方便、便宜，并且具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，低的抗原和免疫原性潛力以及優(yōu)異的組織穿透能力等[21]。近些年，已經(jīng)開發(fā)出多種利用功能化核酸適配體對(duì)細(xì)胞膜受體進(jìn)行靶向識(shí)別成像、藥物精準(zhǔn)遞送以及對(duì)一些與疾病相關(guān)的受體作為拮抗劑的系統(tǒng)[22]。

癌細(xì)胞行為的改變通常是由于某些細(xì)胞表面受體的突變或過(guò)度表達(dá)。最近，Tan等[21]利用多種DNA適配體以及相關(guān)的基于toehold反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高特異性鑒定。多種DNA適配體能夠選擇性對(duì)癌癥細(xì)胞表面多種受體進(jìn)行識(shí)別，以及相關(guān)的toehold反應(yīng)激活以進(jìn)行信號(hào)整合和放大。該系統(tǒng)采用“toehold區(qū)域締合”的方法，該方法可以以編程的和定時(shí)的方式激活用于雜交鏈反應(yīng)（HCR）啟動(dòng)的多個(gè)toehold區(qū)域，從而達(dá)到信號(hào)的整合和放大。該策略能夠以優(yōu)異的靈敏度和準(zhǔn)確性實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的鑒定和分離（圖3）。

圖3 基于多種DNA適配體及相關(guān)toehold反應(yīng)HCR成像機(jī)理[21]Fig.3 HCR imaging mechanism based on multiple DNA aptamers and related toehold reactions[21]

單分子成像技術(shù)被廣泛用于這些標(biāo)記物的可視化和評(píng)估其相關(guān)的生物學(xué)特征，如受體擴(kuò)散和同源/異源受體-受體相互作用。2020年，Burke等[23]基于適配體開發(fā)了一種可逆、高特異性、無(wú)干擾的親和探針，應(yīng)用于活細(xì)胞表面受體的單分子成像。這種可逆性探針可以在不干擾EGFR內(nèi)源性行為的情況下，對(duì)與單分子示蹤（Single molecule tracking，SMT）結(jié)合的活癌細(xì)胞的EGFR密度水平進(jìn)行光致不敏感檢測(cè)，從而獲得高密度受體的運(yùn)動(dòng)圖譜。該方法基于適配體與其靶標(biāo)之間的隨機(jī)和瞬時(shí)結(jié)合來(lái)定位和跟蹤單個(gè)受體。他們成功地對(duì)活癌細(xì)胞上腫瘤標(biāo)記物（EGFR）實(shí)現(xiàn)了單分子成像，并且通過(guò)合理設(shè)計(jì)適配體序列來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)EGFR的親和力，從而確定受體運(yùn)動(dòng)及密度（圖4）。

圖4 熒光偶聯(lián)適體探針作用原理[23]Fig.4 Principle of fluorescence coupled aptamer Probe[23]

2021年，Song等[24]報(bào)告了一個(gè)“turn-on”策略，以可視化細(xì)胞表面HER（人類表皮生長(zhǎng)因子受體）二聚體。該工作利用鳥嘌呤(G)序列特異性適配體識(shí)別和鄰近誘導(dǎo)DNA模板銀納米團(tuán)簇（DNA/AgNCs）熒光激活的優(yōu)勢(shì)，將兩種具有不同熒光性質(zhì)的DNA/AgNCs序列連接到相應(yīng)的HER適配體上，形成適配體功能化的AgNCs探針，并將富G序列附加到相應(yīng)的HER適配體作為增強(qiáng)子。在蛋白質(zhì)二聚體存在的情況下，經(jīng)適配體特異性識(shí)別和結(jié)合后，可使AgNCs探針靠近富G探針，激發(fā)相應(yīng)的熒光。該方法成功地實(shí)現(xiàn)了HER2:HER2同聚體和HER2:HER3雜二聚體的同時(shí)成像，為同時(shí)檢測(cè)多個(gè)HER2二聚體提供了新的思路（圖5）。

