長鏈非編碼RNA對肝纖維化的調(diào)控作用

盧能源， 鐘芳菲， 鄧青梅， 楊研琪， 鄭 洋， 趙鐵建,b， 梁天堅

廣西中醫(yī)藥大學(xué) a. 賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院； b. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 南寧 530021

肝纖維化是機(jī)體對于膽汁淤積、病毒性肝炎、慢性酒精中毒等病因所致持久肝損傷而反饋出的一種自我修復(fù)反應(yīng)。其本質(zhì)是以膠原蛋白為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解減少，而合成相對增加，兩者失衡，從而導(dǎo)致過多的ECM積聚于肝臟內(nèi)，引發(fā)肝纖維化[1]。ECM主要由持續(xù)處于活化狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞(HSC)分泌[2]。肝纖維化發(fā)生時，眾多的致纖維化因素會不斷地刺激HSC，使其激活并轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，并大量分泌ECM、生長因子以及趨化轉(zhuǎn)化因子，且還使α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的水平顯著增多以作為HSC被激活的標(biāo)志[3]。近年來大量研究[4]顯示，長鏈非編碼RNA(lncRNA)可作為競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)與微RNA( microRNA，miRNA)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控下游的Wnt、Notch等多條信號通路來影響HSC的活化[5]，間接地調(diào)控肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。上述研究表明lncRNA有望作為標(biāo)志物和治療靶標(biāo)被用來診斷、治療肝纖維化。本文就lncRNA通過充當(dāng)ceRNA而對肝纖維化發(fā)揮調(diào)控作用的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 LncRNA概述

1.1 lncRNA的定義及特點 lncRNA是一種轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，多數(shù)于細(xì)胞核、細(xì)胞漿內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，約占lncRNA的80%。據(jù)報道[6]，絕大多數(shù)的lncRNA都來源于RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄，部分經(jīng)過剪接后具有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′端多聚腺嘌呤尾巴，結(jié)構(gòu)與編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(mRNA)類似。與mRNA不同的是，lncRNA具有較低的保守性和時空表達(dá)特異性。由于lncRNA沒有開放的閱讀框，所以其無法編碼蛋白質(zhì)，或者個別雖有開放閱讀框，但閱讀框很小，僅能編碼100個氨基酸以內(nèi)的小多肽[7]，如lncRNA LINC00961[8]。其實類似于這種包含小的開放閱讀框且能編碼功能性肽的暫時被假定為lncRNA的序列，可能歸類于編碼 RNA更合適[9]。由此看來，lncRNA的編碼能力遠(yuǎn)比之前想象的要繁瑣復(fù)雜，繼續(xù)深入研究以完善對其編碼能力這方面的認(rèn)知顯得十分重要。

1.2 lncRNA的分類 由于目前對lncRNA來源、功能等多方面的探索尚未完全，所以目前并無統(tǒng)一的lncRNA分類依據(jù)。Wang等[10]將lncRNA的眾多功能提煉為四種分子機(jī)制，即按照lncRNA的功能將其分為四種類型的分子，分別為信號型分子、誘餌型分子、指南型分子以及骨架型分子。Dhanoa等[11]指出，可根據(jù)編碼基因與lncRNA的相對位置和方向，將其初步分為：正義鏈lncRNA、反義鏈lncRNA、雙向lncRNA、內(nèi)含子lncRNA以及基因間長鏈非編RNA(long intergenic non-coding RNA，lincRNA)。Sanbonmatsu等[12]指出，未來可能會根據(jù)lncRNA的二級結(jié)構(gòu)將其直接分為三種類型，分別是具有子域和復(fù)雜結(jié)構(gòu)圖案的高度結(jié)構(gòu)化的RNA分子、具有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)而缺乏子域和復(fù)雜圖案的結(jié)構(gòu)松散的RNA分子、缺乏二級結(jié)構(gòu)而無子域無圖案的RNA分子。

1.3 lncRNA的生物學(xué)功能 lncRNA參與多種病理進(jìn)程和生物學(xué)功能，如惡性腫瘤、細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡[13]。lncRNA可以通過靶向轉(zhuǎn)錄因子、直接甲基化復(fù)合物、啟動染色質(zhì)重塑和阻斷附近基因的轉(zhuǎn)錄等形式來影響細(xì)胞活性及生物途徑[14-15]。在肝纖維化的發(fā)展階段，一些lncRNA通過充當(dāng)ceRNA與miRNA結(jié)合，發(fā)揮正性或負(fù)性調(diào)節(jié)肝纖維化的作用。

