影響西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活時間的幾個因素分析

潘正軍 安 然 徐艷婷 肖 新 王 瓊 許芳方 杜逸東

(淮陰師范學院生命科學學院, 江蘇省特色水產(chǎn)繁育工程實驗室, 淮安 223300)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖育苗過程中, 鹵蟲的無節(jié)幼體是魚蝦的優(yōu)質開口餌料[1—3], 隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大, 對鹵蟲資源需求不斷增加, 導致鹵蟲卵的價格不斷攀升, 養(yǎng)殖成本也隨之上升[4]。雖然現(xiàn)在有干飼料作為開口餌料的開發(fā)使用, 但是干飼料適口性差, 且不運動的顆粒對魚蝦苗吸引力低, 不利于對飼料的利用和魚蝦苗的生長發(fā)育[5,6], 活餌料仍然是首選; 活餌料供應不足將導致幼魚蝦營養(yǎng)不良,降低生長率以及引起同類相食[4,7]。對于淡水養(yǎng)殖育苗來說, 如果投喂量過大導致短時間內鹵蟲無節(jié)幼體不能被攝取而死亡, 引起水質惡化和成本增加,因此投餌方案開發(fā)和了解鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活時間就很有必要[7,8]。以往的研究多集中于影響鹵蟲卵孵化率的條件, 極少探討影響無節(jié)幼體在淡水中存活時間的因素[9—11]。

我國西藏鹽湖眾多, 鹵蟲資源豐富, 具有很大的開發(fā)利用價值[12,13]。對西藏鹵蟲(Antemia tibetiana)的已有研究涉及生物學特征[14,15]、遺傳繁殖[16—18]、營養(yǎng)成分[19]和孵化條件[20—22]等, 但對影響其在淡水中存活時間的因素未見報道, 本文擬選擇不同鈉鹽、孵化鹽度、孵化液pH、不同淡水水溫等因素, 探討它們對西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活時間的影響, 為投餌方案開發(fā)、提高鹵蟲的利用率提供基礎性資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

西藏鹵蟲卵購于天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司(西藏大紅卵), 真空包裝冷凍保藏。

NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaNO3、Na2HPO4、NaOH和HCl(分析純, 上海國藥集團化學試劑有限公司)。

智能人工氣候箱(HP1000GS, 武漢瑞華儀器設備有限公司)、電子天平(賽多利斯, BSA224S)、電熱恒溫水浴鍋(HH-8, 上海精科實業(yè)有限公司)、精密pH計(PHS-3D, 上海三信儀表廠)、連續(xù)變倍體視顯微鏡(SZ780, 重慶奧特光學儀器有限公司)和電磁振動式空氣泵(YT-302C, 森森集團股份有限公司)。

1.2 實驗方法

冷凍保存的西藏鹵蟲卵取適量于4℃解凍24h,放入盛有預先曝氣的自來水的燒杯中攪拌, 以沉底的鹵蟲卵作為實驗對象。

為探討不同鈉鹽對西藏鹵蟲卵孵化率及在淡水中存活的影響, 分別用蒸餾水配制15‰的NaCl、Na2CO3、Na2SO4、NaNO3、Na2HPO4和NaH2PO4各250 mL(分別測定各溶液的pH), 置于500 mL的燒杯中, 每個燒杯中數(shù)200粒鹵蟲卵, 在人工氣候箱中2000 lx, 28℃充氣孵化24h[21,22], 計算孵化率。取孵化出的無節(jié)幼體各50只放進盛有200 mL曝氣的蒸餾水的燒杯中, 室溫下每隔1h計數(shù)死亡的無節(jié)幼體,并將死亡的無節(jié)幼體移出, 觀察直至全部無節(jié)幼體死亡。以前的研究結果表明15‰ NaCl孵化率最高[21],各組間比較以15‰NaCl組為標準(下同)。

用NaCl配制成8‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰和40‰不同濃度的孵化液, 按上述方法孵化, 取剛孵化的無節(jié)幼體各50只在室溫下統(tǒng)計其在淡水中的存活時間, 研究不同孵化鹽度對西藏鹵蟲在淡水中存活時間的影響。

配制NaCl為15‰的250 mL溶液8杯, 再利用0.1 mol/L的HCl及0.1 mol/L的NaOH母液分別調整各杯溶液的pH至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0, 每個燒杯中放200粒鹵蟲卵按前述條件進行孵化, 觀察孵化后的無節(jié)幼體在淡水中的存活情況, 以探討不同pH孵化液對西藏鹵蟲在淡水中存活時間的影響。