圖5 基于鄰近誘導(dǎo)的DNA/AgNCs熒光激活的HER2二聚原位成像示意圖[24]Fig.5 Schematic illustration of the turn-on strategy for HER2 dimerization imaging in situ based on proximityinduced fluorescence activation of DNA/AgNCs[24]

1.3 小分子的受體識(shí)別

一些細(xì)胞膜受體在疾病的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。近些年，已經(jīng)開發(fā)出了許多小分子受體靶向熒光激動(dòng)劑，并已經(jīng)將其應(yīng)用到活細(xì)胞[25]。關(guān)于生物分子成像技術(shù)，與基于放射性同位素的探針相比，基于熒光的造影劑發(fā)射非電離輻射并且具有更長(zhǎng)的保質(zhì)期。此外，有機(jī)染料的熒光特性可以通過(guò)化學(xué)修飾在很寬的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)[26-27]。

作為跨膜蛋白的最大家族，GPCRs（G蛋白偶聯(lián)受體）是目前所有藥物中近40%的結(jié)合作用的靶點(diǎn)。α1-腎上腺素能受體（α1-受體）是GPCRs家族的重要成員之一，在介導(dǎo)多種生理效應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，主要分為α1A，α1B和α1D三個(gè)亞型。α1-受體參與肝糖代謝、平滑肌收縮以及心肌的肌力和變時(shí)性等有關(guān)調(diào)節(jié)，還與良性前列腺增生、下尿路癥狀、高血壓、前列腺癌等疾病密切相關(guān)。因此，進(jìn)一步研究α1-受體的分子藥理學(xué)至關(guān)重要，迫切需要大量新穎有效的熒光探針?lè)肿?。最近，Li等[28]基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）開關(guān)，將熒光團(tuán)7-（二乙氨基）香豆素-3-羧酸與α1-受體激動(dòng)劑去氧腎上腺素偶聯(lián)開發(fā)了α1-受體的新型熒光激動(dòng)劑。在此方案中，去氧腎上腺素（PE）作為α1-ARs的選擇性激動(dòng)劑，可以與α1-ARs結(jié)合，同時(shí)也作為一種猝滅劑。7-（二乙氨基）香豆素-3-羧酸（DAC）作為熒光團(tuán)。由于PET效應(yīng)，探針只表現(xiàn)出最低水平的熒光，但在與α1-ARs的配體結(jié)合域結(jié)合后，PET效應(yīng)被阻斷，然后熒光被打開。研究結(jié)果表明，這些熒光探針?lè)肿优cα1-受體具有有效的結(jié)合，可用于活細(xì)胞中選擇性的熒光標(biāo)記α1-受體，并且可以應(yīng)用于活細(xì)胞中受體內(nèi)在化動(dòng)態(tài)過(guò)程的追蹤。同時(shí)，這些探針還作為熒光示蹤劑用于構(gòu)建基于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）的結(jié)合測(cè)定方法，該方法具有篩選α1-受體激動(dòng)劑和拮抗劑的潛力。這些基于PET開關(guān)的熒光激動(dòng)劑，具有作為α1-受體生理和藥理學(xué)研究和藥物研發(fā)的可視化工具的潛力（圖6）。

圖6 基于PET效應(yīng)的α1-受體熒光激動(dòng)劑的熒光開-關(guān)作用示意圖[28]Fig.6 Principles of receptor fluorescent agonists[28]

