右美托咪定對肺癌A549細(xì)胞炎癥、凋亡及化療敏感性的研究Δ

張 強(qiáng)，邱德亮，彭 英，董碧倩

(1.成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610100； 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000)

肺癌是世界上常見的惡性腫瘤之一[1]。近年來，盡管使用了包括外科手術(shù)、放射和化學(xué)療法在內(nèi)的多種療法，但是肺癌患者的存活率仍然不能令人滿意[2-3]。肺癌的不良預(yù)后主要是由于其高度惡性和相應(yīng)的復(fù)雜生物學(xué)特征以及化療藥的耐藥性。5-氟尿嘧啶在肺癌的治療中已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年，其通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成[4]?；瘜W(xué)耐藥性仍然是成功進(jìn)行5-氟尿嘧啶化療的主要障礙。右美托咪定是一種有效且高度選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，其抗腫瘤活性同紫杉醇、喜樹堿相似，且副作用較小[5]；右美托咪定口服給藥在結(jié)腸癌、食管癌及胰腺癌的治療中具有良好的療效；右美托咪定最近被證明具有免疫保護(hù)和抗炎特性，可以通過直接抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和改變腫瘤的微環(huán)境來抑制腫瘤的生長[6]。研究結(jié)果已證實，右美托咪定可明顯增強(qiáng)化療藥以及放療手段的療效；在肺癌、前列腺癌細(xì)胞中明顯觀察到右美托咪定可誘導(dǎo)其凋亡[7]。右美托咪定對正常細(xì)胞的毒性小，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)右美托咪定應(yīng)用于細(xì)胞淋巴瘤，但在肺癌的治療方面鮮有報道。研究結(jié)果表明，核因子κB(NF-κB)的激活可能在調(diào)節(jié)涉及腫瘤發(fā)生、遷移和侵襲的基因中起重要作用[8-9]。本研究擬基于NF-κB、原癌基因(c-myc)的表達(dá)改變，探討右美托咪定對肺癌A549細(xì)胞炎癥、凋亡及化療敏感性的影響，為肺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MK3酶標(biāo)儀(美國熱電公司)；CKX53顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；ABI 7300 Real Time PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)。

1.2 藥品與試劑

5-氟尿嘧啶、右美托咪定(均為原料藥，純度均為99.99%，美國Gibco公司，批號為S-0617、S-1129)；二甲基亞砜(DMSO)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、結(jié)晶紫染色液及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號為SC1674、SD2798、C0252、C0068M、SF5364-10及P0018FM)；白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國CST中國公司，批號為F190513、F190429及F190722)；多聚甲醛、PVDF膜(德國默克公司，批號為D3318M、D6044K)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海群己生物科技有限公司，批號為KA0714)；Matrigel膜、聚碳酸酯膜(賽默飛世尓科技中國有限公司，批號為M6047、M0918)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號為R0024FT)；PrimeScript實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq(寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司，批號為RA88179、RK07511)；蛋白質(zhì)提取試劑盒、SDS-PAGE電泳及TBST緩沖液(美國Bio-Rad公司，批號為SF2672-10、SK3015及SI06579)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號為R21252)；抗NF-κB抗體、抗c-myc抗體、抗GAPDH抗體及HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG多克隆抗體(美國Abcam公司，批號為ab0415、ab0711、ab0957及ab9057)。

1.3 實驗細(xì)胞

人肺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，并在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。一旦細(xì)胞達(dá)到70%～80%的融合度，就將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并使用0.25%胰蛋白酶重新接種。所有實驗均使用指數(shù)生長的細(xì)胞。在實驗前1日，對胰蛋白酶消化的指數(shù)生長A549細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N至6孔板中。實驗當(dāng)日，細(xì)胞融合度在70%～90%范圍內(nèi)，并用無血清RPMI-1640代替培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 細(xì)胞分組

