齊墩果酸衍生物的合成及其與MEK靶點分子對接研究

張蓬勃， 宋艷玲

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA，圖1)是一種五環(huán)三萜類化合物，具有顯著的抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗血小板聚集等藥理活性[1-2].但齊墩果酸的水溶性非常差，生物利用度低，大劑量服用會造成膽囊水腫，限制了其臨床應(yīng)用[3].含氮化合物廣泛存在于自然界，許多有機含氮化合物具有顯著的生物活性.文獻報道三萜類化合物中引入氮原子能增加化合物的抗腫瘤活性，且含氮化合物與酸易生成鹽，溶解性明顯增加[4].席夫堿活性片段具有特殊的生理活性，多種含席夫堿的化合物具有抗腫瘤、抗菌和抑菌等藥用活性[5-6].本文通過將席夫堿活性片段引入至OA-3位，設(shè)計并合成化合物Ⅰ1～Ⅰ4，通過席夫堿還原進一步設(shè)計并合成化合物Ⅱ1～Ⅱ4，以期提高目標化合物的生物活性和生物利用度.

近年來計算機輔助藥物設(shè)計(computer aided drug design，CADD)在新藥研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用.分子對接研究是將配體分子放置于受體分子的活性位點，利用化合物與受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行對接，預測化合物的生物活性.ERK(extracellular regulated kinase)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的重要成員，其信號轉(zhuǎn)導通路(Ras-Raf-MEK-ERK)調(diào)控異常會導致多種癌細胞增生、擴散并轉(zhuǎn)移[7].MEK作為ERK途徑中的重要靶點，已成為抗腫瘤藥物的研究熱點.本文通過計算機輔助設(shè)計的方法研究OA衍生物與MEK分子對接，預測目標化合物抑制MEK的活性.

圖1 齊墩果酸的立體化學結(jié)構(gòu)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-600型核磁共振儀，美國Bruker公司；Büchi B-540熔點測定儀，瑞士Büchi公司；薄層色譜(GF-254)，柱色譜硅膠(200～300目)，青島海洋化工有限公司；齊墩果酸(質(zhì)量分數(shù)為98 %)，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；芳香醛類藥品，國藥集團化學試劑有限公司.其他溶劑和藥品均為分析純.

1.2 合成實驗

OA衍生物的合成路線見圖2.

試劑和反應(yīng)條件:(a) K2CO3，CH3I，DMF，室溫；(b) 瓊斯試劑，丙酮，異丙醇，0 ℃；(c) NH2OH·HCl，Py，50 ℃；(d) NaBH3CN，TiCl3，CH3COONH4，CH3OH，室溫；(e) 芳香醛，乙醇，80 ℃；(f) NaBH3CN，乙酸，室溫

1.2.1 齊墩果酸甲酯(1)的制備

將OA(5.00 g，10.94 mmol)和無水K2CO3(3.78 g，27.35 mmol)溶于50 mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌下緩慢加入碘甲烷(1.37 mL，21.89 mmol)，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)6 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機相.無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干溶劑，得白色固體.干燥過夜，甲醇重結(jié)晶得白色針狀晶體化合物14.40 g，產(chǎn)率85 %，m.p.196～198.8 ℃(文獻m.p.197～198.2 ℃)[8].

1.2.2 3-羰基-齊墩果酸甲酯(2)的制備

將齊墩果酸甲酯(1)(4.40 g，9.35 mmol)溶于100 mL丙酮中，冰浴下緩慢滴加Jones試劑(11.5 mL)，直至反應(yīng)液橘紅色不再消失，滴畢，室溫下反應(yīng)1～2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)完畢，加入130 mL異丙醇淬滅.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除部分溶劑，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機相.無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得淡黃綠色固體.干燥，甲醇重結(jié)晶得白色晶體化合物24.15 g，產(chǎn)率95 %，m.p.186～187 ℃(文獻m.p.185～186 ℃)[9].

