不同碳氮比對(duì)生物絮團(tuán)形成及對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)、抗氧化酶和消化酶的影響

金 毅 傅洪拓, 孫盛明 喬 慧 張文宜 金舒博 龔永生 蔣速飛 熊貽偉 錢(qián) 珺 張禹寧

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院, 無(wú)錫 214081; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無(wú)錫 214081)

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展, 環(huán)境安全問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重, 不合理的排放和藥物的濫用加劇了對(duì)環(huán)境的污染[1—2]。生物絮團(tuán)技術(shù)不僅能降低養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽等無(wú)機(jī)氮含量[3], 還能促進(jìn)養(yǎng)殖對(duì)象的生長(zhǎng)[4], 提高餌料利用率和存活率[5—6]。碳氮比是指養(yǎng)殖水體中有機(jī)碳源和各種含氮物質(zhì)質(zhì)量的比值, 是影響生物絮團(tuán)形成的重要因素。已有的研究表明, 水中的碳氮比達(dá)到15時(shí)就能產(chǎn)生絮團(tuán), 分泌胞外酶等活性物質(zhì), 促進(jìn)異養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)化吸收養(yǎng)殖水體中的無(wú)機(jī)氮[7—9]。目前, 生物絮團(tuán)技術(shù)已經(jīng)在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[10—11]、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[12]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[13]等蝦類(lèi)養(yǎng)殖中得到應(yīng)用, 但是生物絮團(tuán)技術(shù)在日本沼蝦中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

日本沼蝦(俗稱(chēng)青蝦)隸屬長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae), 沼蝦屬(Macrobrachium), 是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蝦類(lèi)之一, 因其肉質(zhì)鮮美, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。根據(jù)2018年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒顯示, 全國(guó)日本沼蝦年產(chǎn)量超過(guò)2.7×108kg[14]。鑒于碳氮比是生物絮團(tuán)形成的重要因素[15], 因此本研究以日本沼蝦為研究對(duì)象, 研究不同碳氮比對(duì)生物絮團(tuán)形成以及對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)、腸道消化酶和肝胰腺抗氧化酶活性的影響, 為日本沼蝦的健康養(yǎng)殖提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用蝦和飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用蝦取自大浦養(yǎng)殖基地(119°55′23″E,31°18′47″N)。先將日本沼蝦暫養(yǎng)在室內(nèi)的水缸中(30 cm×40 cm×100 cm, 120 L), 暫養(yǎng)1周穩(wěn)定后, 將初始體重為(0.25±0.03) g健康且規(guī)格一致的日本沼蝦放入水缸中, 每缸50尾。養(yǎng)殖周期50d, 每天投喂兩次(9:00和15:00), 日投喂量為體重的5%—8%。對(duì)照組每天換水1/3, 實(shí)驗(yàn)組實(shí)行封閉式零換水養(yǎng)殖, 因采集水樣和蒸發(fā)損失的水可以進(jìn)行補(bǔ)充。養(yǎng)殖期間水溫25—28℃, pH7.4—8.4, 溶氧大于6 mg/L。每天對(duì)日本沼蝦的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察和記錄。

1.2 碳源的選擇與添加

以葡萄糖為碳源[16], 實(shí)驗(yàn)組按照不同碳氮比10(C/N10組)、15(C/N15組)、20(C/N組)和25(C/N25組)添加碳源, 對(duì)照組不添加碳源, 每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)。按照Avnimelech[3]得出的生物絮團(tuán)技術(shù)所需碳源計(jì)算公式根據(jù)確定各處理組添加葡萄糖的量分別是投喂飼料量的1/3、1/2、2/3和5/6。每次投喂1h以后, 取葡萄糖用養(yǎng)殖水充分溶解, 然后均勻潑灑。

1.3 樣品收集與分析

樣品收集在養(yǎng)殖過(guò)程中, 每7d取1次水樣, 立即帶回實(shí)驗(yàn)室用于氨氮和亞硝酸鹽氮的測(cè)定; 在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 禁食24h后取樣, 計(jì)數(shù)并稱(chēng)重, 每個(gè)缸取5只日本沼蝦, 獲取完整的肝胰腺和腸道, 用液氮速凍后, 于–80℃冰箱保存。

酶活測(cè)定在肝胰腺和腸道解凍后, 稱(chēng)取組織重量, 在冰浴條件下, 使用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿, 按照1﹕9的比例把組織與生理鹽水混合制成濃度為10%的組織勻漿液, 溫度4℃, 轉(zhuǎn)速3000 r/min, 離心10min, 取出上清液用于相關(guān)酶活指標(biāo)的測(cè)定。淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、谷胱甘肽還過(guò)氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)的測(cè)定均使用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒, 酶活單位為酶量(U/mg)。