為分析不同水溫對西藏鹵蟲在淡水中存活時間的影響, 將在15‰NaCl中孵化的鹵蟲無節(jié)幼體各50只放進裝有250 mL曝氣清水的500 mL燒杯中,置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃的人工氣候箱中, 每隔1h計數(shù)存活的無節(jié)幼體, 并將死亡的無節(jié)幼體移出, 觀察直至全部無節(jié)幼體死亡。

除分析不同水溫對西藏鹵蟲在淡水中存活時間的影響外, 其他實驗均在室溫下進行。所有實驗重復3次, 并計算不同條件下各組無節(jié)幼體50%和100%的死亡時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結果用SPSS 16.0進行單因素方差分析, 對各因素進行獨立性t檢驗, 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同鈉鹽對西藏鹵蟲孵化率及在淡水中存活時間的影響

從表 1可以看出, 在Na2SO4溶液中西藏鹵蟲卵孵化率最高, 與NaCl孵化液相比達顯著水平(P<0.05); 在Na2CO3溶液中孵化率最低, 與NaCl孵化液的孵化率相比差異極顯著(P<0.01); 其他3組與之相比差異不顯著(P>0.05)。在NaH2PO4溶液中孵化的幼蟲能脫離卵殼, 但是附肢發(fā)育不全, 完全不能展開, 且一動不動, 無法進行后續(xù)實驗, 所以下面的存活率實驗只有5組。

表 1 西藏鹵蟲卵在不同鈉鹽條件下的孵化率Tab. 1 Hatching rates of Artemia in Tibet in different sodium salts

從表 2和表 3可以看出, 以NaCl組孵化出的無節(jié)幼體在淡水中存活時間最長, 50%存活時間達到13.32h, Na2SO4組孵化的無節(jié)幼體顯著低于NaCl中孵出的無節(jié)幼體存活時間 (P<0.05), 而以Na2CO3和NaNO3為孵化介質的無節(jié)幼體存活時間極顯著低于NaCl組 (P<0.01), 在Na2CO3中孵化的無節(jié)幼體死亡速度最快。同時可以發(fā)現(xiàn), 孵化率最高的Na2SO4組存活時間并不是最長, 顯示孵化率高低與存活時間并無相關性。

2.2 不同NaCl濃度對西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活時間的影響

從表 4可以看出, 孵化液NaCl濃度不僅影響西藏鹵蟲的孵化率[20,21], 對孵出的無節(jié)幼體在淡水中的存活時間也有重要影響, 隨著孵化NaCl濃度的增高, 無節(jié)幼體在淡水中的存活時間逐漸延長, 至35‰時達到最高, 但當孵化NaCl濃度達40‰時, 存活時間開始下降。從表 5可以看出8‰ NaCl孵化的無節(jié)幼體死亡最快, 50% 和100%死亡時間分別只要4.30h和12.00h, 與15‰ NaCl相比均顯著降低(P<0.001), 隨著NaCl濃度增高此二項時間逐漸增加, 至25‰ NaCl時顯著高于15‰組 (P<0.05)。以上結果說明較高的NaCl濃度孵化有利于西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活較長時間。

2.3 孵化液pH對西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活時間的影響

已有的資料表明孵化液pH影響鹵蟲的孵化率[22,23], 從表 6可以看出, 孵化液pH對無節(jié)幼體在淡水中的存活時間有明顯影響, 隨著孵化液pH從6.5—8.0逐漸升高, 存活時間逐漸延長, 至pH8.0時達到最高, 隨著孵化液pH繼續(xù)升高, 存活時間逐漸縮短, 到pH10.0時, 死亡速度最快。從表 7可以看出, 與pH8.0時相比, pH6.5、7.0和7.5 組存活時間都顯著低于pH8.0組; pH=8.0組顯著高于pH=9.0、9.5和10.0組存活時間(P<0.05), pH=10.0組50%存活時間已不到4h, 說明孵化液pH顯著影響西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中的存活時間。

2.4 水溫對西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活時間的影響

從表 8可以看出, 在5℃的淡水中, 鹵蟲生存時間最長, 相同時間內存活率最高, 說明低溫更適合鹵蟲的存活; 隨著水溫的逐漸升高, 鹵蟲的存活時間變短, 存活率隨之下降。從表 9可以發(fā)現(xiàn), 當水溫≥20℃時, 無節(jié)幼體死亡速度明顯加快, 與水溫15℃實驗組達到50%死亡率所需15.38h相比, 均差異顯著, 且所需時間越來越短, 到30℃實驗組時已不足2h。水溫低于15℃實驗組也顯示出隨溫度升高死亡率提高和死亡速度加快的趨勢, 100%死亡時間顯著長于15℃實驗組。實驗結果表明, 水溫顯著影響西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活的時間, 較低的水溫更有利于鹵蟲的存活。

表 2 不同鈉鹽孵出的無節(jié)幼體在淡水中的存活時間(以存活率計%)Tab. 2 Survival time of Artemia nauplii in freshwater hatched under different sodium salts (in terms of survival rate %)