1.2.3 3-羥肟基-齊墩果酸甲酯(3)的制備

將3-羰基-齊墩果酸甲酯(2)(4.15 g，8.87 mmol)溶于50 mL吡啶中，加入鹽酸羥胺(2.76 g，39.74 mmol)，50 ℃下反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后加入適量二氯甲烷稀釋，用質(zhì)量分數(shù)為10 %的鹽酸洗滌3次，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機相.無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物33.24 g，產(chǎn)率75.5 %，m.p.244～246 ℃(文獻m.p.247～249 ℃)[9].

1.2.4 3-氨基-齊墩果酸甲酯(4)的制備

將3-羥肟基-齊墩果酸甲酯(3)(4.88 g，10.10 mmol)溶于100 mL甲醇中，加入乙酸銨(9.04 g，117.30 mmol)，再加入NaBH3CN(7.08 g，112.70 mmol)，充分攪拌溶解，冰浴下緩慢滴加質(zhì)量分數(shù)為15 %的三氯化鈦溶液(29.33 mL，34.22 mmol)，室溫下反應(yīng)12 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后，蒸除部分溶劑，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至10，二氯甲烷萃取，蒸餾水洗滌，合并有機相.無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑為甲醇/二氯甲烷，得白色固體化合物43.78 g，產(chǎn)率80 %，m.p.221.3～223.7 ℃.ESI-MS，m/z:470.8[M+H]+；1H-NMR(600MHz，CDCl3)，δ:5.29(1H，s，H-12)，3.64(3H，s，28-COOCH3)，2.87(1H，d，J=13.6 Hz，H-18)，2.51(1H，d，J=9.7 Hz，H-2)，1.14(3H，s，CH3)，1.02(3H，s，CH3)，0.94(3H，s，CH3)，0.91(6H，s，2CH3)，0.81(3H，s，CH3)，0.74(3H，s，CH3).

1.2.5 化合物Ⅰ1～Ⅰ4的制備

1.2.5.1 化合物Ⅰ1的制備

將3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)溶于10 mL無水乙醇中，苯甲醛(0.041 g，0.384 mmol)溶于5 mL無水乙醇中，隨后將芳香醛乙醇溶液逐滴加入反應(yīng)體系中，80 ℃條件下回流反應(yīng)4～6 h.溶液變渾濁，有固體析出，抽濾，甲醇重結(jié)晶得白色固體產(chǎn)物化合物Ⅰ10.12 g，m.p.192～194 ℃，產(chǎn)率63 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ:8.26(s，1H)，7.74～7.72(m，2H)，7.41～7.37(m，3H)，5.31(s，1H)，3.63(s，3H)，1.16(s，3H)，1.01(s，3H)，0.98(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(s，3H)，0.78(s，3H)，0.76(s，3H).

1.2.5.2 化合物Ⅰ2的制備

實驗步驟同化合物Ⅰ1.3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)與鄰硝基苯甲醛(0.058 g，0.384 mmol)反應(yīng)，得到棕色固體產(chǎn)物化合物Ⅰ20.118 g，m.p.193～196 ℃，產(chǎn)率57 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：8.66(s，1H)，8.01～7.98(m，2H)，7.64(d，J=7.6 Hz，1H)，7.53(t，J=8.0 Hz，1H)，5.31(s，1H)，3.63(s，3H)，1.16(s，3H)，1.01(s，3H)，0.98(s，3H)，0.93(s，3H)，0.91(s，3H)，0.82(s，3H)，0.76(s，3H).

1.2.5.3 化合物Ⅰ3的制備

實驗步驟同化合物Ⅰ1.3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)與3，4-二氯苯甲醛(0.068 g，0.384 mmol)反應(yīng)，得到白色固體產(chǎn)物化合物Ⅰ30.116 g，m.p.192～195 ℃，產(chǎn)率53 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：8.17(s，1H)，7.83(d，J=1.9 Hz，1H)，7.54～7.52(m，1H)，7.46(d，J=8.3 Hz，1H)，5.31(s，1H)，3.63(s，3H)，1.16(s，3H)，1.00(s，3H)，0.96(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(s，3H)，0.76(s，6H).

