基于培養(yǎng)池陣列微流控芯片的單線蟲(chóng)并行分離條件考察

鐘潤(rùn)濤，楊倩倩，劉 琦，張 普，劉清清，邱怡華，彭 威，李沛然，王夢(mèng)雨，王 巍，孫野青

(大連海事大學(xué) 環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所，遼寧大連 116026)

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans),是重要的模式生物,是一種微小的多細(xì)胞無(wú)脊椎[1]、無(wú)毒無(wú)害、可以獨(dú)立生存的小型土壤動(dòng)物，其主要特點(diǎn)包括：易于培養(yǎng)[2]、雌雄同體、較快的繁殖時(shí)間(約3d，20℃)和較短的壽命(約兩周，20℃)[3]、較小的身體尺寸(成蟲(chóng)體長(zhǎng)約1mm長(zhǎng)，體寬約50μm)[1]、通身透明，神經(jīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單、基因組測(cè)序已完成[4]、遺傳背景清楚等。

常規(guī)線蟲(chóng)研究方法，往往需要每天將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，以和后代區(qū)分[5-6]，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、通量低，同時(shí)難以對(duì)單個(gè)線蟲(chóng)實(shí)現(xiàn)精確的刺激傳遞、操控和追蹤，無(wú)法獲得單線蟲(chóng)的分析檢測(cè)數(shù)據(jù)，在一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性和研究深度。單線蟲(chóng)水平的研究充分考慮了線蟲(chóng)的個(gè)體差異，可以獲得更豐富、更準(zhǔn)確的信息，從而避免群體研究時(shí)平均值所帶來(lái)的偏差。單線蟲(chóng)的分離和操控對(duì)于單線蟲(chóng)的研究有很重要的意義，但傳統(tǒng)研究手段難以實(shí)現(xiàn)對(duì)一定數(shù)量單線蟲(chóng)的精確控制，且現(xiàn)有方法可能會(huì)對(duì)線蟲(chóng)生理產(chǎn)生影響[7]。

微流控芯片，又叫芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-Chip)，是一種以在微米尺度空間對(duì)流體操控為主要特征的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能[1]。微流控技術(shù)的特點(diǎn)使其在生物醫(yī)學(xué)研究方面實(shí)現(xiàn)了微型化、自動(dòng)化、高時(shí)效性、高通量及大規(guī)模檢測(cè)等諸多優(yōu)勢(shì)[5]。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，微流控芯片系統(tǒng)已成為模式生物線蟲(chóng)，特別是秀麗隱桿線蟲(chóng)這種微小生命體研究的強(qiáng)大工具[8-10]。

本研究基于微流體控制技術(shù)，設(shè)計(jì)了培養(yǎng)池陣列微流控芯片，同時(shí)提出一種單線蟲(chóng)并行分離的方法，通過(guò)考察液體培養(yǎng)時(shí)的線蟲(chóng)密度、線蟲(chóng)體寬及其分布等影響因素，分析在芯片上進(jìn)行線蟲(chóng)進(jìn)樣和單線蟲(chóng)并行分離的條件。通過(guò)改變無(wú)菌液體培養(yǎng)時(shí)的線蟲(chóng)密度，得到不同尺寸的線蟲(chóng)樣品，比較其對(duì)芯片線蟲(chóng)分離的效果，進(jìn)一步驗(yàn)證線蟲(chóng)樣品的尺寸對(duì)單線蟲(chóng)并行分離的影響。本試驗(yàn)結(jié)果將為后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化單線蟲(chóng)分離條件提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為構(gòu)建自動(dòng)化單線蟲(chóng)并行培養(yǎng)和長(zhǎng)期觀測(cè)微流控分析系統(tǒng)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀麗隱桿線蟲(chóng)株系為野生型線蟲(chóng)(N2)，購(gòu)于美國(guó)NIH Nation Center for Research Resources(NCRR)資助的線蟲(chóng)保種中心(CGC, Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN)。

