聯(lián)合肝臟離斷和門靜脈結扎的二步肝切除術后肝再生機制

曾陶飛， 陳光磊， 劉彩剛， 戴朝六， 徐 鋒

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 普通外科， 沈陽 110004

肝切除手術是肝臟惡性腫瘤目前最主要且行之有效的治療手段。剩余肝臟(future liver remnant，F(xiàn)LR)體積大小很大程度地影響了肝切除術后肝衰竭的發(fā)生率，是肝切除術前評估的重要指標[1]。標準化肝體積(standard liver volume，SLV)是基于體質量和體表面積計算得出。肝臟正常者FLR/SLV>25%～30%即可耐受較大范圍的肝切除術，伴有肝硬化或肝實質損傷者FLR/SLV則需>40%[2]。過去20年中，門靜脈栓塞術(portal vein embolization，PVE)和門靜脈結扎術(portal vein ligation，PVL)逐漸發(fā)展成為增加FLR的主要方法，但是通常需要等待3～6周甚至更長時間才能使FLR體積滿足手術要求。在此期間，患者常因腫瘤進展等原因而失去二次手術機會[3]。

聯(lián)合肝臟離斷和門靜脈結扎的二步肝切除術(associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS)能使正常肝臟在1～2周提升FLR體積達47%～93%，是PVL的1.5～2倍[4]，為FLR體積不足的肝癌患者帶來了希望。然而，我國是肝炎大國，80%以上肝癌患者伴有不同程度的肝硬化，肝硬化患者ALPPS術后FLR再生速度明顯減緩，使其臨床價值大打折扣[5]。目前，ALPPS術后肝再生機制尚未完全闡述清楚，探明其機制將有助于解決FLR不足及肝再生速度緩慢等臨床問題。為此，學者們進行了不懈探索，并取得了一些成果。筆者現(xiàn)就此相關研究進展做一綜述，希望能為后續(xù)研究提供參考。

1 ALPPS誘導肝臟快速再生的機制學說

1.1 血流動力學說 此學說認為，ALPPS主要通過改變門靜脈血流量、門靜脈壓力梯度以及肝動脈的血流供應誘導肝臟快速再生。研究發(fā)現(xiàn)：ALPPS一期手術(門靜脈結扎+肝臟離斷)后門靜脈總血流量沒有發(fā)生明顯改變[6-8]或略有下降[4]，但未結扎側門靜脈壓力顯著升高，門靜脈發(fā)生擴張，F(xiàn)LR單位組織內血流量增加4～6倍，流向FLR的肝營養(yǎng)因子顯著增加，促進肝臟快速再生[4，8-9]。然而，F(xiàn)LR的灌注壓并非越高越有益，當肝-門靜脈壓力梯度<15 mm Hg或門靜脈壓力<20 mm Hg時，F(xiàn)LR的體積增加和功能恢復程度最高[10]。另外，門靜脈側支形成的數(shù)量與FLR的再生速度呈顯著相關，側支形成的數(shù)目越少，F(xiàn)LR再生速度越快[8]。ALPPS完全阻斷了荷瘤肝臟與FLR之間門靜脈側支循環(huán)的形成。而在PVL和部分肝臟離斷的ALPPS中，荷瘤肝臟與FLR之間存在著大量新的門靜脈側支。因此，離斷荷瘤肝臟是ALPPS誘導FLR迅速增生肥大的關鍵所在，使得ALPPS術后FLR的再生速度與程度均顯著大于PVL[8]。

ALPPS不僅改變門靜脈血流供應，還顯著影響肝動脈血流。研究[4,10]發(fā)現(xiàn)，ALPPS一期手術后FLR的肝動脈代償性收縮，肝動脈血流量顯著下降，導致FLR發(fā)生嚴重的缺氧反應。缺氧阻斷了脯氨酸羥化酶對缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)1的降解，導致HIF-1α及HIF-2α的核質比顯著升高并激活缺氧信號通路，促進FLR增殖；相反，對ALPPS術后的小鼠肝臟持續(xù)供氧，則FLR再生速率顯著下降[6]。此外，F(xiàn)LR缺氧信號激活還有助于保持肝竇形態(tài)的完整性，重建有效的肝竇床，維持肝小葉結構，有利于維持肝細胞增殖功能[4]。因此，ALPPS引起的缺氧反應可能是維持再生肝臟功能及其迅速再生的一個必要條件[4]。