1.2.5.4 化合物Ⅰ4的制備

實驗步驟同化合物Ⅰ1.3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)與3，5-二氯水楊醛(0.074 g，0.384 mmol)反應(yīng)，得到黃色固體產(chǎn)物化合物Ⅰ40.161 g，m.p.195～196 ℃，產(chǎn)率72 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：15.04(s，1H)，8.18(s，1H)，7.41(d，J=2.5 Hz，1H)，7.13(d，J=2.6 Hz，1H)，5.30(s，1H)，1.15(s，3H)，0.98(s，3H)，0.96(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(s，3H)，0.85(s，3H)，0.75(s，3H).

1.2.6 化合物Ⅱ1～Ⅱ4的制備

1.2.6.1 化合物Ⅱ1的制備

將3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)溶于10 mL無水乙醇中，將苯甲醛(0.041 g，0.384 mmol)用5 mL無水乙醇溶解后逐滴加到反應(yīng)瓶中，80 ℃條件下回流反應(yīng)4～6 h，冷卻至室溫后，加入NaBH3CN(0.06 g，0.96 mmol)，室溫條件下反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后加入5 mL冰醋酸進行淬滅，二氯甲烷萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相.無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓懸蒸，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯，得到白色固體產(chǎn)物化合物Ⅱ10.08 g，m.p.187～190 ℃，產(chǎn)率42 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：7.35(d，J=7.1 Hz，2H)，7.31(t，J=7.6 Hz，2H)，7.25～7.21(m，2H)，5.28(s，2H)，3.95(d，J=13.2 Hz，1H)，3.67(d，J=13.2 Hz，1H)，3.62(s，3H)，1.11(s，3H)，0.97(s，3H)，0.92(s，3H)，0.90(s，6H)，0.74(s，3H)，0.72(s，3H).

1.2.6.2 化合物Ⅱ2的制備

實驗步驟同化合物Ⅱ1.3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)與鄰硝基苯甲醛(0.058 g，0.384 mmol)反應(yīng)，得到棕色固體產(chǎn)物化合物Ⅱ20.083g，m.p.182～186 ℃，產(chǎn)率40 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：7.89(d，J=8.1 Hz，1H)，7.66(d，J=7.7 Hz，1H)，7.55(t，J=7.5 Hz，1H)，7.38(t，J=7.7 Hz，1H)，5.28(s，1H)，4.20(d，J=14.3 Hz，1H)，3.91(d，J=14.3 Hz，1H)，3.62(s，3H)，1.12(s，3H)，0.94(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(d，J=2.2 Hz，6H)，0.74(s，3H)，0.72(s，3H).

1.2.6.3 化合物Ⅱ3的制備

實驗步驟同化合物Ⅱ1.3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)與3，4-二氯苯甲醛(0.068 g，0.384 mmol)反應(yīng)，得到白色固體產(chǎn)物化合物Ⅱ30.076 g，m.p.185～186 ℃，產(chǎn)率35 %.1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ：7.61(s，1H)，7.54(d，J=8.2 Hz，1H)，7.34(d，J=8.2 Hz，1H)，5.18(s，1H)，3.84(d，J=14.3 Hz，1H)，3.61(d，J=14.5 Hz，1H)，3.54(s，3H)，1.07(s，3H)，0.91(s，3H)，0.87(d，J=2.7 Hz，6H)，0.85(s，3H)，0.69(s，3H)，0.65(s，3H).

1.2.6.4 化合物Ⅱ4的制備

實驗步驟同化合物Ⅱ1.3-氨基-齊墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)與3，5-二氯水楊醛(0.074g，0.384 mmol)反應(yīng)，得到黃色固體產(chǎn)物化合物Ⅱ40.10g，m.p.182～184 ℃，產(chǎn)率45 %.1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ：13.11(s，1H)，7.29(d，J=2.6 Hz，1H)，7.08(d，J=2.6 Hz，1H)，5.19(s，1H)，4.07(d，J=14.7 Hz，1H)，3.85(d，J=14.6 Hz，1H)，1.09(s，3H)，0.99(s，3H)，0.88(d，J=2.5 Hz，6H)，0.86(s，3H)，0.73(s，3H)，0.66(s，3H).