氨氮和亞硝酸氮的測(cè)定將水樣過(guò)濾后, 采用納氏試劑分光光度法測(cè)定水體中氨氮的濃度; 采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定水體中亞硝酸氮濃度。

生物絮團(tuán)測(cè)定采集水樣后均勻混合, 抽濾待測(cè)水樣, 濾膜烘干稱(chēng)重測(cè)定總固體懸浮物(TSS)。另取1 L混合好的水樣倒入英霍夫錐形瓶中直至刻度線(xiàn), 然后靜置30min, 待水樣中懸浮物完全沉淀后, 觀察沉淀物所在的刻度線(xiàn), 此即為單位水體中生物絮團(tuán)的體積[17], 記錄絮團(tuán)體積。取出含有生物絮團(tuán)的水樣在400倍顯微鏡下進(jìn)行觀察。

生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=(Wt–W0)/W0×100;

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate,SGR, %/d)=(LnWt–LnW0)/t×100。

存活率(Survival rate,SR, %)=Nt/N0×100

式中,Wt和W0分別表示日本沼蝦的終末平均重量和初始平均重量,t為養(yǎng)殖周期,N0和Nt分別表示日本沼蝦的終末存活尾數(shù)和初始放養(yǎng)尾數(shù), 重量單位為克(g)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和結(jié)果分析

各個(gè)指標(biāo)測(cè)出的數(shù)據(jù)用SPSS19.0進(jìn)行分析, 先進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA), 如差異顯著進(jìn)行Duncan多重比較,P<0.5表示差異顯著, 數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 不同碳氮比對(duì)各組氨氮和亞硝酸鹽氮含量的影響

各組的氨氮和亞硝酸鹽含量在前4周呈升高趨勢(shì), 在第4周達(dá)到高峰; 第4周以后對(duì)照組和C/N10組的氨氮和亞硝酸鹽含量持續(xù)升高而C/N15組、C/N20組和C/N25組呈下降趨勢(shì)(圖 1), 并逐漸保持穩(wěn)定。其中C/N20組的氨氮和亞硝酸鹽含量在各個(gè)時(shí)期都保持在最低水平。

2.2 不同碳氮比對(duì)各組生物絮團(tuán)形成的影響

在不同碳氮比條件下, 生成的生物絮團(tuán)含量不同。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)初期, 由于絮團(tuán)產(chǎn)生還不穩(wěn)定, 各組含量在第2周有略微下降; 第3周開(kāi)始, 生物絮團(tuán)產(chǎn)生的量明顯上升, 隨后的4周保持穩(wěn)定, C/N20組的生物絮團(tuán)含量最高(圖 2)。

通過(guò)肉眼觀察水體以及對(duì)比濾紙發(fā)現(xiàn), C/N20組的養(yǎng)殖水體呈棕褐色, 且顏色最深, C/N20組抽濾出的固體懸浮物最多(圖 3)。在400倍顯微鏡下觀察生物絮團(tuán)可發(fā)現(xiàn)絲狀菌、小席藻、輪蟲(chóng)、舟形藻、有機(jī)物和微囊藻等組成成分(圖 4)。

2.3 不同碳氮比對(duì)日本沼蝦幼蝦生長(zhǎng)性能的影響

與對(duì)照組相比, C/N20組各項(xiàng)指標(biāo)均是最高,C/N20組的末體重、增重率、特定生長(zhǎng)率、存活率分別提高75.29%、88.86%、42.26%和36.68%(P<0.05, 表 1)。

2.4 不同碳氮比對(duì)日本沼蝦肝胰腺抗氧化酶的影響

C/N20組的日本沼蝦GPX活性為(37.10±1.36) U/mg與對(duì)照組和C/N10組差異顯著 (P<0.05), 分別高出了43.19%和40.80%。C/N20組與C/N15組和C/N25組差異不顯著(P>0.05, 圖 5)。C/N20組SOD活性最高為(36.25±2.84) U/mg與對(duì)照組、C/N10、C/N15、C/N25組差異顯著, 分別高出了73.35%、45.26%、28.17%和17.83% (P<0.05)。

圖 2 各組生物絮團(tuán)體積(A)和總固體懸浮物(B)變化趨勢(shì)圖Fig. 2 The biofloc volume and total solid suspended matter in different groups

圖 3 顯微鏡下生物絮團(tuán)形態(tài)圖Fig. 3 Biofloc pattern under microscope (×400)

2.5 不同碳氮比對(duì)日本沼蝦幼蝦腸道消化酶的影響

C/N20組日本沼蝦的淀粉酶活力最高為(1.56±0.02) U/mg, 與對(duì)照組、C/N10組、C/N15和C/N25組, 均有顯著差異, 分別高了231.91%、239.13%、97.47%和132.84%(P<0.05, 圖 6)。各組的脂肪酶活力相比均有顯著差異, 其中C/N20組的脂肪酶活力最高, 比對(duì)照組、C/N10組、C/N15和C/N25組分別高了25.45%、50.47%、20.45%和1.90%(P<0.05)。C/N20組的胰蛋白酶活性最高, 分別比對(duì)照組、C/N10組、C/N15和C/N25組高了36.45%、20.77%、19.15%和9.49%(P<0.05)。