1.2 體液學說 該學說認為，體液因素在ALPPS誘導肝臟再生過程中發(fā)揮關鍵作用。Schlegel等[11]對比分析了ALPPS和PVL附加其他臟器損傷(腎臟、脾臟或肺部分消融術)后肝再生速度，發(fā)現(xiàn)四組間沒有明顯差別。而將ALPPS術后小鼠血漿注射到PVL小鼠體內，結果PVL小鼠與ALPPS小鼠的肝再生速度也無明顯差異。這說明ALPPS促進FLR快速再生可能是手術創(chuàng)傷引起的炎癥反應所致，并且這些生長因子不是肝臟所特異性產(chǎn)生的。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ALPPS術后血漿和FLR中TNFα、IL-6、HIFα、轉錄活化因子(STAT)3、肝細胞生長因子(HGF)、編碼細胞周期蛋白D1(CCND1)、中性粒細胞趨化因子-1、巨噬細胞炎性蛋白1α等細胞因子濃度均顯著升高[9,11-13]；高遷移率族蛋白B1、晚期糖基化終產(chǎn)物受體和Toll樣受體4等創(chuàng)傷相關因子的濃度也顯著升高；IL-6/TNFα/STAT3通路相關的基因表達顯著上調[11]；并且IL-6與HGF的表達呈正相關，F(xiàn)LR的體積增加與血漿HGF的濃度呈正相關，與IL-6、表皮生長因子、TNFα以及血管內皮生長因子 (vascular endothlial growth factor，VEGF)的濃度無關[12,14]；ALPPS術后Wnt2的表達與Ki-67的表達呈正相關性[15]。此外，荷瘤肝臟中HGF等促進肝細胞增殖的體液因子顯著升高，而Ki67卻沒有明顯增加，這說明荷瘤肝臟也可作為FLR的再生刺激物，通過體液途徑刺激FLR的增殖肥大[12]。這些數(shù)據(jù)表明ALPPS手術誘導產(chǎn)生的細胞生長因子和創(chuàng)傷相關因子在肝臟再生中發(fā)揮著關鍵作用。

2 ALPPS對肝組織中細胞的影響

ALPPS術后FLR基因表達譜發(fā)生了改變，表現(xiàn)為細胞周期、離子轉運、有絲分裂和細胞器分裂等相關基因表達上調，細胞黏附、免疫系統(tǒng)和細胞增殖相關基因顯著富集[16-17]。肝實質細胞、非實質細胞以及浸潤的炎性細胞包括肝星狀細胞(HSC)、Kupffer細胞、巨噬細胞和骨髓源性細胞協(xié)同參與了肝臟再生過程[9]，免疫系統(tǒng)在肝再生調節(jié)中也發(fā)揮了關鍵作用。

2.1 ALPPS促進細胞增殖 ALPPS術后FLR體積在短期內迅速增長不是被動充血或水腫所致，而是細胞增殖的結果[18]。體現(xiàn)在，F(xiàn)LR中Ki67和pH3陽性肝細胞數(shù)量顯著增加[4,6,8,11]。Ki67與pH3是公認的細胞增殖活躍的標志物，這充分說明ALPPS可促進肝細胞增殖。另外，絕大部分的細胞周期蛋白在術后早期顯著上升。CCND1是肝細胞周期的關鍵啟動子，ALPPS術后8 h達特異性峰值，細胞周期抑制蛋白p21則顯著下調[19-20]。這也說明ALPPS可使肝細胞進入細胞周期的時間顯著提前，最終使FLR在短時間內迅速再生肥大。

2.2 ALPPS影響肝實質細胞的線粒體功能 ALPPS一期術后FLR快速再生，對能量需求顯著增加，但ALPPS嚴重損傷了肝細胞能量再生過程，從而導致肝細胞能量的產(chǎn)生與消耗發(fā)生嚴重失衡，F(xiàn)LR的功能恢復明顯滯后[21]。肝衰竭是ALPPS術后患者死亡的主要原因，而線粒體功能障礙是術后肝衰竭的一個獨立危險因素，這也可能是ALPPS術后肝衰竭發(fā)病率較高的重要原因之一[22]。

小鼠模型中，雖然ALPPS術后FLR耗氧量和ATP產(chǎn)生量暫時增加，但術后48 h，還原型輔酶Ⅰ(Ⅱ)水平明顯降低，氧化磷酸化內源性底物供應受到嚴重損害，線粒體橫斷面積明顯縮小，小線粒體所占比例明顯增加，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)與核呼吸因子1 (Nuclear respiratory factors 1, NRF1)的表達水平低于PVL組，線粒體功能發(fā)生惡化[21,23]。ALPSS術后可產(chǎn)生大量的NF-κB p65、IL-6、TNFα等炎癥因子，TNFα在啟動FLR再生的同時[11,21]，也可通過NF-κB和p38 MAPK途徑抑制NRF1和PGC-1α的表達[24-25]，使線粒體功能失調、生物合成受損，最終導致ALPPS術后肝細胞功能障礙[21]。在人體中，與肝部分切除患者相比較，盡管ALPPS術后線粒體功能發(fā)生惡化，但在ALPPS一期手術后至二期手術前，線粒體功能在不斷地改善；ALPPS二期手術后肝再生相關基因(如STAT3、ALR)、能量代謝相關基因(如COX、Nampt)以及線粒體合成相關基因(如PGC-1α)表達均顯著增加，COX1、PGC-1α、Nampt、SirT1等蛋白濃度在此期間也顯著升高[23]。這說明FLR可能是通過SirT1/IL-6-PGC-1α-COX1軸發(fā)生能量代謝適應[23]。