A549細(xì)胞組如前所述常規(guī)培養(yǎng)；5-氟尿嘧啶組的培養(yǎng)方法同A549細(xì)胞組，加入5-氟尿嘧啶，使5-氟尿嘧啶最終為40.0 μg/ml[預(yù)實驗求出5-氟尿嘧啶對A549細(xì)胞的半致死濃度(LC50)為80.0 μg/ml，以1/2 LC50為作用劑量]；右美托咪定組培養(yǎng)方法同A549細(xì)胞組，加入右美托咪定，使右美托咪定最終為80.0 μg/ml(預(yù)實驗求出右美托咪定對A549細(xì)胞的LC50為160.0 μg/ml，以1/2 LC50為作用劑量)；聯(lián)合組的培養(yǎng)方法同A549細(xì)胞組，加入5-氟尿嘧啶(40.0 μg/ml)以及右美托咪定(80.0 μg/ml)；上述各組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2，2%O2，93%N2)。以上各組每孔設(shè)6個平行樣，培養(yǎng)72 h。

2.2 細(xì)胞炎癥因子IL-2、IL-6及TNF-α蛋白水平的測定

于MK3酶標(biāo)儀上采用酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞炎癥因子IL-2、IL-6及TNF-α蛋白水平。

2.3 細(xì)胞活力及單克隆形成數(shù)目測定

將細(xì)胞1×103個/ml鋪于96孔組織培養(yǎng)板中，通過MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-1—2-基)-2,5-二苯基四唑溴化銨]還原法評價細(xì)胞的活力。加入 MTT(5 mg/ml)10 μl，并分離細(xì)胞。用MTT試劑染色4 h。然后，除去培養(yǎng)基，并通過上下移液幾次將100 μl二甲基亞砜添加到每個孔中。測量測試波長為570 nm、參考波長為630 nm的吸光度(OD)，以獲得樣品信號。沒有細(xì)胞的孔(僅DMSO)用作空白組，MK3酶標(biāo)儀測量OD。細(xì)胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)。收集培養(yǎng)結(jié)束的細(xì)胞接種在24孔板中(每孔1×104個細(xì)胞)，計數(shù)6 d。為了進(jìn)行細(xì)胞集落形成測定，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種在6孔板(1×103個/孔)中，并培養(yǎng)10 d。每3 d更換1次培養(yǎng)基。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色。在CKX53顯微鏡下計算菌落數(shù)。

2.4 細(xì)胞凋亡水平的測定

使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡水平。將細(xì)胞在PBS緩沖液中洗滌，重懸于200 μl Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液中，與5 μl Annexin V-FITC綴合物混合，并在室溫(25 ℃)下于黑暗中孵育10 min。然后，棄去上清液，將剩余的沉淀輕輕重懸于190 μl Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液中。將10 μl PI添加到每個樣品中，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，重復(fù)6次。

2.5 細(xì)胞侵襲遷移水平的測定

將腔室用無血清培養(yǎng)基洗滌，然后添加Matrigel基底膠均勻覆蓋聚碳酸酯膜的表面(孔徑為8 μm)，以創(chuàng)建Matrigel膜。腔室的下部隔室充滿無血清培養(yǎng)基。將A549細(xì)胞(4×105個)接種到上腔室中，并在5%的CO2環(huán)境中于37 ℃孵育48 h。溫育48 h后，用棉簽擦洗除去膜上表面的細(xì)胞。侵入膜下表面的細(xì)胞用甲醇固定，并用1%的結(jié)晶紫染色。在CKX53顯微鏡計數(shù)侵入聚碳酸酯過濾器下表面的細(xì)胞。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組重復(fù)6次。

2.6 細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA水平的檢測

使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并通過PrimeScript qRT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq在ABI 7300 Real Time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實時PCR分析。PCR系統(tǒng)在推薦的熱循環(huán)設(shè)置下：在95 ℃進(jìn)行1個初始循環(huán)30 s，然后在95 ℃進(jìn)行5 s和60 ℃進(jìn)行31 s的40個循環(huán)。NF-κB、c-myc引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：NF-κB正向，5′-GTCAAC GGATTTGGTCTGTATT-3′和NF-κB反向，5′-AGTCTTCTGGGT GGCAGTGAT-3′；c-myc正向，5′-GTCAACGGATTTGGTCTG TATT-3′和c-myc反向，5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；U6正向5′-ATGCGAGTTGTTCTCCGTCT-3′和U6反向5′-TATCTGCGGTTTCCTCAAGC-3′。U6用作mRNA測定的內(nèi)源對照，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。