葉酸（Folic acid，F(xiàn)R）是一碳代謝途徑和核苷酸合成所必需的物質(zhì)，早在90年代就已作為癌癥組織成像的靶向配體。40%左右的癌癥中α型葉酸受體（FR-α）過(guò)表達(dá)，特別是卵巢癌等惡性組織，而除腎臟以外的正常組織均不會(huì)積聚葉酸及其結(jié)合物。即使與成像劑結(jié)合后，葉酸仍以高親和力與FR-α結(jié)合，并經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程進(jìn)入細(xì)胞。另外，近紅外（NIR）熒光染料由于較深的組織滲透和較低的自發(fā)熒光而廣受關(guān)注。2019年，Yasuteru等[29]將含有羧基的硅基羅丹明通過(guò)帶負(fù)電的三肽結(jié)構(gòu)與葉酸相連接，設(shè)計(jì)合成了一種新型NIR熒光探針FolateSiR-1。硅基羅丹明作為熒光團(tuán)，是一種NIR熒光染料；葉酸作為葉酸受體的配體，與硅基羅丹明帶負(fù)電的三肽結(jié)構(gòu)連接在一起。該探針作為一種葉酸受體靶向性熒光探針，其在30 min內(nèi)聚集在荷瘤小鼠的FR過(guò)表達(dá)區(qū)域且表現(xiàn)出高達(dá)83倍的腫瘤-背景比（TBR）（圖7）。

圖7 (A)現(xiàn)有的近紅外熒光探針用于活體動(dòng)物體內(nèi)熒光成像的成像策略；(B)用于檢測(cè)葉酸受體的熒光探針的分子設(shè)計(jì)[29]Fig.7 Molecular design of fluorescent probe for detecting folate receptor[29]

2 細(xì)胞膜受體靶向調(diào)控

由上面介紹可知，細(xì)胞表面受體的各個(gè)家族在感知到細(xì)胞外刺激后會(huì)經(jīng)歷從自由擴(kuò)散的單體到二聚或高階低聚物的轉(zhuǎn)變。大量的證據(jù)也表明，各種細(xì)胞表面受體，無(wú)論是同聚還是異聚，都會(huì)對(duì)下游各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用[30-31]。因此，人工調(diào)節(jié)受體的寡聚化對(duì)于精確控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞行為提供了無(wú)限的可能。近年來(lái)，利用DNA手段、蛋白質(zhì)手段、小分子手段及基于物理刺激的方法來(lái)調(diào)節(jié)受體的寡聚引起了科研工作者的廣泛關(guān)注。由于不需要對(duì)細(xì)胞受體進(jìn)行遺傳修飾，可以在不干擾天然受體結(jié)構(gòu)和功能的情況下調(diào)節(jié)更多的內(nèi)源性受體。同時(shí)，這些方法具有靈活和可設(shè)計(jì)的特性，將會(huì)在之后的應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)展[32-34]。

2.1 蛋白質(zhì)介導(dǎo)的受體寡聚化

受體的天然配體大多數(shù)是蛋白質(zhì)分子。由于配體蛋白質(zhì)具有高親和力和靶向特異性，使得其在誘導(dǎo)受體寡聚領(lǐng)域具有很高應(yīng)用的潛力[35]。2020年，Komatsu課題組[36]報(bào)告了一種抗體點(diǎn)擊作為修飾靶向細(xì)胞表面抗體功能的策略。通過(guò)增加抗體與目標(biāo)抗原結(jié)合的有效濃度，進(jìn)行分子間無(wú)銅點(diǎn)擊反應(yīng)，選擇性地在細(xì)胞表面啟動(dòng)抗體交聯(lián)。通過(guò)在HER2過(guò)表達(dá)細(xì)胞表面交聯(lián)四嗪和雙環(huán)壬炔修飾的曲妥珠單抗，觀察到抗體攝取增加和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活。研究結(jié)果表明，交聯(lián)反應(yīng)可以顯著改變蛋白質(zhì)的生物物理性質(zhì)，激活其在目標(biāo)細(xì)胞上的獨(dú)特功能，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)的操縱（圖8）。

圖8 細(xì)胞表面抗體交聯(lián)的設(shè)計(jì)[36]Fig.8 Design of cell surface antibody cross-linking[36]

