EGFR 在肺泡上皮不典型腺瘤樣增生中表達(dá)和突變的意義研究

（岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，湖南 岳陽(yáng) 414000）

據(jù)報(bào)道，肺癌的發(fā)病率位居中國(guó)前10 位惡性腫瘤之首。盡管肺癌的治療已發(fā)展到手術(shù)、放療、化療以及分子靶向藥物等綜合治療階段，但預(yù)后仍然很差，患者的長(zhǎng)期生存仍未得到明顯改善，其主要原因與肺癌的早期診斷較為困難，確診時(shí)往往已進(jìn)入中晚期有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在肺癌中高表達(dá)并存在基因突變[1]，在肺泡上皮不典型腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）也存在類似表現(xiàn)，而AAH 是肺癌特別是肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LAC）及其亞型細(xì)支氣管肺泡癌（Bronchioloalveolar carcinoma，BAC）的癌前病變甚至早期癌[2-5]。本研究旨在探討可否通過(guò)檢測(cè)AAH 中EGFR 的過(guò)表達(dá)和（或）其基因突變從而實(shí)現(xiàn)肺癌的早期診斷。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院2006 年1 月-2010年6 月間經(jīng)病理確診為AAH 的病例，其中包括23 例單純AAH 病變病例和18 例癌旁肺泡上皮不典型增生病例。組織學(xué)上表現(xiàn)為低度AAH 的病例24 例，表現(xiàn)為高度AAH 的病例17 例。41 例病例中，男性21 例，女性20 例，男女比例為1.05∶1；患者年齡31-73 歲，中位年齡59 歲。在復(fù)習(xí)全部HE 切片并經(jīng)2 名副教授以上的病理科醫(yī)生確定診斷后，確定典型石蠟包埋組織塊。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化

采用免疫組織化學(xué)技術(shù)S-P 法（鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶連結(jié)法），進(jìn)行EDTA 抗原熱修復(fù)和AEC 對(duì)比染色。

1.2.2 結(jié)果判斷和分析

EGFR、EGFR（E746-A750del Specific）、EGFR（L858R Mutant Spectific）的免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性均呈淺棕色或棕紅色，表達(dá)在細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：不顯色或顯色弱陽(yáng)性且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為0 分；顯色弱陽(yáng)性且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞10%記1+；中度陽(yáng)性記2+；強(qiáng)陽(yáng)性記3+。本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)1+、2+、3+即為EGFR、EGFR（E746-A750del Specific）、EGFR（L858R Mutant Spectific）染色陽(yáng)性，0 分為陰性。以美國(guó)Cell Signaling（CST）公司提供的陽(yáng)性對(duì)照片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS 溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。

采用SPSS18 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。做相關(guān)性分析，r 值范圍－1～＋1，r=0 表示零相關(guān)，r ＜0 為負(fù)相關(guān)，越接近－1 負(fù)相關(guān)程度越高；r ＞0 為正相關(guān)，越接近＋1 正相關(guān)程度越高。（0＜|r|＜0.19 極低相關(guān)；0.20 ＜|r|＜0.39 低度相關(guān)；0.40 ＜|r|＜0.69 中度相關(guān)；0.70 ＜|r|＜0.89高度相關(guān)；0.90 ＜|r|＜0.10 極高相關(guān)）

2 結(jié)果

2.1 EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)及其第19、21 號(hào)外顯子突變與不同程度AAH 的關(guān)系

2.1.1 EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

41 例病例中17 例高度AAH 的病例EGFR 蛋白全部表達(dá)為陽(yáng)性，24 例低度AAH 病例中的只有17 例EGFR 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05，表1）。

表1 EGFR 蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

2.1.2 第19 號(hào)外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

17 例高度AAH 病例中有13 例出現(xiàn)第19號(hào)外顯子突變，表現(xiàn)為EGFR（E746-A750del Specific）突變蛋白表達(dá)陽(yáng)性，24 例低度AAH 病例中的1 例第19 號(hào)外顯子突變，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05，表2）。

表2 第19 號(hào)外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

2.1.3 第21 號(hào)外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

17 例高度AAH 病例中有7 例第21 號(hào)外顯子突變，表現(xiàn)為EGFR（L858R Mutant Spectific）突變蛋白表達(dá)陽(yáng)性，24 例低度AAH 病例中的2 例第21 號(hào)外顯子突變，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表3 第21 號(hào)外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

2.2 EGFR 基因第19、21 號(hào)外顯子突變與EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系

2.2.1 EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變與EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系

EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變的AAH 患者EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為100%，野生型的27 例AAH 患者中有20 例出現(xiàn)EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為70.4%，AAH 患者EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變與EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈低度正相關(guān)（r=0.3267，P＜0.05，表4）。

表4 EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變與EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系

2.2.2 EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變與EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系（表5）

EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變的AAH 患者EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為100%，野生型的32 例AAH 患者中25 例EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為75%，AAH 患者EGFR 第21 號(hào)外顯子突變與EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈低度正相關(guān)（r=0.2406，P＜0.05，表5）。

表5 EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變與EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系

2.3 EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)及其第19、21 號(hào)外顯子突變與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

2.3.1 EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

AAH 組織中EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為82.9%（34/41）。男性組EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為76.2%，女性組為90.0%，二組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表6）；年齡≤50 歲組、51-60 歲組、＞60 歲組EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.0%、100%、77.8%，三組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表7）。

表6 AAH 組織中EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與AAH 患者性別的關(guān)系

表7 AAH 組織中EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與AAH 患者年齡的關(guān)系