線蟲(chóng)液體培養(yǎng)基CeMM(C.elegansMaintenance Medium)按文獻(xiàn)中的方法配制而成[11]，主要包括水溶性部分、TEA可溶性部分、氨基酸、核酸取代物(Thymine等)、其他生長(zhǎng)因子及能量(D-glucose)。

1.2 線蟲(chóng)培養(yǎng)與同步化

用蒸餾水將配好的培養(yǎng)基調(diào)整至合適的最終體積，并充分混合，使用0.2 μm醋酸纖維素過(guò)濾器過(guò)濾。

線蟲(chóng)擴(kuò)繁：取1 mL在CeMM中培養(yǎng)的線蟲(chóng)溶液，加入10 mL 的CeMM液體培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行線蟲(chóng)同步化。

線蟲(chóng)同步化：取3.5 mL線蟲(chóng)溶液，加入0.5 mL NaOH和NaClO裂解液，處理約5.5 min，期間注意觀察溶液的狀態(tài)，至線蟲(chóng)溶液變微黃，且肉眼看不到明顯的線蟲(chóng)殘片。同步化后，用移液槍取部分線蟲(chóng)卵溶液至載玻片上，在顯微鏡下觀察同步化后的線蟲(chóng)卵是否完整。

1.3 微流控芯片的設(shè)計(jì)與加工

1.3.1 微流控芯片結(jié)構(gòu) 用于線蟲(chóng)分析的培養(yǎng)池陣列微流控芯片結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，從左至右依次包括并行排列的3個(gè)進(jìn)樣通道和入口、進(jìn)樣儲(chǔ)液池、若干條線蟲(chóng)分析通道組成的陣列(本試驗(yàn)采用含8條線蟲(chóng)分析通道的結(jié)構(gòu))以及出口處的儲(chǔ)液池和出口。多條線蟲(chóng)分析通道并行排布，分析通道的兩端分別與進(jìn)樣儲(chǔ)液池和出口儲(chǔ)液池相連，各分析通道之間互不干擾，可在壓力作用下進(jìn)行多條單線蟲(chóng)的并行控制；每條線蟲(chóng)分析通道由進(jìn)樣端的錐形線蟲(chóng)捕獲結(jié)構(gòu)、橢圓形的培養(yǎng)池以及出口端的細(xì)通道連接結(jié)構(gòu)組成，具體尺寸見(jiàn)圖1。培養(yǎng)池兩端的線蟲(chóng)捕獲結(jié)構(gòu)和細(xì)通道連接結(jié)構(gòu)的最小寬度由線蟲(chóng)樣品的尺寸決定，可滿足早期成蟲(chóng)樣品(體寬大于35 μm)的控制要求，實(shí)現(xiàn)線蟲(chóng)分離及單線蟲(chóng)控制，從而可進(jìn)行線蟲(chóng)樣品的長(zhǎng)期培養(yǎng)及觀測(cè)分析。微流控芯片通道深度約50 μm，可用于線蟲(chóng)控制；培養(yǎng)池深度約250 μm，可用于線蟲(chóng)長(zhǎng)期培養(yǎng)及正?；顒?dòng)，也可滿足線蟲(chóng)樣品視頻監(jiān)測(cè)的需求。

圖1 培養(yǎng)池陣列微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of microfluidic chip with an array of culture chambers

1.3.2 微流控芯片加工 所用的微流控芯片采用軟光刻法制備[12-15]，芯片模板為UV光刻法加工的SU-8陽(yáng)模。PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片采用澆注法制作，單體和固化劑的比例為10∶1，經(jīng)混勻、脫氣、固化(60 ℃×3 h)、脫模和切割、打孔后，將PDMS芯片和預(yù)先切割的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)空白底板封接[16]。試驗(yàn)前，先用10% 的F-127溶液潤(rùn)濕整個(gè)PDMS/PMMA芯片的通道及培養(yǎng)池，靜置5～10 min后用無(wú)菌水將芯片通道清洗干凈，55 ℃烘干，再放置于真空干燥器中抽真空1 h。使用時(shí)，將芯片從真空干燥器中取出，吸取適量CeMM培養(yǎng)液浸潤(rùn)整個(gè)芯片通道，無(wú)明顯氣泡即可。