2.3 非實質細胞的作用

2.3.1 肝星狀細胞(HSC) HSC是肝組織最主要的非實質細胞，在肝臟急性損傷后的肝再生過程中發(fā)揮著重要作用。肝部分切除術后早期HSC分泌高濃度的HGF通過p38信號途徑和細胞外信號調節(jié)激酶刺激肝干/祖細胞增殖。在肝臟再生的終末階段，HSC則通過分泌大量的TGFβ1抑制肝干/祖細胞的DNA合成從而精確調控肝臟再生過程[26]。

在體外實驗中，HSC激活缺氧信號通路后促進VEGF的產(chǎn)生及肝竇內皮細胞的體外增殖[27]。因此，ALPPS術后引起的缺氧環(huán)境可能是通過激活HSC的缺氧信號通路從而促進肝竇內皮細胞的增殖。最近的研究表明，HSC分泌的印度豪豬蛋白(Indian hedgehog，IHH)是ALPPS術后早期激活以及加速肝臟再生所必需的。通過分析ALPPS小鼠肝臟分化基因表達譜發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶8(Mapk8或JNK1)基因的mRNA表達高于對照組。ALPPS術后小鼠活化的HSC中可檢測到較高水平的非磷酸化JNK1、磷酸化JNK(活性JNK)及IHH蛋白，這種共定位也與CCND1和IHH下游轉錄因子GLI1 相關。ALPPS誘導JNK1活化后產(chǎn)生IHH并通過JNK-IHH-GLI1-CCND1途徑促進cyclin D1的基因表達。ALPPS小鼠使用JNK抑制劑后發(fā)現(xiàn)GLI1、cyclin D1和其他組織增殖標志物表達水平降低，肝臟再生顯著減慢。有趣的是，使用JNK抑制劑的ALPPS小鼠恢復IHH信號通路后，肝臟再生反應回復到之前水平，GLI1和cyclin D1的表達水平也恢復，除此之外還增加了非磷酸化JNK和磷酸化JNK在細胞核中的表達水平，這說明IHH在ALPPS誘導肝臟再生JNK水平方面存在正反饋環(huán)，Hedgehog信號途徑是ALPPS促進肝再生的關鍵介質[20,28]。

2.3.2 巨噬細胞 在肝臟固有免疫系統(tǒng)中，肝巨噬細胞(Kupffer細胞)是肝臟再生過程中研究最廣泛的細胞。在肝臟中，巨噬細胞約占非實質細胞的20%，部分肝切除術后，巨噬細胞分泌TNFα和IL-6為肝臟再生提供原始動力，啟動肝再生，是肝臟再生的有利因素[29-30]。倘若巨噬細胞減少或發(fā)生衰竭，缺乏巨噬細胞的小鼠不能產(chǎn)生類似的細胞因子反應，從而導致肝部分切除術后肝再生遲緩，巨噬細胞集落刺激因子缺乏亦不利于肝臟再生[31]。巨噬細胞在不同的炎癥信號刺激下可以分為不同的極化類型。IFNγ和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可誘導巨噬細胞向M1型活化(經(jīng)典活化途徑)，分泌TNFα、IL-6等促炎因子發(fā)揮抗炎作用；而IL-4和IL-13誘導巨噬細胞向M2型活化(選擇性活化途徑)，分泌TGFβ、VEGF等因子發(fā)揮抗炎作用，促進創(chuàng)傷修復和纖維變性[31-32]。在經(jīng)典的肝切除模型中，肝巨噬細胞通常向M2型分化，然而ALPPS一期術后，肝巨噬細胞數(shù)量顯著增加且高表達COX-2，COX-2促使巨噬細胞由M2型向M1型轉化。因此，巨噬細胞可能是ALPPS促進肝再生過程中的有利因素。