2.3.2 EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

41 例AAH 患者中，男性組EGFR 基因第19號(hào)外顯子突變率為33.3%，女性組為35.0%，二組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表8）；年齡≤50 歲組、51～60 歲組、＞60 歲組EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變率分別為20.0%、38.5%、38.9%，三組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表9）。

表8 EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變與AAH 患者性別的關(guān)系

表9 EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變與AAH 患者年齡的關(guān)系

2.3.3 EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

41 例AAH 患者中，男性組EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變率為14.3%，女性組30.0%，二組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表10）；年齡≤50 歲組、51-60 歲組、＞60 歲組EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變率分別為10.0%、30.8%、22.2%，三組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表11）。

表10 EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變與AAH 患者性別的關(guān)系

表11 EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變與AAH 患者年齡的關(guān)系

2.4 癌旁肺泡上皮不典型增生與單純AAH 病變的比較

41 例AAH 患者中癌旁肺泡上皮不典型增生組有18 例，其中男性10 例，女性8 例，男女比例為1.25:1，平均年齡60.7 歲；單純AAH 病變的有23例，男性11例，女性12例，男女比例為1:1.09，平均年齡53.7 歲。癌旁肺泡上皮不典型增生與單純AAH 病變?cè)贓GFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)上、EGFR 基因第19 號(hào)外顯子突變蛋白表達(dá)上及EGFR 基因第21 號(hào)外顯子突變蛋白表達(dá)上均有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表12）。

表12 癌旁肺泡上皮不典型增生患者與單純AAH 病變患者的比較

3 討論

EGFR是一種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用的糖蛋白，但當(dāng)它異常表達(dá)時(shí)可造成細(xì)胞的過(guò)度增殖。大量的研究證實(shí)EGFR 和多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著相當(dāng)密切的關(guān)系，尤其是非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 是肺癌的主要類型，其中LAC約占NSCLC 的1/3；而BAC 是LAC 亞型之一，約占NSCLC 的5%-25%[6]。有研究顯示，80%-90%的NSCLC 患者有EGFR 的過(guò)度表達(dá)，且突變率可高達(dá)42.6%，尤以LAC、BAC 中為高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織學(xué)類型[7]。本研究檢測(cè)了BAC 和LAC 的癌前病變（早期癌）AAH中EGFR蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，與既有的研究結(jié)果相一致；而AAH 根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和異型性大小可分為高、低兩個(gè)級(jí)別，檢測(cè)結(jié)果顯示，高度AHH 中EGFR 蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率高于低度AAH。另外，EGFR 屬于受體型酪氨酸激酶，在其酪氨酸激酶區(qū)域附近的ATP 結(jié)合區(qū)域周圍是EGFR 突變的主要集中位置，其中第19 號(hào)外顯子及第21 號(hào)外顯子的突變是兩種最主要的突變形式，占所有突變覆蓋率的90%。有文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR 基因在LAC 尤其是BAC 中有較高的突變率[8]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AAH 中EGFR第19 號(hào)外顯子及第21 號(hào)外顯子存在突變，且高度AAH 中的突變率高于低度AAH。以上結(jié)果說(shuō)明，AAH 從低度到高度的發(fā)展過(guò)程中EGFR 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)及其第19、21 號(hào)外顯子突變均呈遞增趨勢(shì)，提示EGFR 蛋白的過(guò)表達(dá)及其第19、21 號(hào)外顯子突變與AAH 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步分析AAH 中EGFR 基因第19 號(hào)和21 號(hào)外顯子突變與EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果呈正相關(guān)，提示在AAH 到BAC 的發(fā)展過(guò)程中，EGFR 基因第19、21 號(hào)外顯子突變可能導(dǎo)致EGFR 蛋白的高表達(dá)。但是，AAH 中EGFR 蛋白表達(dá)及其第19、21 號(hào)外顯子突變與患者的性別及年齡無(wú)關(guān)。

AAH 作為癌前病變，特別是高度AAH 可發(fā)展為肺癌。研究報(bào)道，EGFR 在AAH 到浸潤(rùn)性肺腺癌中均有陽(yáng)性表達(dá)并呈遞增趨勢(shì)，被認(rèn)為在AAH 和肺腺癌的發(fā)展過(guò)程中起重要作用，可能促進(jìn)AAH 發(fā)展到腺癌的過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，癌旁AAH 與單純AAH 中EGFR 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、EGFR 基因第19 號(hào)外顯子和第21 號(hào)外顯子突變率存在顯著性差異，前者明顯高于后者，表明隨著AAH 病變的進(jìn)一步發(fā)展，EGFR 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)及其第19、21 號(hào)外顯子突變也會(huì)呈遞增趨勢(shì)，與報(bào)道的結(jié)果表現(xiàn)一致。另有研究發(fā)現(xiàn)癌旁AAH患者（平均年齡為57.5 歲）男女比例無(wú)差別，而單純AAH 患者（平均年齡為44.5 歲）女性多發(fā)[9]。本研究中，癌旁AAH 患者與單純AAH 病變患者平均年齡都大于報(bào)道的研究結(jié)果，可能與所取樣本資料的差異有關(guān)；在性別比例上，癌旁AAH 患者男性略多于女性，而單純AAH 患者女性稍多于男性，但二者均相差不大。

綜上所述，檢測(cè)AAH中EGFR的過(guò)表達(dá)和（或）基因突變對(duì)BAC 和LAC 的早期診斷可能具有重要意義，為肺癌的早期診斷和治療提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步研究肺癌的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。