表 3 不同鈉鹽孵出的無節(jié)幼體在淡水中50%和100%死亡時間(h)Tab. 3 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in freshwater hatched under different sodium salts (h)

表 4 不同NaCl濃度孵化的西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中的存活時間(以存活率計%)Tab. 4 Survival time of Artemia in Tibet nauplii in freshwater hatched at different salinities (in terms of survival rate %)

3 討論

鹵蟲俗稱“鹽蟲子”, 其發(fā)育、生長、繁殖均在含鹽分的水體中完成, 在長期進化過程中形成了廣泛的適應性和對不同鹽度的耐受性[11,24—26], 進入淡水后為維持正常的生理活動將耗費大量的能量調節(jié)滲透壓平衡, 必將影響其在淡水中的存活時間。在淡水養(yǎng)殖實踐中, 鹵蟲無節(jié)幼體作為餌料都是直接投喂于淡水中, 其投放量直接影響到苗種生長和存活率[27,28], 投喂量不足將降低生長率甚至引起同類相食[7], 投喂量過大則不僅導致成本上升也易造成水質惡化, 制定合理的投喂方案和確定投喂量使了解鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中的存活時間成為必不可少[4, 5, 29]。

影響鹵蟲孵化率的因素主要有溫度[10,21,30]、鹽度[11,25]、pH[26,31]和光照[9,32—34]等, 那么影響鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中存活時間的因素有哪些？影響程度如何？本文選取孵化鈉鹽的種類、鹽度、孵化液pH及淡水水溫進行了探討。

3.1 不同鈉鹽

一般生產(chǎn)上孵化液都是用食鹽(NaCl)或海水晶配制, 極少考慮不同鹽類對孵化率的影響。但是西藏鹽湖類型眾多, 主要有碳酸鹽、硫酸鹽、氯化物等不同類型, 不同的鹽湖水化學類型具有不同的專屬性, 具有南北分帶、東西分區(qū)的特點[12,35,36]。不同鹽湖中出產(chǎn)的鹵蟲可能已經(jīng)對不同鹽類產(chǎn)生了適應性, 本次的實驗結果也證實不同鈉鹽對孵化率產(chǎn)生顯著影響。在Na2SO4溶液中孵化率最高、Na2CO3中最低, 與NaCl實驗組相比均差異顯著, 這是否說明此批次西藏鹵蟲卵產(chǎn)地為硫酸鹽型湖泊？因購買的是商品卵, 產(chǎn)地不明, 如需了解鹽湖類型對孵化率的影響, 尚需進一步研究。不同鈉鹽種類影響西藏鹵蟲孵化率不僅與孵化液離子成分有關, 也與孵化液的pH高低有關, 至于NaH2PO4組孵出的幼蟲成堆聚集且不運動, 估計是受孵化液pH的影響, 因為NaH2PO4溶液顯酸性, 這在后續(xù)關于孵化液pH部分討論。

表 5 不同NaCl濃度孵出的無節(jié)幼體在淡水中50%和100%死亡時間(h)Tab. 5 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in freshwater hatched at different salinities (h)

表 6 不同pH孵化的西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中的存活時間(以存活率計%)Tab. 6 Survival time of Artemia in Tibet nauplii in freshwater hatched in different pH incubations (in terms of survival rate %)

表 7 不同pH孵化的西藏鹵蟲無節(jié)幼體在淡水中50%和100%死亡時間Tab. 7 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in freshwater hatched in different pH incubations

在淡水中的存活時間以NaCl實驗組最長, 考察50%存活率的時長, NaCl組>Na2SO4組> Na2HPO4組>NaNO3組>Na2CO3組, 說明孵化率高的實驗組存活率不一定高, 存活時間也不一定長, 二者之間并無關聯(lián)性。與NaCl組相比, 除Na2SO4組外, 均差異顯著, 說明不同鈉鹽不僅對孵化率有影響, 對在淡水中存活時間也有影響, 這種影響可能與進化適應有關, 也可能與在孵化時滲透調節(jié)耗能多少有關,因為盡管孵化液質量分數(shù)相同, 但各組的離子濃度與pH不同, 造成各實驗組胚胎孵化過程中耗能不同, 具體機制如何還需進一步研究[37]。