2.7 細(xì)胞NF-κB、c-myc蛋白水平的檢測

使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取A549細(xì)胞的總蛋白。使用Bradford試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE電泳分離的總蛋白(40 μg)，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后將膜在室溫下于5%脫脂奶粉中封閉1 h，并在4 ℃下與抗NF-κB抗體(1∶1 000稀釋)、抗c-myc抗體(1∶1 000稀釋)及抗GAPDH抗體(1∶2 000稀釋)孵育過夜，加入HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，將膜在37 ℃下孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒可視化蛋白質(zhì)，并使用PDQuest軟件分析蛋白質(zhì)表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組A549細(xì)胞炎癥因子IL-2、IL-6及TNF-α蛋白水平比較

與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞IL-2、IL-6及TNF-α蛋白水平明顯降低；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞IL-2、IL-6及TNF-α蛋白水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組A549細(xì)胞炎癥因子IL-2、IL-6及TNF-α蛋白 水平比較Tab 1 Comparison of protein levels of inflammatory factors IL-2, IL-6 and TNF-α in A549 cells among four

3.2 各組A549細(xì)胞OD、存活率比較

與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞OD、存活率明顯降低；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞OD、存活率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組A549細(xì)胞OD、存活率比較Tab 2 Comparison of OD and survival rate of A549 cells among four groups

3.3 各組A549細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較

與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 各組A549細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較Tab 3 Comparison of clone forming number of A549 cells

A.A549細(xì)胞組；B.5-氟尿嘧啶組；C.右美托咪定組；D.聯(lián)合組A. A549 cell group; B. 5-fluorouracil group; C. dexmedetomidine group; D. combination group圖1 各組A549細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色，×200)Fig 1 Comparison of number of A549 cell clones among four groups (crystal violet staining, ×200)

3.4 各組A549細(xì)胞凋亡率比較

與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯升高；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 各組A549細(xì)胞凋亡率比較Tab 4 Comparison of A549 cell apoptosis rate among

A.A549細(xì)胞組；B.5-氟尿嘧啶組；C.右美托咪定組；D.聯(lián)合組A. A549 cell group; B. 5-fluorouracil group; C. dexmedetomidine group; D. combination group圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組A549細(xì)胞的凋亡率Fig 2 Apoptosis rate of A549 cells detected by Flow cytometry among four groups

3.5 各組A549細(xì)胞侵襲遷移能力比較

與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯減少；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5、圖3。

表5 各組A549細(xì)胞侵襲遷移能力比較Tab 5 Comparison of invasion and migration ability of A549 cells among four groups

A.A549細(xì)胞組；B.5-氟尿嘧啶組；C.右美托咪定組；D.聯(lián)合組A. A549 cell group; B. 5-fluorouracil group; C. dexmedetomidine group; D. combination group圖3 各組A549細(xì)胞穿膜數(shù)比較(結(jié)晶紫染色，×200)Fig 3 Comparison of number of A549 cells across the membrane among four groups (crystal violet staining, ×200)

3.6 各組A549細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)水平比較

與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)水平明顯降低；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 各組A549細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA表達(dá)水平比較Tab 6 Comparison of expression level of NF-κB and c-myc mRNA in A549 cells among four groups

3.7 各組A549細(xì)胞NF-κB、c-myc蛋白表達(dá)水平比較

與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB、c-myc蛋白表達(dá)水平明顯降低；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表7、圖4。

表7 各組A549細(xì)胞NF-κB、c-myc蛋白表達(dá)水平比較Tab 7 Comparison of expression level of NF-κB and c-myc protein in A549 cells among four groups