3 討論

3.1 不同碳氮比對(duì)生物絮團(tuán)形成和養(yǎng)殖水體的影響

生物絮團(tuán)的形成主要靠水體中異養(yǎng)微生物的快速繁殖, 而微生物的生長(zhǎng)繁殖最主要營(yíng)養(yǎng)元素是碳和氮; 因此在本研究中, 按照不同碳氮比添加葡萄糖來(lái)培養(yǎng)生物絮團(tuán)。由圖 2可知, 在C/N 20組中,養(yǎng)殖水體顏色呈棕褐色, 生物絮團(tuán)形成的效果最好,生物絮團(tuán)體積和總固體懸浮物均高于其他處理組。有研究表明, 碳氮比不同, 生物絮團(tuán)產(chǎn)生的時(shí)間、效果和作用機(jī)制也不一樣, 因此維持適宜的碳氮比對(duì)生物絮團(tuán)的產(chǎn)生至關(guān)重要。生物絮團(tuán)可有效調(diào)節(jié)水質(zhì), 降低水體中三氮水平[18], 在實(shí)際生產(chǎn)中, 對(duì)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物造成傷害的主要是氨氮和亞硝酸鹽, 在本研究中, C/N 15組和C/N 20組的氨氮和亞硝酸氮濃度顯著低于對(duì)照組和其他處理組。鄧吉朋等[13]的研究發(fā)現(xiàn)適宜的碳氮比能保證良好的水質(zhì), 但不同的是, 碳氮比越高水質(zhì)越好。這與本研究中C/N 25組的結(jié)果有差異, 原因可能是物種和養(yǎng)殖過(guò)程上不同。

3.2 不同碳氮比形成的生物絮團(tuán)對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)的影響

圖 4 各組生物絮團(tuán)總固體懸浮物Fig. 4 TSS of different groups

表 1 不同碳氮比對(duì)日本沼蝦幼蝦生長(zhǎng)性能的影響Tab. 1 Effects of different carbon: nitrogen ratio on growth performance of Macrobrachium nipponense

圖 5 不同碳氮比對(duì)日本沼蝦幼蝦肝胰腺GPX(A)、SOD(B)的影響Fig. 5 Effects of different C/N ratio on activity of antioxidant enzymes in hepatopancreas of Macrobrachium nipponense

生物絮團(tuán)是一種富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的絮狀物,其中含有35%—50%的粗蛋白和2.5%—9%的粗脂肪, 能量達(dá)到18—22 kJ/g[19], 能夠作為蝦類(lèi)的潛在餌料。圖 1證明了生物絮團(tuán)含有多種組成成分, 包括輪蟲(chóng)和原生動(dòng)物等, 其營(yíng)養(yǎng)成分保證了日本沼蝦的生長(zhǎng)。劉杜鵑等[12]在羅氏沼蝦(M. rosenbergii)育苗的實(shí)驗(yàn)中, 證明了向養(yǎng)殖水體中添加碳源, 提高碳氮比有利于羅氏沼蝦仔蝦的生長(zhǎng), 提高出苗率。李京昊等[20]應(yīng)用生物絮團(tuán)技術(shù)養(yǎng)殖克氏原螯蝦(Procambarus clarkii), 碳氮比維持在15以上時(shí),在減少投喂的情況下, 實(shí)驗(yàn)組克氏原螯蝦的生長(zhǎng)并沒(méi)有受到影響, 而在本研究中, 碳氮比的升高對(duì)日本沼蝦的生長(zhǎng)有顯著影響, 在碳氮比20時(shí), 生物絮團(tuán)含量最多且該組的日本沼蝦的生長(zhǎng)性能明顯高于其余各組。這表明生物絮團(tuán)對(duì)日本沼蝦的生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)楫a(chǎn)生的生物絮團(tuán)含有的營(yíng)養(yǎng)成分更易被日本沼蝦消化吸收, 也有可能生物絮團(tuán)中存在某些具有促進(jìn)生長(zhǎng)的活性物質(zhì)[21]。