2 肝纖維化相關(guān)的lncRNA

據(jù)文獻(xiàn)[16]報道，一些熱門的lncRNAs，包括母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)、生長停滯特異轉(zhuǎn)錄因子5 (growth arrest-special transcript 5,GAS5)[17]、lincRNA-p21[18]，均在肝纖維化小鼠模型或肝纖維化患者肝組織或TGFβ1誘導(dǎo)的LX-2人HSC中表達(dá)減少，具有明確的抗肝纖維化作用。與此相反，肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis -associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)[19]、轉(zhuǎn)化生長因子β激活的lncRNA(lncRNA-activated by transforming growth factor beta,lncRNA-ATB)[20]、漿細(xì)胞瘤變型異位因子1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)[21]、同源盒轉(zhuǎn)錄反義RNA( homeobox transcript antisense RNA，HOTAIR)[22]、lncRNA-H19[23]和小核RNA宿主基因7(small nuclear RNA host gene 7, SNHG7)[24]于肝纖維化小鼠模型或肝纖維化患者肝組織或TGFβ1誘導(dǎo)的LX-2人HSC中表達(dá)增加，具有促肝纖維化作用。lncRNA與肝纖維化的相關(guān)性主要表現(xiàn)在其促肝纖維化或抗肝纖維化方面[25]。

2.1 具有抗肝纖維化作用的lncRNA

MEG3、GAS5以及l(fā)incRNA-p21皆已被證明具有抗肝纖維化作用。這些lncRNA具有相似的特性，如都可以充當(dāng)ceRNA與相關(guān)的miRNA結(jié)合，調(diào)控下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制HSC的增殖活化，減輕肝纖維化程度。由此看來，上調(diào)它們的表達(dá)水平有望用于逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

2.1.1 母系表達(dá)基因3(MEG3) MEG3定位于人14號染色體q32.3的DLK-DIO3印跡區(qū)域，長度約為1.6 kb，是一種母系表達(dá)的長鏈非編碼基因。He等[16]研究指出，MEG3可通過p53介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑來促使HSC LX-2發(fā)生凋亡。此外，MEG3可通過與SMO蛋白相互作用來抑制Hh介導(dǎo)的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程；亦可通過海綿化miRNA-212來抑制EMT過程，進(jìn)而阻止HSC的激活[26]。

2.1.2 生長停滯特異轉(zhuǎn)錄因子5(GAS5) lncRNA-GAS5定位于人染色體 1q25，長度約4087 bp，含有5′-TOP序列。GAS5可作為抑癌基因來抑制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展，如lncRNA-GAS5表達(dá)下調(diào)于膀胱癌[27]、腎細(xì)胞癌[28]等腫瘤中；其亦可作為致癌基因來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如GAS5表達(dá)上調(diào)于食管癌[29]等腫瘤中。Yu等[17]通過慢病毒載體調(diào)控GAS5過度表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GAS5可作為ceRNA與miRNA-222競爭性結(jié)合，使miRNA-222表達(dá)減少，細(xì)胞周期抑制劑p27的蛋白水平增加，進(jìn)而體外抑制HSC的增殖、激活。此外，Dong等[30]研究指出，lncRNA-GAS5還可通過充當(dāng)miRNA-23a的ceRNA并與之結(jié)合，抑制miRNA-23a對磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)的降解作用，阻礙PTEN下游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，蛋白激酶B(Akt)，雷帕霉素(mTOR)磷酸化，下調(diào)蝸牛哺乳動物靶標(biāo)(SNAIL)的表達(dá)水平，從而抑制PTEN/PI3K/Akt/mTOR/SNAIL途徑，減少α-SMA 和Ⅰ型膠原α1(collagen type I alpha 1，COL1α1)的合成，抑制HSC活化，阻止肝纖維化。提示GAS5/miRNA-222/p27和GAS5/miRNA-23a/PTEN/PI3K/Akt/mTOR/SNAIL途徑可為肝纖維化的逆轉(zhuǎn)提供治療靶點。

2.1.3 基因間長鏈非編RNA-p21(lincRNA-p21) lincRNA-p21最早是在小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)被鑒別出來的[31]，其定位在Cdkn1a(p21)基因上游約15 kb 處，屬17號染色體，長度約為3 kb。Zheng等[18]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)lincRNA-p21的表達(dá)水平能夠抑制體外HSC活化和減輕CCl4誘導(dǎo)小鼠的肝纖維化程度。而該過程的分子機(jī)制，可能為lincRNA-p21充當(dāng)ceRNA直接競爭性結(jié)合miRNA-181b，使miRNA-181b表達(dá)減弱，編碼磷酸酯酶的基因PTEN表達(dá)增加，從而使PI3K/Akt 信號通路的激活受抑制，HSC的活化受抑制[32]。提示lincRNA-p21為HSC的活化抑制因子，有望成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的分子靶點。