1.4 微流控芯片線蟲(chóng)分離試驗(yàn)方法

使用3個(gè)注射泵(TJ-2A/ L0107-2A，保定蘭格恒流泵有限公司)和聚四氟乙烯(PTFE)塑料管，進(jìn)行微流控芯片上的流體控制(圖2)，可準(zhǔn)確設(shè)定流速和體積等參數(shù)。

線蟲(chóng)經(jīng)同步化處理后，在CeMM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～7 d，在顯微鏡下觀察并測(cè)量部分線蟲(chóng)的體寬。當(dāng)測(cè)量的線蟲(chóng)樣品大部分(>70%)體寬超過(guò)35 μm時(shí)，取線蟲(chóng)懸浮液，清洗掉雜質(zhì)后，調(diào)整線蟲(chóng)密度約為2000～3 000條/mL，備用。

用含有CeMM培養(yǎng)液的注射器-2和PTFE管抽取10 μL線蟲(chóng)溶液(約含有線蟲(chóng)20～30條)，并將該P(yáng)TFE管插入微流控芯片的入口-2，同時(shí)將注射器-1和注射器-3分別接至入口-1和入口-3，隨后按如下流程進(jìn)行線蟲(chóng)分離試驗(yàn)：

線蟲(chóng)加樣與捕獲：關(guān)閉注射泵-1和注射泵-3，開(kāi)啟注射泵-2，并以150 μL/h的流速推動(dòng)線蟲(chóng)樣品進(jìn)入進(jìn)樣儲(chǔ)液池，約3～5 min后，部分線蟲(chóng)被捕獲至錐形結(jié)構(gòu)的細(xì)通道處。

清除多余線蟲(chóng)：斷開(kāi)注射泵- 2與入口-2的連接管，同時(shí)開(kāi)啟注射泵-1和注射泵-3(流速均為300 μL/h)3～5 min，將進(jìn)樣儲(chǔ)液池中多余的線蟲(chóng)從入口-2處清除，并將注射泵-2連接管內(nèi)可能殘留的線蟲(chóng)排除。

線蟲(chóng)進(jìn)樣與分離：將注射泵-1和注射泵-3的流速調(diào)為50 μL/h，同時(shí)將注射泵-2與入口-2連接并開(kāi)啟注射泵-2，采用快推模式將捕獲結(jié)構(gòu)處的線蟲(chóng)迅速?zèng)_入培養(yǎng)池中，實(shí)現(xiàn)線蟲(chóng)的分離。

每一步操作結(jié)束后，在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。試驗(yàn)完成后，將微流控芯片中的液體抽吸干凈，隨后用無(wú)水乙醇和無(wú)菌水清洗通道，放入55 ℃烘箱烘干，備用。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05代表有顯著性差異，P<0.01代表有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

前期研究初步考察了基于微流控芯片的線蟲(chóng)進(jìn)樣和分離的基本條件，包括各個(gè)步驟的流速、時(shí)間和注射泵的狀態(tài)等(詳見(jiàn)試驗(yàn)方法部分)，發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)樣品的體寬及其分布對(duì)微流控芯片上線蟲(chóng)的分離效果有顯著影響[14, 17-19]。本試驗(yàn)主要從影響線蟲(chóng)體寬及其分布的無(wú)菌液體培養(yǎng)條件，即液體培養(yǎng)時(shí)的線蟲(chóng)密度方面，來(lái)考察其對(duì)線蟲(chóng)尺寸和芯片上線蟲(chóng)分離效果的影響。