2020年，Wang等[37]開發(fā)了一種基于肽的、無(wú)毒的HER2受體介導(dǎo)的可轉(zhuǎn)化納米粒子，它針對(duì)單一的HER2+乳腺癌模型非常有效。該方案設(shè)計(jì)并合成了一種智能超分子肽BP-FFVLKYCDGFYACYMDV，該肽能夠在水性條件下和在循環(huán)條件下組裝成納米顆粒（NP），以及在腫瘤部位原位轉(zhuǎn)化為納米原纖維（NF）結(jié)構(gòu)并與細(xì)胞表面HER2結(jié)合。這種可轉(zhuǎn)化的肽單體（TPM）存在一個(gè)二硫鍵環(huán)肽HER2結(jié)合域，一種抗HER2/neu抗體的肽模擬物（圖9）。

圖9 智能超分子肽BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV納米粒子的組裝及工作原理[37]Fig.9 Assembly and working principle of BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV[37]

2.2 小分子介導(dǎo)的受體寡聚化

近些年，許多的細(xì)胞膜受體已經(jīng)成為藥物靶標(biāo)。激動(dòng)劑或拮抗劑的發(fā)展對(duì)受體寡聚可能會(huì)產(chǎn)生重要的治療應(yīng)用價(jià)值。小分子對(duì)受體寡聚的調(diào)控，通常能夠讓人們對(duì)受體與小分子配體之間結(jié)合的詳細(xì)機(jī)制和定量關(guān)系有充分的理解。與蛋白質(zhì)藥物相比，小分子藥物在設(shè)計(jì)和合成方面可以更加靈活[38]。

Toll樣受體（TLR）是最廣泛認(rèn)可的一組病原體相關(guān)或損傷相關(guān)分子模式（PAMPs和DAMPs）受體，可識(shí)別病原體或異常細(xì)胞的分子成分并引發(fā)先天免疫應(yīng)答。它們還可以誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，例如疫苗在體內(nèi)發(fā)揮作用往往是由于TLR系統(tǒng)的激活。最近，Boger等[39]合成了一種有吸引力的人類TLR小分子激動(dòng)劑，其能夠在極低的濃度（EC50=110 pmol/L）下引起TLR1/TLR2二聚化（圖10）。

圖10 TLR小分子激動(dòng)劑的分子式及其誘導(dǎo)TL1與TL2二聚化的工作原理[39]Fig.10 The molecular formula and working principle of TLR[39]

2.3 有機(jī)高分子介導(dǎo)的受體寡聚化

目前，已經(jīng)開發(fā)出使用多價(jià)合成聚合物來(lái)控制細(xì)胞表面受體的空間分布，從而以定制的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。多價(jià)合成聚合物往往能夠使細(xì)胞表面受體成為受體簇，多價(jià)結(jié)合比二價(jià)有更高的親和力和凋亡誘導(dǎo)能力。但是，多價(jià)結(jié)合高度依賴于聚合物的結(jié)構(gòu)以及配體密度，這可能對(duì)具有高配體密度聚合物的合成造成困難[40]。

Kopecek等[41]通過(guò)可逆的加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合反應(yīng)，然后通過(guò)硫醚鍵連接Fab'片段，合成了嫁接有多個(gè)抗CD20單克隆抗體（mAb）Fab'片段的-（2-羥丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）。多價(jià)化合物會(huì)導(dǎo)致CD20受體交聯(lián)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CD20是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）最可靠的生物標(biāo)志物之一，95%以上的B淋巴瘤帶有CD20表面受體。該課題組合成了五個(gè)具有不同分子量和化合價(jià)（每個(gè)聚合物鏈的Fab'量）的共軛物，結(jié)果表明，多價(jià)導(dǎo)致更高的親和力和凋亡誘導(dǎo)能力（圖11）。

圖11 抗體功能化的多價(jià)化合物示意圖[41]Fig.11 Schematic diagram of antibody functionalized multivalent compounds[41]