A.A549細(xì)胞組；B.5-氟尿嘧啶組；C.右美托咪定組；D.聯(lián)合組A. A549 cell group; B. 5-fluorouracil group; C. dexmedetomidine group; D. combination group圖4 各組A549細(xì)胞NF-κB、c-myc蛋白表達(dá)水平比較Fig 4 Comparison of expression level of NF-κB and c-myc protein expression levels in A549 cells among four groups

4 討論

5-氟尿嘧啶是肺癌化療的一線藥物?；瘜W(xué)抗性是成功進(jìn)行5-氟尿嘧啶化療的主要障礙。聯(lián)合療法的使用是目前評估克服化學(xué)耐藥性的主要策略之一。右美托咪定在體外能抑制某些實體瘤細(xì)胞系的增殖，并能抑制正常的造血前體[10]。右美托咪定對正常人的肺細(xì)胞無毒，因此可以改善治療指數(shù)。右美托咪定在體外也能抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。本研究測試了右美托咪定對5-氟尿嘧啶的增敏作用。結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞OD、存活率、細(xì)胞克隆形成數(shù)目及穿膜數(shù)明顯降低，凋亡率明顯升高；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞OD、存活率、細(xì)胞克隆形成數(shù)目及穿膜數(shù)明顯降低；此外，右美托咪定能提高5-氟尿嘧啶對A549細(xì)胞的凋亡水平。這些研究結(jié)果與前述討論一致。說明右美托咪定能抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡，增加5-氟尿嘧啶對肺癌A549細(xì)胞的化療作用。

c-myc主要位于細(xì)胞質(zhì)中，可以直接結(jié)合并激活Notch1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致Notch信號傳導(dǎo)激活。有研究報道，

c-myc可以在體內(nèi)和體外直接與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合，從而上調(diào)TRAF6蛋白的表達(dá)，縮短其半衰期，從而促進(jìn)NF-κB的活化[12]。還發(fā)現(xiàn)c-myc通過促進(jìn)NF-κB活化在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲中起重要作用。已發(fā)現(xiàn)c-myc通過與TRAF6和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)激活的激酶1結(jié)合蛋白2相互作用來促進(jìn)NF-κB的激活[13]。NF-κB的異常激活在許多病理情況下發(fā)生，例如變態(tài)反應(yīng)、自發(fā)炎癥疾病和惡性腫瘤。抑制NF-κB活化可抑制惡性腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。TRAF6作為信號傳導(dǎo)介質(zhì)，在TNF受體超家族和白細(xì)胞介素1受體/Toll樣受體超家族以及多泛素化TGFβ相關(guān)激酶1、NF-κB激活中起關(guān)鍵作用，c-myc是TRAF6的誘導(dǎo)表達(dá)因子。c-myc可能與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組和聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低；與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。這與上述討論一致，同時說明右美托咪定能增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對A549細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用。研究結(jié)果已證明，c-myc在高等級的人類肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平較高，且c-myc通過促進(jìn)TRAF6誘導(dǎo)的NF-κB活化來負(fù)調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[14]。c-myc可以通過促進(jìn)NF-κB活性來誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，并且可以與TRAF6相互作用，促進(jìn)TRAF6的體內(nèi)過表達(dá)，從而激活NF-κB信號通路。相反，NF-κB的抑制可以顯著改善腫瘤的發(fā)生、遷移和侵襲[15]。這與本研究結(jié)果一致。IL-2、IL-6和TNF-α是NF-κB、c-myc調(diào)控下的炎癥因子。本研究結(jié)果表明，與5-氟尿嘧啶組、右美托咪定組比較，聯(lián)合組細(xì)胞IL-2、IL-6及TNF-α蛋白水平明顯降低，與上述討論一致。

綜上所述，右美托咪定能抑制肺癌A549細(xì)胞炎癥、增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對肺癌A549細(xì)胞的化療作用；其機(jī)制與右美托咪定能增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對A549細(xì)胞NF-κB、c-myc mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用有關(guān)。