2.1 不同密度下培養(yǎng)對(duì)線蟲(chóng)體寬的影響

在CeMM液體培養(yǎng)基中馴化的線蟲(chóng)樣品，經(jīng)同步化處理后，分別采用較高密度(約700 條/mL)和較低密度(約300條/mL)進(jìn)行無(wú)菌液體培養(yǎng)，并定期觀測(cè)其尺寸變化。培養(yǎng)6～7 d后，統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)平均體寬，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在較高密度下進(jìn)行線蟲(chóng)無(wú)菌液體培養(yǎng)時(shí)，得到的線蟲(chóng)樣品體寬偏小，且尺寸分布較分散(35.5 μm±5.2 μm)。當(dāng)降低線蟲(chóng)培養(yǎng)的密度時(shí)，得到的線蟲(chóng)樣品體寬較大，尺寸分布較均勻 (40.0 μm±1.8 μm)，與高密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)尺寸之間存在顯著性差異，表明密度對(duì)線蟲(chóng)的體寬有明顯影響。

2.2 不同密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)對(duì)芯片上線蟲(chóng)分離的影響

分別采用高密度和低密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)樣品，將其稀釋至合適的密度后，每次取20～30條線蟲(chóng)進(jìn)行芯片上的分離試驗(yàn)，每種樣品重復(fù)3次。試驗(yàn)過(guò)程中，分別記錄加樣與捕獲階段和清除多余線蟲(chóng)階段每個(gè)捕獲通道處的線蟲(chóng)數(shù)，以及進(jìn)樣與分離階段每個(gè)培養(yǎng)池中的線蟲(chóng)數(shù)，并采集相應(yīng)圖像(圖4)。

圖3 不同培養(yǎng)密度下線蟲(chóng)體寬分布結(jié)果Fig.3 Distribution of nematode body width under different culturing densities

圖5為高密度與低密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)樣品在芯片上分離的結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)可知，采用兩種不同的樣品時(shí)，在加樣與捕獲階段，含有線蟲(chóng)的捕獲通道的數(shù)量分別為6.3±0.6和8±0，且兩種樣品間存在顯著性差異；在清除多余線蟲(chóng)階段，含有線蟲(chóng)的捕獲通道的數(shù)量分別為5±1和7.3±1.2，統(tǒng)計(jì)分析顯示兩種樣品間不存在顯著性差異；在進(jìn)樣與分離階段，含有線蟲(chóng)的培養(yǎng)池的數(shù)量分別為4.3±0.6和6.7±0.6，且兩種樣品間存在極顯著性差異，表明線蟲(chóng)體寬及其分布對(duì)芯片上的線蟲(chóng)分離有明顯影響，具體分析如下。

A.較高密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)樣品;B.較低密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)樣品

圖5 不同密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)進(jìn)行芯片上分離的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.5 Experimental results for microfluidic chip-based isolation of C.elegans cultured with different densities

2.2.1 高密度 在高密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)樣品在加樣與捕獲階段，有1～2個(gè)捕獲通道處不含線蟲(chóng)，且不含線蟲(chóng)的捕獲通道在芯片上的位置呈隨機(jī)分布，其余捕獲通道均含有單條線蟲(chóng)；在清除多余線蟲(chóng)階段，有2～4個(gè)捕獲通道處不含線蟲(chóng)，且上一階段捕獲的線蟲(chóng)易發(fā)生丟失；在進(jìn)樣與分離階段，有3～4個(gè)培養(yǎng)池中不含線蟲(chóng)，部分線蟲(chóng)進(jìn)一步丟失。

在加樣與捕獲階段，線蟲(chóng)樣品溶液以較低流速(150 μL/h)進(jìn)入芯片進(jìn)樣儲(chǔ)液池中，因線蟲(chóng)體寬差別較大，線蟲(chóng)隨液流分布在芯片的不同位置，部分較小的線蟲(chóng)先進(jìn)入捕獲通道，隨后直接進(jìn)入培養(yǎng)池；較大的線蟲(chóng)被捕獲到錐形結(jié)構(gòu)的細(xì)通道處，導(dǎo)致該通道的流動(dòng)阻力增大，從而影響后續(xù)線蟲(chóng)進(jìn)入。線蟲(chóng)捕獲過(guò)程結(jié)束后，改變3個(gè)注射泵的狀態(tài)，同時(shí)以較大流速(300 μL/h)將進(jìn)樣儲(chǔ)液池中剩余的線蟲(chóng)全部清除，此時(shí)，少數(shù)被捕獲的線蟲(chóng)因體型較小而被流體帶入進(jìn)樣儲(chǔ)液池，最后被一起清除。當(dāng)進(jìn)樣儲(chǔ)液池中無(wú)殘留線蟲(chóng)后，再次改變注射泵的狀態(tài)，采用注射泵快推模式 (～1 s)，將通道中捕獲的線蟲(chóng)迅速?zèng)_入培養(yǎng)池，減少因線蟲(chóng)尺寸不一致而導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)不同步情況，尺寸較小的線蟲(chóng)則可被沖出培養(yǎng)池，進(jìn)入出口端的儲(chǔ)液池。