2.2 具有促肝纖維化作用的lncRNA

MALAT1、lncRNA-ATB、PVT1、HOTAIR、lncRNA-H19和SNHG7皆具有促肝纖維化作用。而這些lncRNA亦具有相似的特性，如它們都可以充當(dāng)ceRNA與相關(guān)的miRNA結(jié)合，調(diào)控下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)HSC的增殖活化，促進(jìn)肝纖維化。因此，下調(diào)它們在肝纖維化患者體內(nèi)的表達(dá)水平，可能是阻止肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展的良好舉措。

2.2.1 肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(MALAT1) MALAT1是一種核內(nèi)保守的基因間lncRNA，于細(xì)胞核中富集，位于人染色體11q13區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄本長度約為8000 nt。Yu等[19]研究證明，MALAT1可作為ceRNA與miR-101b競爭性結(jié)合，上調(diào)miRNA-101b靶標(biāo)RAC1的蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)HSC活化。Wu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1可與組蛋白去乙?；?SIRT1)結(jié)合，抑制SIRT1的表達(dá)，從而促進(jìn)LX-2人HSC活化以及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和COL1α1的合成，促進(jìn)肝纖維化。因此，靶向MALAT1/miRNA-101b/RAC1途徑和調(diào)控SIRT1過度表達(dá)可能會成為治療肝纖維化的新方案。

2.2.2 TGFβ激活的lncRNA(lncRNA-ATB) lncRNA-ATB是TGFβ信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，由TGFβ活化，定位于人第14號染色體，長度約為80 kb。據(jù)報道[20]，lncRNA-ATB可作為ceRNA競爭性結(jié)合miRNA-425-5p，促進(jìn)HSC的激活以及增加膠原的合成量，進(jìn)而加劇肝纖維化。此外，lncRNA-ATB還可通過與miRNA-200a競爭性結(jié)合，降低其表達(dá)，同時增加β-catenin的表達(dá)，從而促進(jìn)HSC的活化和增加Ⅰ型膠原的合成，加劇肝纖維化[34]。因此，將lncRNA-ATB視為一個新的促肝纖維化因子，并對其進(jìn)行敲低甚至敲除，以減少HSC的活化數(shù)量和抑制膠原蛋白的合成，不失為一個臨床治療肝纖維化的良好方案。

2.2.3 漿細(xì)胞瘤變型異位因子1(PVT1) PVT1的轉(zhuǎn)錄本長度約為1957 nt，是一種基因間lncRNA，由定位染色體8q24區(qū)上的PVT1基因編碼。PVT1是一個十分重要的癌癥lncRNA,其致癌作用已在多種癌組織中被證實，如肝細(xì)胞癌[35]、膽囊癌[36]和卵巢癌[37]。Zheng等[21]研究表明，操控PVT1基因沉默可在一定程度上抑制HSC的活化，其可能是由于PVT1基因的沉默使EMT過程受阻所致。而沉默PVT1基因，還會使Hh信號通路負(fù)向調(diào)節(jié)因子Patched1(PTCH1)的表達(dá)增強(qiáng)[38]，使Hh信號通路失活， HSC的增殖受抑制[21]。此外，PVT1可作為ceRNA與miRNA-152結(jié)合，減弱miRNA-152對小干擾PVT1的抑制，增強(qiáng)小干擾PVT1對Hh信號通路負(fù)調(diào)控因子PTCH1的脫甲基誘導(dǎo)，并表觀遺傳地下調(diào)PTCH1的表達(dá)水平，激活肝纖維化中的Hh信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)HSC的激活和EMT過程，加劇肝纖維化[21]。

2.2.4 同源盒轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR) HOTAIR是由HOXC基因片段轉(zhuǎn)錄而來的反義基因間lncRNA，定位于人12號染色體q13.13，轉(zhuǎn)錄本長度約為2158 bp，具有致癌作用[39-40]。Bian等[22]研究表明，上調(diào)HSC中HOTAIR的表達(dá)水平，可在一定程度上沉默MEG3，促進(jìn)HSC增殖活化，促進(jìn)肝纖維化；而沉默HOTAIR則作用相反。探究其分子機(jī)制，一方面可能為HOTAIR增加組蛋白修飾酶復(fù)合物PRC2在MEG3啟動子區(qū)域中的占有率，增強(qiáng)PRC2對組蛋白H3K27的三甲基化誘導(dǎo)，從而使MEG3低表達(dá)，促使HSC活化[22]。另一方面可能為HOTAIR充當(dāng)ceRNA與miRNA-148b競爭性結(jié)合，削弱miRNA-148b對其靶標(biāo)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表達(dá)的抑制作用，促進(jìn)DNMT1的表達(dá)，從而增強(qiáng)HSC中DNMT1對MEG3、p53表達(dá)的抑制作用，促進(jìn)HSC活化，增進(jìn)肝纖維化進(jìn)程[16]。提示HOTAIR參與了MEG3的表觀遺傳調(diào)控，有望作為治療肝纖維化的潛在靶點。