2.3.3 其他免疫細胞 目前免疫細胞及其亞群在ALPPS誘導肝臟再生過程中所扮演的角色尚不完全清楚。Anantha等[33]對比分析了ALPPS術后患者的FLR和荷瘤肝臟中免疫細胞的動態(tài)變化情況：ALPPS術后荷瘤肝臟中T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)數(shù)量有上升的趨勢，F(xiàn)LR中NK細胞有增加趨勢，但沒有達到統(tǒng)計學意義，這可能與樣本量不足有關。NK細胞也是肝臟固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，約占人類肝淋巴細胞的30%～50%[34]。與巨噬細胞相反，肝臟NK細胞不利于肝再生。部分肝切除術后肝臟NK細胞增多，激活的NK細胞分泌IFNγ，在肝細胞分泌的信號轉導和STAT1、干擾素調節(jié)因子1和細胞周期調節(jié)基因(p21cipl/waf1)蛋白等抗增殖蛋白的介導下，抑制肝臟再生。而當NK細胞減少或發(fā)生衰竭時小鼠肝臟再生增強[35]。最新研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞的共抑制受體TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory domains，帶有Ig和ITIM的細胞免疫受體)也參與了肝臟再生，TIGIT與其配體PVR(poliovirus receptor,即CD155)結合后介導共抑制信號，抑制NK細胞活化。肝部分切除術后，肝臟NK細胞選擇性上調TIGIT表達，最終通過TIGIT-PVR相互作用抑制NK細胞活化，最終促進肝臟再生[35]。目前有關ALPPS誘導術后肝臟再生過程中NK細胞的作用研究尚無相關研究報道，但鑒于ALPPS手術包括部分肝臟切除，因此NK細胞也有可能參與調節(jié)ALPPS術后肝臟再生過程。另外，ALPPS與PVL等不同術式引起的免疫細胞變化差異目前也尚不清楚，有待更進一步的研究。

2.3.4 其他非實質細胞 肝臟其他的非實質細胞包括肝竇內皮細胞、肝干/祖細胞等均參與肝臟再生過程。在人類肝臟中，大多數(shù)肝祖細胞產(chǎn)生于門靜脈周圍。肝祖細胞在正常肝臟中處于靜止狀態(tài)，只有在嚴重肝損傷時才開始增殖[36]。研究[37]發(fā)現(xiàn)，肝祖細胞參與ALPPS促進肝臟再生過程：1例轉移性肝腫瘤患者行ALPPS一期手術前，在肝組織終末門區(qū)中僅可觀察到少量的肝祖細胞；然而在二期手術前，每個區(qū)域的肝祖細胞數(shù)量增加了約3倍。國內學者還發(fā)現(xiàn)：ALPPS 術后產(chǎn)生IL-6、HGF等炎癥因子可激活肝內祖/干細胞，從而促進肝臟快速再生[36]。

3 肝硬化條件下ALPPS術后肝再生

肝硬化條件下ALPPS術后FLR再生速度明顯減緩。王征等[38]報道肝癌合并輕到中度乙型肝炎肝硬化患者ALPPS術后，F(xiàn)LR的增生速度較無肝硬化的肝臟組織明顯減慢，平均12 d增長58%，但ALPPS誘導的FLR體積增加和FLR再生率比PVE大得多[5]。在肝硬化大鼠模型中也證實了這一觀點，肝硬化大鼠ALPPS術后FLR再生速度明顯低于正常大鼠術后，PCNA、cyclin D1、Ki67等表達水平均顯著低于正常大鼠，Ki67峰值出現(xiàn)時間也晚于正常大鼠[39-40]，但ALPPS術后FLR再生速率顯著快于PVL、PVE術后。這些數(shù)據(jù)說明肝硬化肝臟ALPPS術后較正常肝臟再生機制啟動延遲，且FLR的肥大主要是由于肝細胞的體積增大所致而非再生[39，41]。目前，ALPPS促進肝癌合并肝硬化患者FLR再生機制的研究仍然較少，而我國是肝炎大國，原發(fā)性肝癌患者多數(shù)合并不同程度的肝硬化，進一步探索肝炎肝硬化背景下ALPPS促進肝再生研究有助于指導我國肝癌患者的臨床實踐。

4 小結

綜上所述，ALPPS誘導肝臟再生過程是一個多細胞、多因子參與的調控過程。不僅僅是肝實質細胞，HSC、Kupffer細胞、NK細胞等非實質細胞在ALPPS術后肝臟再生過程中也發(fā)揮著重要作用。筆者認為，未來應更加關注“非實質細胞-肝實質細胞”之間的相互作用在ALPPS誘導肝臟再生中的作用，進一步明確ALPPS在肝硬化患者中的應用價值，制訂符合我國國情的臨床實踐指南。

作者貢獻聲明：曾陶飛負責文獻的檢索與分析，撰寫論文；陳光磊參與檢索論文，修改論文；徐鋒、戴朝六、劉彩剛教授負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后修改定稿。