以上結(jié)果初步驗(yàn)證了采用含有培養(yǎng)池陣列的微流控芯片進(jìn)行單線蟲(chóng)并行分離的可行性(含有單線蟲(chóng)的培養(yǎng)池?cái)?shù)量占所有培養(yǎng)池的比例約 54.2%)，同時(shí)也表明，線蟲(chóng)并行分離過(guò)程受線蟲(chóng)體寬及其分布的影響較大，需進(jìn)一步驗(yàn)證和考察。

2.2.2 低密度 在低密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)樣品在加樣與捕獲階段，所有捕獲通道處均含有線蟲(chóng)，其中1～2個(gè)通道含有兩條線蟲(chóng)，且通道位置呈隨機(jī)分布，其他通道均含有單條線蟲(chóng)；在清除多余線蟲(chóng)階段，僅有個(gè)別位置發(fā)生線蟲(chóng)丟失現(xiàn)象，大部分線蟲(chóng)仍保持被捕獲狀態(tài)；在進(jìn)樣與分離階段，出現(xiàn)少數(shù)線蟲(chóng)丟失情況。在各步試驗(yàn)操作過(guò)程中，因線蟲(chóng)體寬分布較均勻，明顯改善了線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)的同步性，從而提高芯片上線蟲(chóng)并行分離的效果(含有線蟲(chóng)和單線蟲(chóng)的培養(yǎng)池?cái)?shù)量占所有培養(yǎng)池的比例分別為 83.3%和66.7%)。同時(shí)，因線蟲(chóng)體寬較大，易被捕獲且不易被沖出培養(yǎng)池，當(dāng)個(gè)別通道進(jìn)入兩條線蟲(chóng)時(shí)，這兩條線蟲(chóng)均可進(jìn)入培養(yǎng)池并被保留，導(dǎo)致部分培養(yǎng)池最終含有兩條線蟲(chóng)(圖6)。進(jìn)一步改進(jìn)線蟲(chóng)加樣與捕獲條件(線蟲(chóng)尺寸、數(shù)量，注射泵開(kāi)關(guān)狀態(tài)、流速、時(shí)間等)，有望降低同一通道捕獲兩條線蟲(chóng)的比例。為進(jìn)一步減少被捕獲線蟲(chóng)的丟失，可詳細(xì)考察影響線蟲(chóng)清除和進(jìn)樣的因素，并優(yōu)化試驗(yàn)條件。