2.2.5 長鏈非編碼RNA-H19(lncRNA-H19) lncRNA-H19來源于人染色體11P15.5區(qū)域上的H19印跡基因，轉(zhuǎn)錄本長度約為2.3 kb，可調(diào)節(jié)DNA甲基化、染色質(zhì)重構(gòu)，也可作為miRNA前體對細(xì)胞內(nèi)的組蛋白進(jìn)行修飾，繼而多水平調(diào)控機(jī)體的功能。最近，有研究[23]顯示， lncRNA-H19可通過充當(dāng)ceRNA直接競爭性結(jié)合miRNA-148a，釋放miRNA-148a的靶標(biāo)泛素特異性蛋白酶4，使轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體(transforming growth factor-β receptor typeⅠ,TGFβRⅠ)泛素化水平上調(diào)，促進(jìn)TGFβRI與 TGFβ1結(jié)合，進(jìn)而激活HSC并促進(jìn)肝細(xì)胞EMT的發(fā)生，促進(jìn)肝纖維化。此外，在膽道閉鎖患者的纖維化肝組織中，lncRNA-H19的表達(dá)水平會隨著肝纖維化程度的加深而升高[41-42]。并且，lncRNA-H19可通過控制鞘氨醇1-磷酸受體2/鞘氨醇激酶2以及miRNA let-7/高遷移率蛋白A2途徑影響膽道閉鎖患者的膽管細(xì)胞增殖和肝損傷[41-42]。因此，lncRNA-H19有望成為肝纖維化的治療靶標(biāo)和診斷標(biāo)志物。

2.2.6 小核RNA宿主基因7(SNHG7) SNHG7是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，長度約為2157 nt，定位于9號染色體。據(jù)報道，SNHG7是一種典型的致癌基因，能促進(jìn)多種癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，如肺癌[43]、膀胱癌[44]和前列腺癌[45]等。Yu等[24]通過體內(nèi)和體外實驗證明， SNHG7可充當(dāng)ceRNA競爭性結(jié)合miRNA-378a-3p，減弱其對其靶標(biāo)紊亂片段極性蛋白2的抑制作用，加快Wnt信號通路的激活速度，并促進(jìn)HSC活化和肝纖維化。提示lncRNA-SNHG7可作為一種生物標(biāo)志物來診斷和判斷肝纖維化預(yù)后。

3 總結(jié)與展望

伴隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和進(jìn)步，大量的lncRNA被不斷地鑒定出來。雖然lncRNA無法編碼蛋白質(zhì)，但其可在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等層面參與調(diào)控細(xì)胞的活性和基因的表達(dá)，從而于各方面不同程度地參與肝纖維化、肝癌等疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，通過研究lncRNA在調(diào)控肝纖維化的信號通路上的異常表達(dá)，發(fā)現(xiàn)眾多的lncRNA可通過充當(dāng)ceRNA與 mRNA競爭性結(jié)合，直接調(diào)控mRNA靶基因等因子來調(diào)節(jié)HSC的活化程度和衰老速度，進(jìn)而調(diào)控肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。不難發(fā)現(xiàn)，這是一張巨大且相互交錯的基因網(wǎng)，為肝纖維化的病理進(jìn)程研究提供了廣闊的可探索空間。雖然到目前為止，學(xué)者們對lncRNA生物功能及分子機(jī)制的研究，特別是其在肝纖維化等疾病發(fā)病機(jī)制上的研究尚不完全。相信隨著科研技術(shù)的不斷進(jìn)步，將會逐漸發(fā)現(xiàn)lncRNA在肝纖維化中更多的調(diào)控機(jī)制和功能，為肝纖維化的程度鑒別，臨床治療及預(yù)后判斷等提供更新更堅實的理論基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)聲明：盧能源負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索，文章思路設(shè)計，論文撰寫與修訂；鐘芳菲、鄧青梅、楊妍琪負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索與資料分析；鄭洋、趙鐵建、梁天堅負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章及最后定稿。