Ji等[42]開發(fā)了一種利用在細(xì)胞表面發(fā)生聚合作用來(lái)聚集細(xì)胞表面受體的策略。作為概念證明，最初合成了抗CD20適體偶聯(lián)的大分子單體，然后通過(guò)配體-受體相互作用將其有效地引入到非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞表面。該系統(tǒng)由抗CD20適配體修飾的大分子單體和引發(fā)劑過(guò)硫酸銨（APS）組成?？笴D20適體修飾的大分子單體可通過(guò)CD20受體與適體之間的相互作用與Raji細(xì)胞表面結(jié)合，然后APS將觸發(fā)與Raji細(xì)胞表面結(jié)合大分子單體的聚合，隨后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡（圖12）。

圖12 抗CD20適體修飾的高分子單體作用原理[42]Fig.12 Principle of action of polymer monomer modified by anti-CD20 aptamer[42]

2.4 物理刺激介導(dǎo)的受體寡聚化

除了化學(xué)或生物學(xué)基礎(chǔ)策略之外，一些物理因素也可以用作調(diào)節(jié)受體低聚的外部線索，比如磁場(chǎng)、溫度和光等[43]。近些年以來(lái)，利用這些原理在受體調(diào)控以及腫瘤治療等相關(guān)領(lǐng)域取得了很大的突破。

由于磁場(chǎng)可以對(duì)順磁性粒子施加適當(dāng)?shù)牧Γ虼思{米粒子的磁性驅(qū)動(dòng)為控制細(xì)胞提供了一種新的策略。磁場(chǎng)可以通過(guò)磁力使磁性納米顆粒聚集，從而導(dǎo)致納米顆粒-受體復(fù)合物在細(xì)胞表面聚集。通常，磁性納米顆粒涂有特定的配體，這些配體將它們連接到細(xì)胞表面上的受體。當(dāng)細(xì)胞暴露于磁場(chǎng)中時(shí)，磁性納米顆粒被拉動(dòng)，從而使受體進(jìn)入寡聚狀態(tài)。2014年，利用這種方法，Schneck等[44]實(shí)現(xiàn)了對(duì)T細(xì)胞的活化（圖13）。

圖13 功能化納米磁珠的結(jié)構(gòu)及其作用原理[44]Fig.13 The structure and principle of functionalized nano magnetic beads[44]

另一個(gè)典型的物理刺激是光，當(dāng)需要對(duì)生物過(guò)程進(jìn)行時(shí)空控制時(shí)，光是最常研究的物理?xiàng)l件。光響應(yīng)材料由于具有空間和時(shí)間精度高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。Aida等[45]首次報(bào)道了一種可光裂的分子膠PCGlue-NBD，它可以作為抑制劑來(lái)觸發(fā)受體二聚化和激活。該化合物通過(guò)其Gu+基團(tuán)和蛋白質(zhì)的氧陰離子基團(tuán)之間的多價(jià)鹽橋相互作用，牢固地附著在目標(biāo)蛋白質(zhì)上，并利用其巨大的樹突楔形覆蓋蛋白質(zhì)表面，包括它們的界面區(qū)域，以抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）。然而，在紫外線照射下，PCGlue-NBD在氨基甲酸酯鍵處被切斷，形成只有三個(gè)Gu+吊墜的小樹突。黏附的多價(jià)性降低可能導(dǎo)致靶蛋白的釋放，而可以參與PPIs。作為一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究，該工作選擇肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)與其受體Met（間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化受體）之間的PPI作為靶點(diǎn)，HGF和Met之間的PPI可以啟動(dòng)細(xì)胞增殖、存活和遷移的信號(hào)通路，從而促進(jìn)傷口愈合（圖14）。由此產(chǎn)生的HGF/Met相互作用允許Met磷酸化二聚，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的時(shí)空遷移。

圖14 PCGlue-NBD在關(guān)閉和開啟由Met與其配體HGF之間的相互作用引起的Met二聚化的機(jī)制作用的示意圖[45]Fig.14 Schematic illustration of the mechanistic role of PCGlue-NBD for turning off and on a protein-protein interaction(PPI)between hepatocyte growth factor HGF and its receptor c-Met[45]