3.2 NaCl濃度

鹽度不僅影響鹵蟲的孵化率, 還對鹵蟲形態(tài)、生存、生長發(fā)育、成熟、生殖和壽命產(chǎn)生顯著影響[11,25,31]。不同NaCl濃度孵化的無節(jié)幼體在淡水中存活時間呈現(xiàn)隨鹽度逐漸升高而延長的趨勢, 到達一個頂峰后縮短(8‰組最低, 35‰組最高), 說明較高的孵化鹽度有利于無節(jié)幼體在淡水中的存活。原因在于較低的NaCl濃度孵化時胚胎消耗較多的能量用于滲透壓調節(jié), 在不投餌狀態(tài)下進入淡水會繼續(xù)消耗大量能量而快速死亡; 隨著NaCl濃度的升高逐漸接近于正常生活的水體, 孵化時耗能減少, 用于淡水水體滲透調節(jié)的能量相對較多, 存活時間延長[8,11]。但是孵化NaCl濃度過高也將引起胚胎發(fā)育耗能增高, 減少進入淡水時的能量儲備[11]。以前的研究表明在15‰NaCl濃度時西藏鹵蟲孵化率最高[21], 本次實驗發(fā)現(xiàn)該NaCl濃度下的50%存活時間達11h, 完全滿足其作為餌料被攝食的時間需求, 從生產(chǎn)成本與效益角度, 實踐中選擇15‰NaCl濃度孵化是合適的。

表 8 西藏鹵蟲無節(jié)幼體在不同水溫淡水中的存活時間(以存活率計%)Tab. 8 Nauplii survival time of Artemia in Tibet in different temperatures of freshwater (in terms of survival rate %)

表 9 西藏鹵蟲無節(jié)幼體在不同水溫淡水中50%和100%死亡時間Tab. 9 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in different temperatures of freshwater

3.3 孵化液pH

西藏鹽湖pH在8.11—9.14, 為弱堿性水體[36], 因此西藏鹵蟲適于在弱堿性條件下孵化, 以前的研究也證實了這一點[22], 體現(xiàn)了西藏鹵蟲生存和進化的適應。孵化液pH較低將導致鹵蟲卵進入休眠, 而堿性條件可以激活鹵蟲胚胎正常代謝并終止暫停的發(fā)育程序[37], 0.1mol/L NaH2PO4的pH約4.5—4.7, 這就解釋了鈉鹽實驗時該組孵出的幼體附肢發(fā)育不全, 不能展開且不動的原因。NaCl、NaNO3和Na2SO4孵化液的pH接近中性, 但是Na2SO4組孵化率顯著高于NaCl和NaNO3組, 說明影響孵化率的因素是陰離子的種類[38,39]。Na2HPO4組孵化液的pH=9.51,呈堿性, 孵化率與NaCl組接近, 說明堿性孵化液有利于西藏鹵蟲的孵化; 但是Na2CO3組的pH達到11.44, 已呈強堿性, 孵化率顯著降低, 這是因為孵化液pH影響孵化率與酶的活性有關, 如在pH 8—9孵化酶的活性最強[37]。

在淡水中, 無節(jié)幼體的存活時間隨孵化液pH升高而延長, pH8.0時間最長, 隨后開始縮短, 與各組相比均差異顯著。該趨勢及最長存活時間均與孵化率結果一致, 可能與機體代謝的酶活性有關, 也與孵化時滲透壓調節(jié)有關, 較低或較高的pH均會增加維持正常膜電位耗能, 減少在淡水中生活的能量儲備, 加快在淡水中死亡速度[11,37]。這一點在不同鈉鹽影響的實驗中也得到證實, Na2CO3組孵化的無節(jié)幼體在淡水中死亡速度最快, 是因為在5組孵化液中其pH最高, 孵化過程中能量消耗過多, 嚴重降低無節(jié)幼體在淡水中的存活時間。

3.4 水溫

淡水水溫顯著影響西藏鹵蟲無節(jié)幼體的存活時間, 溫度從低到高, 存活時間越來越短, 且死亡速度有越來越快的趨勢。本次試驗發(fā)現(xiàn)5℃淡水中50%死亡時間約需20h, 與15℃組相比差異顯著, 當水溫≥20℃時, 所有組別的存活時間與水溫15℃組差異顯著, 到30℃組50%死亡時間已不足2h, 說明溫度對無節(jié)幼體在淡水中存活時間的影響要強于上述其他因素。水溫從低到高會使水生動物卵黃消耗隨溫度升高而加快[40], 運動加強和游泳速度增加[41], 新陳代謝增強[10], 體內能量消耗增多, 這樣,在不投餌狀態(tài)下鹵蟲無節(jié)幼體隨水溫升高而死亡速度加快也就不難理解。建議在水溫較高的季節(jié)育苗時, 應減少每次投喂量而增加每天的投喂次數(shù)以減少浪費, 加大育苗池水質監(jiān)測力度及換水頻率,降低苗種死亡風險。

本次實驗均在不投餌狀態(tài)下完成, 與生產(chǎn)實踐中方法相同, 可以為魚蝦育苗時西藏鹵蟲無節(jié)幼體使用提供參考資料。