3.3 不同碳氮比形成的生物絮團(tuán)對(duì)日本沼蝦抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)在預(yù)防生物損傷, 減少自由基方面具有重要作用[22—23], 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶, 是評(píng)價(jià)抗過(guò)氧化能力的重要指標(biāo)之一。在本研究中C/N20組日本沼蝦的SOD顯著高于其他組(P<0.5)。這表明該組的日本沼蝦有更強(qiáng)的抗自由基能力, 保證了日本沼蝦的健康生長(zhǎng)。這與生物絮團(tuán)在克氏原螯蝦中的研究結(jié)果相似[20]。在本研究中, 從C/N15組開(kāi)始, GPX有顯著提高; 這與凡納濱對(duì)蝦(L. vannamei)的研究結(jié)果相似[24]; 但區(qū)別在于,凡納濱對(duì)蝦(L. vannamei)的GPX在碳氮比15時(shí)活性最高, 而日本沼蝦的GPX在碳氮比20時(shí)活性最高,這或許是物種之間的差異造成的。也有報(bào)道認(rèn)為,不僅是生物絮團(tuán)中的微生物刺激了免疫機(jī)能的提升, 還有某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提高了機(jī)體的抗氧化水平,而碳氮比的高低影響了生物絮團(tuán)的形成和其營(yíng)養(yǎng)成分, 因此維持適宜的碳氮比對(duì)于提升養(yǎng)殖對(duì)象的抗氧化水平十分重要。在本研究中, 相比對(duì)照組,C/N20組的日本沼蝦SOD和GPX的顯著提高, 其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.4 不同碳氮比形成的生物絮團(tuán)對(duì)日本沼蝦消化酶活性的影響

圖 6 不同碳氮比對(duì)日本沼蝦幼蝦腸道淀粉酶(A)、脂肪酶(B)、胰蛋白酶(C)的影響Fig. 6 Effects of different C/N ratio on intestinal digestive enzyme activities of Macrobrachium nipponense

生物絮團(tuán)能夠提升水生動(dòng)物的消化能力。淀粉酶能水解糖原和淀粉, 有利于養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)糖類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在本研究中, C/N20組的淀粉酶活性顯著高于其他組。這與Wang等[25]的研究結(jié)果相似。但葛海倫等[26]在羅氏沼蝦的研究中發(fā)現(xiàn), 生物絮團(tuán)并沒(méi)有提升羅氏沼蝦腸道淀粉酶的活性?？赡苁且?yàn)榕囵B(yǎng)生物絮團(tuán)的碳源不一樣, 導(dǎo)致絮團(tuán)組成成分有所差異, 其發(fā)揮的作用也略有差別。脂肪酶能將甘油三脂水解, 促進(jìn)腸道的吸收。在本研究中, C/N20組的脂肪酶顯著高于其他組, 證明了碳氮比20時(shí), 生物絮團(tuán)能夠顯著提高日本沼蝦腸道中的脂肪酶活性。徐武杰[24]的研究表明, 生物絮團(tuán)顯著了提高了凡納濱對(duì)蝦(L. vannamei)的脂肪酶活性,促進(jìn)了凡納濱對(duì)蝦對(duì)脂肪的消化吸收。在克氏原螯蝦[20]和羅氏沼蝦[26]的研究中, 均證明了生物絮團(tuán)能顯著提升脂肪酶活性。胰蛋白酶是一種蛋白水解酶, 是評(píng)價(jià)蝦類(lèi)生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)之一。在本研究中C/N20組的胰蛋白酶活性顯著升高, 這與凡納濱對(duì)蝦[24]、羅氏沼蝦[26]和克氏原螯蝦[20]的研究結(jié)果一致。

觀察發(fā)現(xiàn), 日本沼蝦有攝食生物絮團(tuán)的現(xiàn)象,而已有的研究表明生物絮團(tuán)確實(shí)含有淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶等消化酶[27,28], 故推測(cè)日本沼蝦通過(guò)攝食生物絮團(tuán)增加了腸道內(nèi)的消化酶含量。消化酶含量的提高意味著機(jī)體消化能力和代謝水平的提高[29], 這有利于日本沼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育。然而,在碳氮比較低時(shí)產(chǎn)生的生物絮團(tuán)較少, 甚至沒(méi)有生物絮團(tuán)產(chǎn)生, 所以日本沼蝦無(wú)法攝食足夠的絮團(tuán)提升消化水平。結(jié)合生物絮團(tuán)形成規(guī)律并根據(jù)圖 2比較各組水體顏色和固體懸浮物含量并可知, C/N20組的生物絮團(tuán)含量最多, 這與各組消化酶活性的變化規(guī)律以及日本沼蝦的生長(zhǎng)規(guī)律相一致。因此, 適宜的碳氮比是形成絮團(tuán)的重要條件, 也是促進(jìn)日本沼蝦生長(zhǎng)和提高消化酶活性的重要因素。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明, 在日本沼蝦養(yǎng)殖過(guò)程中, 維持碳氮比20可有效形成生物絮團(tuán), 降低水體氨氮和亞硝酸鹽濃度, 提高日本沼蝦的生長(zhǎng)指標(biāo)、抗氧酶和消化酶活性。