2.5 DNA介導(dǎo)的受體寡聚化

DNA已經(jīng)被視為納米材料和生物技術(shù)中的強(qiáng)大構(gòu)建單元。DNA的可編程性和低免疫原性使其具有精確設(shè)計(jì)和應(yīng)用的便利性。Tang等[46]設(shè)計(jì)了一種基于DNA四面體誘導(dǎo)鄰近Met二聚化的策略，可通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），對(duì)受體的二聚化狀態(tài)進(jìn)行可視化。在這種納米策略中，適配體作為識(shí)別序列，用于特異性結(jié)合受體單體。隨后相鄰的開關(guān)探針會(huì)相互雜交，誘導(dǎo)Met的二聚化，同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)Cy3和Cy5之間的FRET。該方法中，DNA四面體的良好穩(wěn)定性保證了在多種生物樣品中的應(yīng)用價(jià)值。這項(xiàng)工作為開發(fā)新型蛋白質(zhì)二聚化可視化納米策略提供了一種新方法（圖15）。

圖15 DNA四面體納米探針用于檢測(cè)Met二聚體的制備和應(yīng)用示意圖[46]Fig.15 Schematic illustration of preparation and application of DNA tetrahedron nanoprobes for detecting Met dimer[46]

為了開發(fā)一個(gè)智能、安全且能精確調(diào)控的治療平臺(tái)，2019年，Sando等[47]設(shè)計(jì)了一種基于細(xì)胞外生物活性物質(zhì)誘導(dǎo)可編程的Met激活的HGF模擬物DRIPaR。該方案基于雙特異性DNA適配體，由一個(gè)能與Met靶向結(jié)合的序列和另一個(gè)能與細(xì)胞外空間中生物活性物質(zhì)結(jié)合的序列組成，該細(xì)胞外生物活性物質(zhì)可能是由一些人體內(nèi)含有的不同類型的分子，例如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、凝血酶等。在加入一個(gè)細(xì)胞外生物活性物質(zhì)后，它將與雙特異性DNA適配體形成一個(gè)2∶1的三元復(fù)合物，然后誘導(dǎo)Met二聚化和激活（圖16）。

圖16 誘導(dǎo)凝血酶依賴性或PDGF依賴性Met活化的DRIPaR原理圖[47]Fig.16 Schematic diagram of DRIPaR that induces thrombin-dependent or PDGF-dependent Met activation[47]

與光遺傳學(xué)相比，直接利用紫外光調(diào)控DNA的組裝這種方法更方便，不需要通過(guò)耗時(shí)且昂貴的基因工程。然而，利用紫外線照射也有局限性，例如低的光穿透率和生物系統(tǒng)中內(nèi)發(fā)生色團(tuán)的固有吸收等。為了克服這些缺點(diǎn)，2019年，Nie等[48]提出了一種基于等離子體金納米棒（Au NRs）的新型近紅外（NIR）光激活DNA激動(dòng)劑系統(tǒng)（NIR-DA），用于RTK二聚化和細(xì)胞信號(hào)激活的光學(xué)控制。該方案首先將過(guò)將預(yù)滅活的DNA激動(dòng)劑偶聯(lián)到金納米棒（Au NRs）上來(lái)制備此納米器件。經(jīng)過(guò)近紅外光處理后，DNA激動(dòng)劑通過(guò)Au NRs的基于局部表面等離子共振（LSPR）產(chǎn)生的光熱效應(yīng)釋放并變得有活性?；钚訢NA激動(dòng)劑從Au NRs中釋放出來(lái)并觸發(fā)結(jié)合誘導(dǎo)的RTK二聚化，并激活活細(xì)胞中的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。NIR的高滲透性使其在深層組織應(yīng)用中成為可能（圖17）。

圖17 基于等離子體Au NRs的NIR光激活NIR-DA系統(tǒng)用于誘導(dǎo)受體二聚化原理圖[48]Fig.17 Schematic diagram of light-activated NIR-DA used to induce receptor dimerization[48]