1.3 化合物與MEK的分子模擬對接

從蛋白數(shù)據(jù)庫(protein data bank，PDB)(http://www.rcsb.org/)中下載MEK靶蛋白結(jié)構(gòu)(PDB編號：4MX5).在ChemDraw中以structure選項下的convert name to structure功能分別畫出其結(jié)構(gòu)圖，并以MDL Molfile(*.mol)格式存儲，使用Discovery studio 4.0軟件導入上步建立的MDL Molfile(*.mol)格式文件，使用其convert功能，將MDL Molfile格式轉(zhuǎn)換成為sdf-MDL MOL format(*.mol2)格式文件.利用計算機輔助藥物設(shè)計軟件Molegro Virtual Docker(MVD 6.0)對各分子對接的結(jié)合能進行測試，用Discovery studio 4.0分析對接模式.

2 結(jié)果與討論

MVD軟件能夠通過函數(shù)打分的形式，預測并計算蛋白質(zhì)與小分子配體的相互作用，結(jié)果以結(jié)合自由能(Escore=Einter+Eintra，kJ/mol)形式表達，Einter表示配體-蛋白質(zhì)相互作用能量，Eintra表示配體內(nèi)部能量.結(jié)合能絕對值越大，表示結(jié)合親和力越強.分子對接的結(jié)合能結(jié)果見表1.

研究結(jié)果表明：化合物Ⅰ1～Ⅰ4和Ⅱ1～Ⅱ4與MEK靶蛋白(PDB編號：4MX5)的結(jié)合能均高于OA，且Ⅱ系列高于Ⅰ系列，表明席夫堿還原后的化合物與靶蛋白具有更高的結(jié)合能，其中化合物Ⅱ4的結(jié)合能高達-552.36 kJ/mol，超過MEK靶蛋白抑制劑曲美替尼的結(jié)合能-538.63 kJ/mol.曲美替尼是一種代表性的小分子MEK抑制劑[10]，現(xiàn)通過分子模擬對接方法研究其與MEK靶蛋白(PDB編號：4MX5)的相互作用(圖3).分子對接結(jié)果表明：曲美替尼可以和MEK蛋白氨基酸殘基形成多個牢固的氫鍵，與靶蛋白產(chǎn)生較大結(jié)合力.化合物Ⅱ4與靶蛋白的分子模擬對接結(jié)果表明：Ⅱ4能較好地插入到靶點的活性口袋中，其結(jié)構(gòu)中的酯基、芳香羥基通過氫鍵與靶蛋白氨基酸殘基(SER：176，GLU：177，ARG：258，VAL：81)緊密結(jié)合；還原席夫堿亞甲基片段、芳香取代基團通過碳氫鍵、疏水鍵、π—σ 鍵和π—alkyl鍵等與靶蛋白多個氨基酸殘基(CLU：177，SER：176，ARG：213，TYR：123，ILE：172)結(jié)合，如圖4所示.

圖4 化合物Ⅱ4與MEK靶蛋白(PDB編號：4MX5)分子對接模式

3 結(jié) 論

設(shè)計并合成了8個未見文獻報道的OA衍生物，通過分子對接的方法模擬目標化合物和MEK靶蛋白大分子相互作用.研究結(jié)果表明:化合物Ⅱ4可通過氫鍵與MEK靶蛋白多個氨基酸殘基(SER：176，GLU：177，ARG：258，VAL：81)結(jié)合，產(chǎn)生較高的結(jié)合能.可通過藥理活性實驗進一步研究其抑制MEK的活性.計算機輔助篩選方法可大大提高新藥研發(fā)的速度，降低新藥研發(fā)的成本，同時分子模擬對接模式的研究對藥物作用機制研究具有重要意義.