3 討論與展望

已有的線蟲(chóng)在植物和農(nóng)業(yè)方面的研究，如線蟲(chóng)對(duì)植物生長(zhǎng)的影響[20]、園藝線蟲(chóng)防治[21]等，多數(shù)是基于線蟲(chóng)群體水平的研究，而常規(guī)方法較難實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)遺傳發(fā)育的縱向研究，在一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性和研究深度。單線蟲(chóng)水平的研究充分考慮了線蟲(chóng)的個(gè)體差異，可以獲得更豐富、更準(zhǔn)確的信息，從而避免群體研究時(shí)平均值所帶來(lái)的偏差。單線蟲(chóng)的分離和操控對(duì)于單線蟲(chóng)的研究有很重要的意義。Hulme等[14]設(shè)計(jì)一種研究線蟲(chóng)壽命的多通道微流控芯片，成功實(shí)現(xiàn)線蟲(chóng)個(gè)體發(fā)育連續(xù)觀察20 d。但該方法需要手動(dòng)加樣、每次加入單條線蟲(chóng)，芯片結(jié)構(gòu)和操作過(guò)程復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)自動(dòng)化并行控制。Kopito等[18]利用微流控芯片記錄單線蟲(chóng)的產(chǎn)卵數(shù)等指標(biāo)，但過(guò)程中線蟲(chóng)活動(dòng)受到限制，無(wú)法長(zhǎng)期正常生長(zhǎng)。Gokce等[22]設(shè)計(jì)的芯片可以實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)的固定并進(jìn)行顯微操作，但線蟲(chóng)釋放后會(huì)造成混合培養(yǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)的精確追蹤。Mondal等[19]設(shè)計(jì)的芯片可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單線蟲(chóng)分離和高分辨率成像，但難以實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)長(zhǎng)期培養(yǎng)和觀測(cè)。Atakan等[23]設(shè)計(jì)的微流控芯片可以實(shí)現(xiàn)8種不同種類單線蟲(chóng)分離，但難以實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)長(zhǎng)期追蹤，同時(shí)線蟲(chóng)進(jìn)樣、分離、培養(yǎng)過(guò)程需要人為控制和操作。綜上所述，雖然基于微流控技術(shù)的單線蟲(chóng)分析已有相關(guān)報(bào)道，但現(xiàn)有芯片結(jié)構(gòu)大多不含有單線蟲(chóng)培養(yǎng)池，難以實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)和追蹤，且操作繁瑣、不確定性高、自動(dòng)化程度低，降低了研究結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確度，極大限制了單線蟲(chóng)研究的廣度和深度。

圖6 較低密度下培養(yǎng)的線蟲(chóng)進(jìn)行芯片分離的結(jié)果Fig.6 Experimental results for microfluidic chip-based isolation of C.elegans cultured with low density

為解決上述問(wèn)題，本研究設(shè)計(jì)培養(yǎng)池陣列微流控芯片，其中包含8個(gè)并行排列的線蟲(chóng)分析通道，同時(shí)提出單線蟲(chóng)并行分離的方法，并考察線蟲(chóng)體寬及其分布對(duì)芯片上單線蟲(chóng)并行分離的影響。通過(guò)改變無(wú)菌液體培養(yǎng)時(shí)的線蟲(chóng)密度，發(fā)現(xiàn)低密度下(約300條/mL)得到的線蟲(chóng)樣品，其體寬較大且分布均勻性較好(40.0 μm±1.8 μm)，這可能是因?yàn)榫€蟲(chóng)生存環(huán)境的優(yōu)化，改善線蟲(chóng)生長(zhǎng)的一致性；同時(shí)，該線蟲(chóng)樣品在芯片上各步操作過(guò)程中運(yùn)動(dòng)的同步性明顯改善，提高芯片上線蟲(chóng)捕獲和并行分離的效果(含有線蟲(chóng)和單線蟲(chóng)的培養(yǎng)池所占比例分別為83.3%和66.7%)。

本試驗(yàn)為解決單線蟲(chóng)的并行分離和控制等問(wèn)題提供一種可行的方案。進(jìn)入培養(yǎng)池中的單線蟲(chóng)可通過(guò)定期更換培養(yǎng)液而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)和觀測(cè)，以獲取不同線蟲(chóng)生長(zhǎng)周期更豐富、更完整的單線蟲(chóng)研究結(jié)果。單線蟲(chóng)并行分離和控制方法，可同時(shí)獲得更多單線蟲(chóng)的信息，使單線蟲(chóng)研究結(jié)果具有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義。

本試驗(yàn)提出的單線蟲(chóng)分析通道陣列可擴(kuò)展至更大數(shù)量，并可通過(guò)對(duì)流體的程序控制實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，將為基于微流控芯片的單線蟲(chóng)長(zhǎng)期培養(yǎng)、精準(zhǔn)刺激、可逆捕獲及熒光成像觀測(cè)等提供便利，同時(shí)可為微生物源和植物源農(nóng)藥篩選及植物線蟲(chóng)防治等工作提供技術(shù)支持[24]。