由于細(xì)胞表面不會(huì)單單只表達(dá)某一種細(xì)胞表面受體，而是會(huì)表達(dá)多種表面受體，同時(shí)評(píng)估兩種或多種細(xì)胞表面受體以識(shí)別特定的病變細(xì)胞，將會(huì)潛在地提高治療選擇性并盡可能地減少副作用。目前，大多數(shù)研究致力于通過(guò)誘導(dǎo)受體同聚作用來(lái)對(duì)受體進(jìn)行激活和促進(jìn)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，抑制受體激活也是調(diào)節(jié)下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞行為的一種手段。因此，在2019年，Yang等[49]開發(fā)了一種被稱為雙特異性適體誘導(dǎo)的人工蛋白質(zhì)配對(duì)（BAAP）的策略，通過(guò)誘導(dǎo)異源受體二聚化來(lái)選擇性調(diào)節(jié)受體功能。在這種策略中，雙特異性適體探針充當(dāng)分子介體，以結(jié)合靶受體和配對(duì)受體，這使兩種受體在活細(xì)胞膜上緊密靠近。配對(duì)的受體不僅可以用作增強(qiáng)細(xì)胞選擇性的癌癥生物標(biāo)志物，而且還可作為通過(guò)強(qiáng)大的位阻效應(yīng)抑制靶受體功能的阻斷助劑。這項(xiàng)研究提出了一種通過(guò)人工誘導(dǎo)異源受體二聚化并增加靶受體周圍位阻的調(diào)節(jié)策略。通過(guò)使用不同的適體元件，使得該策略可以很容易地?cái)U(kuò)展到其他靶標(biāo)受體。因此，該策略不僅揭示了雙特異性適配體探針作為選擇性調(diào)節(jié)受體功能的分子介質(zhì)的潛力，而且也為開發(fā)新的治療藥物提供了一種通用的方法（圖18）。

圖18 選擇性調(diào)節(jié)Met受體功能和下游信號(hào)通路的BAAP策略的示意圖[49]Fig.18 Schematic diagram of BAAP strategy for selective regulation of Met receptor function and downstream signaling pathways[49]

3 結(jié)論與展望

細(xì)胞膜受體參與細(xì)胞周期、增殖、遷移、通訊等多種生物過(guò)程，也是調(diào)節(jié)生理和病理狀態(tài)的重要靶點(diǎn)。實(shí)時(shí)原位、動(dòng)態(tài)準(zhǔn)確地對(duì)一些主要受體家族進(jìn)行監(jiān)測(cè)和調(diào)控，對(duì)探索受體與細(xì)胞生理學(xué)的復(fù)雜聯(lián)系以及生理和病理功能具有重要意義。并且為開發(fā)新型治療藥物提供了一種通用的方法和全新的思路。隨著分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展和相互融合，同時(shí)對(duì)生物系統(tǒng)更加全面、深層次的認(rèn)識(shí)，為人工監(jiān)測(cè)和調(diào)控細(xì)胞膜受體，進(jìn)而控制細(xì)胞行為提供了無(wú)限的可能。目前，大多數(shù)特異性識(shí)別細(xì)胞膜受體的分子探針主要是一類生物分子，例如DNA、肽和抗體。但是這些生物分子通常在生命系統(tǒng)中缺乏可靠的穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間。同時(shí)，體內(nèi)酶促降解和非特異性蛋白質(zhì)吸附會(huì)導(dǎo)致受體靶向監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)的特異性和有效性低。因此，在未來(lái)，開發(fā)一種能夠在復(fù)雜生物環(huán)境中穩(wěn)定存在且對(duì)各類受體監(jiān)測(cè)和調(diào)控通用的策略是非常迫切需要的。另外，由于該領(lǐng)域仍處于起步階段并處于快速發(fā)展階段，所以需要努力克服局限性，進(jìn)一步滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。